MeRIP-qPCR анализ для обнаружения уровней модификацииm6A специфических РНК в клетках остеосаркомы

Binghan Yan; Junli Chang; Suxia Guo; Peng Zhao; Fulai Zhao; Chujie Zhou; Junjie Tong; Xinyu Zhang; Yuping Hong; Mengchen Yin; Xingyuan Sun; Yanping Yang

doi:10.3791/69880

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

MeRIP-qPCR анализ для обнаружения уровней модификации^m6A специфических РНК в клетках остеосаркомы

942 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69880

⸱

30 декабря 2025 г.

Binghan Yan^*¹^,² , Junli Chang^*¹^,² , Suxia Guo¹^,² , Peng Zhao¹^,² , Fulai Zhao¹^,² , Chujie Zhou¹^,² , Junjie Tong¹^,² , Xinyu Zhang¹^,² , Yuping Hong¹^,² , Mengchen Yin¹^,² , Xingyuan Sun¹^,² , Yanping Yang¹^,²

¹Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, ²Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол предоставляет подробный подход к оценке уровней модификации m⁶A специфической РНК с помощью MeRIP-qPCR.

Аннотация

Эпитранскриптомическая модификация РНК играет ключевую роль в инициации и развитии различных видов рака, среди которых наиболее распространённой и функциональноразнообразной является N6-метиладенозин (m 6 A). Здесь мы представляем упрощённый и воспроизводимый протокол с использованием MeRIP-qPCR для оценки уровней модификации^m6A специфических транскриптов в клетках остеосаркомы. В этом анализе была извлечена общая РНК, после чего проводилась инкубация специфическим антителом^{анти-m 6}A для иммунозахвата РНК модификации m⁶A. Затем РНК фрагментировались, и обогащение^m6-модифицированных РНК фрагментов с помощью магнитных шариков белка G. Обогащённая РНК выделялась с помощью переваривания протеиназы K и очищалась с помощью РНК-связывающих шариков. Наконец, РНК подвергалась обратной транскрипции и количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для оценки уровней^{m 6}A в кандидатных генах. Результаты показали, что этот метод эффективно различает различия в метилировании и служит надёжным инструментом для изучения функциональных механизмов модификации^m6A в клетках остеосаркомы. В заключение, MeRIP-qPCR предлагает простой и очень специфический подход к изучению модификации^m6A в клетках остеосаркомы. Этот протокол обладает большим потенциалом для выявления регуляторных сетей^M6A и выявления новых терапевтических целей.

Введение

Последние исследования эпитранскриптома показывают, что модификация РНКN6-метиладенозина (m 6 A), метилирование позиции^{N 6}на аденозине, является самой распространённой известной внутренней химической модификацией мРНК в эукариотических^{клетках 1}. m⁶A участвует в широком спектре биологических процессов, включая стабильность мРНК, сплайсинг, ядерный экспорт и эффективность^{трансляции 2}. Важно, что накопленные данные свидетельствуют о том, что нарушение регуляции модификации^M6A способствует возникновению и развитию различных видов рака, ....