Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

MeRIP-qPCR анализ для обнаружения уровней модификацииm6A специфических РНК в клетках остеосаркомы

861 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69880

⸱

30 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол предоставляет подробный подход к оценке уровней модификации m6A специфической РНК с помощью MeRIP-qPCR.

Аннотация

Эпитранскриптомическая модификация РНК играет ключевую роль в инициации и развитии различных видов рака, среди которых наиболее распространённой и функциональноразнообразной является N6-метиладенозин (m 6 A). Здесь мы представляем упрощённый и воспроизводимый протокол с использованием MeRIP-qPCR для оценки уровней модификацииm6A специфических транскриптов в клетках остеосаркомы. В этом анализе была извлечена общая РНК, после чего проводилась инкубация специфическим антителоманти-m 6A для иммунозахвата РНК модификации m6A. Затем РНК фрагментировались, и обогащениеm6-модифицированных РНК фрагментов с помощью магнитных шариков белка G. Обогащённая РНК выделялась с помощью переваривания протеиназы K и очищалась с помощью РНК-связывающих шариков. Наконец, РНК подвергалась обратной транскрипции и количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для оценки уровнейm 6A в кандидатных генах. Результаты показали, что этот метод эффективно различает различия в метилировании и служит надёжным инструментом для изучения функциональных механизмов модификацииm6A в клетках остеосаркомы. В заключение, MeRIP-qPCR предлагает простой и очень специфический подход к изучению модификацииm6A в клетках остеосаркомы. Этот протокол обладает большим потенциалом для выявления регуляторных сетейM6A и выявления новых терапевтических целей.

Введение

Последние исследования эпитранскриптома показывают, что модификация РНКN6-метиладенозина (m 6 A), метилирование позицииN 6 на аденозине, является самой распространённой известной внутренней химической модификацией мРНК в эукариотическихклетках 1. m6A участвует в широком спектре биологических процессов, включая стабильность мРНК, сплайсинг, ядерный экспорт и эффективностьтрансляции 2. Важно, что накопленные данные свидетельствуют о том, что нарушение регуляции модификацииM6A способствует возникновению и развитию различных видов рака, включая остеосаркому — крайне агрессивную злокачественную опухоль костей, преимущественно поражающую подростков и молодыхвзрослых 3.

Изучение модификации m6A требует надёжных и надёжных методологий. Разработано несколько подходов для обнаружения уровней модификации m6A, включая m6A dot blot, m6A ELISA и MeRIP-seq. Точечный анализ m6A прост и экономичен, но страдает от ограниченной чувствительности и плохой количественной оценки. Он обеспечивает уровень модификации общей РНК m6A, в отличие от уровня модификации m6A, как у конкретнойРНК 4. m6A ELISA обеспечивает относительно удобное и высокопроизводительное обнаружение; Однако перекрёстная реактивность и низкая точность остаются серьёзными проблемами, и он также не способен выявлять транскриптно-специфичные или специфическиемодификации 5. MeRIP-seq позволяет транскриптомного отображенияm 6A; однако требования к большому входу РНК, относительно низкому разрешению и зависимости от антител ограничивают точность и воспроизводимостьMeRIP-seq 6. В отличие от этого, MeRIP-qPCR сочетает иммунопреципитацию с количественным ПЦР, обеспечивая более высокую чувствительность и специфичность для целенаправленного обнаруженияm6Aна специфическойРНК-7. Этот метод позволяет чувствительно и целенаправленно обнаруживать дифференциальное обогащение m6A в кандидатных генах, что делает его особенно подходящим для валидационных исследований в исследованиях рака, связанных с m6A. Этот метод предлагает экономичную и доступную альтернативу для лабораторий, стремящихся исследовать регуляторные механизмы, опосредованные m6A.

Здесь мы предоставили подробный протокол (рисунок 1) для оценки уровней модификацииm6A c-Myc в клетках остеосаркомы, используя MeRIP-qPCR в качестве примера. MeRIP-qPCR, основанная на обогащении фрагментов метилированной РНК на основе антител, а также в сочетании с обратной транскрипцией и количественной ПЦР, оценивает наличие и относительную концентрациюm6Aна специфической РНК. Мы показали, что этот подход эффективно различает различия в метилировании c-Myc и предоставляет надёжную платформу для изучения функциональной роли m6A в клетках остеосаркомы. Это исследование подчеркивает потенциал MeRIP-qPCR как практического и специфического инструмента для исследований модификацииm6A при остеосаркоме и создаёт основу для выявления новых терапевтических целей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция РНК проводится с помощью набора для экстракции РНК. Работайте в чистом шкафу для биобезопасности при работе с клетками и реагентами РНК. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки, защитные очки). Перед началом заранее охладите центрифугу до 4 °C.

  1. Подготовьте камеры.
    1. Снимите посевную среду из чашки длиной 3,5 см и аккуратно промыйте клетки заранее охлаждённым PBS. Добавьте соответствующий объём буфера лизиса РНК непосредственно в тарелку, чтобы полностью лизировать клетки, и аккуратно пипетить для гомогенизации.
    2. Перенесите суспензию клетки в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
    3. Центрифуга при 1000 × г в течение 5 минут при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ротор сбалансирован, а крышка надёжно закрыта.
    4. Аккуратно вынимите микроцентрифугную трубку после центрифугирования.
    5. Полностью аспирируйте супернатант с помощью пипетки объёмом 1 мл, не напрягая гранулу внизу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не трогайте ячеточную гранулу кончиком пипетки.
  2. Лизные клетки.
    1. Добавьте 300 мкл буфера лизиса в клеточную гранулу.
    2. Тщательно перемешайте, перевернув трубку 30 раз, пока раствор не станет прозрачным и вязким, без видимых комков.
    3. Инкубировать трубку при комнатной температуре в течение 2 минут.
  3. Осадка РНК.
    1. Добавьте 300 мкл 100% этанола в лизат (равный объём буфера лизис).
    2. Аккуратно поднимайте и опускайте пипетку сразу (примерно 8-10 раз), чтобы полностью перемешать.
  4. Выполните связывание колонок РНК.
    1. Поместите колонку для очистки РНК в предоставленную трубку для сбора объёмом 2 мл.
    2. Переложите всю смесь в колонну очистки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прикасаться к белой мембране в центре.
    3. Закройте крышку и установите центрифугу при 12 000 × г на 1 минуту.
    4. Сбросьте нижнюю жидкость и аккуратно постучите по трубке вверх ногами по впитывающей бумаге, чтобы удалить остаточную жидкость.
    5. Верните колонку очистки в сборную трубку.
  5. Стирайте примеси.
    1. Добавьте 500 мкл буфера для промывания (воды без нуклеаз) в колонку очистки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прикасаться к белой мембране в центре.
    2. Центрифугуйте при 12 000 × г на 1 минуту и сбросьте нижнюю жидкость.
    3. Снова центрифугуйте при 12 000 × г в течение 1 минуты, чтобы удалить остаточную жидкость.
    4. Перенесите колонку очистки в чистую микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
    5. Откройте крышку и дайте колонке постоять 2 минуты при комнатной температуре.
  6. Элютная РНК.
    1. Вставьте колонку очистки в новую микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
    2. Добавьте 25 мкл буфера элюции непосредственно в центр мембраны.
    3. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
    4. Центрифуга при 12 000 × г в течение 1 минуты для сбора РНК в нижней трубке.
    5. Нанесите элюат на мембрану и снова центрифугуйте при 12 000 × г в течение 1 минуты, чтобы максимизировать выход.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда добавляйте буфер элюции непосредственно к центру мембраны столба. Избегайте добавления её в боковую стенку, так как это может предотвратить растворение РНК и значительно снизить выход. Также не проколывайте мембрану кончиком пипетки.
  7. Измерьте концентрацию РНК.
    1. Прополосните отверстие спектрофотометра с помощью 1,5 мкл буфера для эллюй.
    2. Используйте 1,5 мкл буфера элюции в качестве пустоты. Убедитесь, что показатели близки к нулю.
    3. Загрузите 1,5 мкл образца РНК и измерите концентрацию.
    4. Оценить качество образцов РНК с помощью спектрофотометра (A260/A280 = 1,8-2,2, A260/A230 = 2,0-2,5) и электрофореза агарозного геля.

2. Метилированная РНК-иммунопреципитация (MeRIP)

  1. Подготовка иммунозахватной смеси
    1. Получите новую ПЦР-трубку объемом 0,2 мл.
    2. Добавьте компоненты, как указано в Таблице 1 (пример для одной реакции).
  2. Иммунозахват
    1. Плотно закройте крышку трубки. Поставьте ПЦР-трубку на вращательный или подвижный шейкер.
    2. Инкубировать при комнатной температуре в течение 90 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что раствор смешивается непрерывно и аккуратно.
  3. Расщепление РНК
    1. После инкубации добавьте в каждую пробирку 10 мкл усилителя ядерного пищеварения (NDE) и 2 мкл смеси ферментов расщепления (CEM).
    2. Аккуратно перемешивайте, поднимая и опуская 5–6 раз.
    3. Инкубировать при комнатной температуре в течение 4 минут.
    4. Подготовка управления входной РНК
      1. Для обеспечения согласованности между иммунопреципитационными (IP) и входными образцами обрабатывайте часть РНК параллельно в качестве входного контроля.
      2. Перенесите 1 мкг общей РНК (10% входа) из каждого образца в отдельную ПЦР-пробирку. Добавьте 20 мкл буфера для захвата иммунитета (ICB), 1,5 мкл NDE, 1 мкл CEM и инкубировать при комнатной температуре в течение 2 минут.
  4. Магнитное обогащение и промывка
    1. Поставьте ПЦР-трубку на магнитную подставку.
    2. Дайте трубке постоять 2 минуты, пока раствор не станет прозрачным, и шарики не зафиксируются на стенке трубки.
    3. Аккуратно вдыхайте и отбрасывайте наверх, не напрягая бусины.
    4. Держите трубку на магнитной подставке и добавьте 150 мкл буфера для стирки (WB).
    5. Снимите трубку с магнитной подставки и аккуратно наклоните её вверх ногами, чтобы полностью подвесить шарики.
    6. Верните трубку на магнитную подставку. Подождите 1-2 минуты, пока раствор не пройдёт, затем сбросьте супернатант.
    7. Повторите этап стирки три раза.
    8. Промой бусины ещё раз с помощью 150 мкл буфера для пищеварения белка (PDB) тем же способом.
  5. Высвобождение и восстановление обогащённой РНК
    1. Приготовьте рабочий раствор для переваривания белка, смешивая протеиназу K и PDB в соотношении 1:9. (Для каждой реакции подготовьте 20 мкл: 2 мкл протеиназы K + 18 мкл PDB).
    2. После финальной стирки снимите трубку с магнитной стойки.
    3. Добавьте 20 мкл свежеприготовленного раствора для белкового переваривания в гранулу и аккуратно перемешайте.
    4. Поместите ПЦР-трубку в термический циклер и инкубуйте при 55 °C в течение 15 минут.
    5. Поставьте ПЦР-трубку обратно на магнитную подставку. Дождитесь, пока раствор прояснётся (примерно 2 минуты).
    6. Аккуратно перенесите весь супернатант (около 20 мкл) в новую ПЦР-трубку объемом 0,2 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: РНК сейчас находится в супернатанте. Выбросьте бусины.
  6. Очистка РНК
    1. Добавьте 20 мкл раствора для очистки РНК (RPS) в каждую пробирку, отрицательную контрольную трубку и входную трубку.
    2. Добавьте 160 мкл 100% этанола.
    3. Вихревые РНК-связывающие шарики для повторного суспензия.
    4. В каждую трубку добавьте 2 мкл ресуспензированных РНК-связывающих шариков.
    5. Тщательно перемешайте вверх и вниз как минимум 10 раз.
    6. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы обеспечить связывание РНК.
    7. Поставьте трубку на магнитную подставку. Дождитесь, пока раствор прояснётся (примерно 2 минуты).
    8. Аккуратно выбросьте супернатант, не трогая бусины.
    9. Держите трубку на магнитной подставке и добавьте 150 мкл свежеприготовленного 90% этанола. Инкубировать 30 секунд.
    10. Отбросьте 90% этанола. Повторите промывку с 90% этанолом ещё раз (всего два раза).
    11. Снимите трубку с магнитной подставки.
    12. Добавьте 13 мкл буфера для эллюции к высушенным бусинам.
    13. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы элютировать РНК.
    14. Поставьте трубку обратно на магнитную подставку. Дождитесь, пока раствор прояснётся (примерно 2 минуты).
    15. Аккуратно перенесите весь супернатант (около 13 мкл) в новую ПЦР-трубку без РНаз.
    16. Используйте немедленно или храните РНК при -20 °C.

3. RT-qPCR

  1. Обратная транскрибация обогащённойm6A-РНК в кДНК
    1. Используйте очищенную РНК изm6A-IP, входной или IgG-группы для обратной транскрипции.
    2. Настройте реакцию обратной транскрипции (RT).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить равномерный вход РНК для всех групп, чтобы обеспечить надежное сравнение в дальнейшем qPCR-анализе.
  2. Усиление qPCR
    1. Подготовьте qPCR-реакции с использованием химии SYBR Green. Добавьте 10 мкл SYBR Green Master Mix (2×), 0,5 мкл прямого грунта (10 мкм), 0,5 мкл обратного праймера (10 мкм), 7 мклddH 2O и 2 мкл кДНК в каждую трубку, тщательно перемешайте и кратковременно центрифугуйте перед загрузкой в прибор qPCR.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца кДНК установите три дублера (вход, IgG,m 6A-IP). См. таблицу 2 для списка основ.
    2. Запустите программу qPCR.
      1. Выполните реакции qPCR на тепловом циклере реального времени с помощью следующей программы: установите начальную денатурацию на 95 °C на 30 секунд; Выполнять 40 циклов, включающих денатурацию при 95 °C в течение 15 с, отжиг при 58 °C 10 с и удлинение при 72 °C в течение 30 с.
      2. После усиления проведите анализ кривой расплава, установив денатурацию на 95 °C в течение 15 секунд, охлаждение при 60 °C в течение 1 минуты, а затем постепенное повышение температуры до 95 °C при скорости 0,5 °C/s с непрерывным накоплением флуоресценции для подтверждения специфичности амплифицированных продуктов.
  3. Анализ данных
    1. Анализируйте значения Ct целевой и контрольной групп.
    2. Рассчитайте обогащение с помощью одного из следующих методов:
      1. Методы 1: % Метод ввода
        %Input = 2[Ct(Input)−Ct(IP)] × DF × 100%
        ПРИМЕЧАНИЕ: Ct (Input) и Ct (IP) представляют значения порога цикла для входных и IP образцов соответственно, а коэффициент разбавления (DF) — это обратный коэффициент входной доли, используемой для qPCR (например, если 10% всей РНК использовалось как вход, то DF = 10).
      2. Методы 2: Сравнительный метод CT (метод 2^-ΔΔCt )
        ΔCt sample=CtIP−CtIgG
        Ct=ΔCt обработан−ΔCt контроль, Fold=2−ΔΔCt.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте единообразные количества входных РНК, настройки реакции и эффективность праймера во всех образцах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь мы приводим репрезентативный результат анализа MeRIP-qPCR — уровень модификацииm6A c-Myc в клетках hFOB1.19 и 143B. Как показано на рисунке 2, обогащение c-Myc антителамик 6A было значительно выше по сравнению с контролем IgG, которая показала только фоновые уровни, что говорит о эффективности и специфичности антителак 6A. Мы также наблюдали, что уровень модификацииm6A c-Myc был значительно выше в 143B, чем в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

MeRIP-qPCR стал ценным инструментом для изучения модификацийРНК m 6A с широким применением. Он особенно полезен для валидации высокопроизводительных результатов секвенирования и точной локализации сайтов модификации внутри определённых областей целевых генов во время механистических исследований. Кроме того, этот метод можно легко реализовать в большинстве лабораторий молекулярной биологии благодаря относительно низкой стоимости и операционной простоте, что делает его эффектив...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук (82174408, 82374477, 82474535 и 82205145).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100% этанолShanghai Titan Scientific Co., Ltd., Америка1158566
143BATCC, АмерикаATCC CRL-8303TM
2 раза; SYBR Green qPCR MixBeijing Qihengxing Biotechnology Co., Ltd., КитайFS-Q1002
Denovix DS-11 DenovixDS-11 Спектрофотометр
Среда DMEMWISENT CORPORATION, Китай319-005-CL
DMEM/F-12 mediumГибко, Америка11320033
EpiQuik CUT& RUN комплект для обогащения РНК m6A (MeRIP)Эпигентек, АмерикаP-9018-24
Сыворотка плода для быкаWISENT CORPORATION, Китай086-150
hFOB1.19Cell Bank Китайской академии наук, КитайGNHu14
m6A тест на метилирование РНКАбкам, Англияab185912
Набор обратной транскрипции микроРНКEZBioscience-EZB, АмерикаA0010CGQ
Система реального времениBIO-RAD, АмерикаCFX96
Комплект для общей экстракции РНКEZBioscience-EZB, АмерикаB0004DP
Фермент TrypLE ExpressГибко, Америка12604021

Ссылки

  1. Ma, S., et al. The interplay between m6A RNA methylation and noncoding RNA in cancer. J Hematol Oncol. 12 (1), 121(2019).
  2. Zhu, Z. M., Huo, F. C., Zhang, J., Shan, H. J., Pei, D. S. Crosstalk between m6A modification and alternative splicing during cancer progression. Clin Transl Med. 13 (10), e1460(2023).
  3. Hu, T., Wang, G., Wang, D., Deng, Y., Wang, W. m6A methylation modification: Potential pathways to suppress osteosarcoma metastasis. Int Immunopharmacol. 145, 113759(2025).
  4. Nagarajan, A., Janostiak, R., Wajapeyee, N. Dot blot analysis for measuring global N6-methyladenosine modification of RNA. Methods Mol Biol. 1870, 263-271 (2019).
  5. Yang, Y., et al. Current progress in strategies to profile transcriptomic m6A modifications. Front Cell Dev Biol. 12, 1392159(2024).
  6. McIntyre, A. B. R., Gokhale, N. S., Cerchietti, L., Jaffrey, S. R., Horner, S. M., Mason, C. E. Limits in the detection of m6A changes using MeRIP/m6A-seq. Sci Rep. 10 (1), 6590(2020).
  7. Meyer, K. D., Saletore, Y., Zumbo, P., Elemento, O., Mason, C. E., Jaffrey, S. R. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  8. Zheng, H. X., Zhang, X. S., Sui, N. Advances in the profiling of N6-methyladenosine (m6A) modifications. Biotechnol Adv. 45, 107656(2020).
  9. Matsuzawa, S., Wakata, Y., Ebi, F., Isobe, M., Kurosawa, N. Development and validation of monoclonal antibodies against N6-methyladenosine for the detection of RNA modifications. PLoS One. 14 (10), e0223197(2019).
  10. Law, J., Günther, S., Watanabe, S. Epitranscriptome mapping of N6-methyladenosine using m6A immunoprecipitation with high-throughput sequencing in skeletal muscle stem cells. Methods Mol Biol. 2640, 431-443 (2023).
  11. Mathur, L., Jung, S., Jang, C., Lee, G. Quantitative analysis of m6A RNA modification by LC-MS. STAR Protoc. 2 (3), 100724(2021).
  12. Slama, K., et al. Determination of enrichment factors for modified RNA in MeRIP experiments. Methods. 156, 102-109 (2019).
  13. Guo, W., et al. Single-molecule m6A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms. Mol Cell. 85 (6), 1233-1246.e7 (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

N6beads G
MeRIP-qPCR анализ для обнаружения уровней модификацииm6A специфических РНК в клетках остеосаркомы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.