Методическая статья
Здесь представлен стандартизированный протокол визуализации туннелирования нанотрубок между человеческими эпидермальными кератиноцитами и дермальными фибробластами с использованием мембранной и F-актиновой маркировки с z-стековой конфокальной визуализацией, с опциональной α-тубулиновой ко-окрашкой, что позволяет воспроизводить обнаружение и охарактеризовать цитоскелет для применения тканевой инженерии.
Туннельные нанотрубки (ТНТ) — это тонкие актиновые межклеточные каналы, обеспечивающие дальнодействующую передачу органелл и сигнального груза. Хотя их присутствие в клетках кожи человека широко описано в различных типах клеток, они не были подробно описаны. В этой статье описывается стандартизированный протокол обнаружения и характеристики ТНТ in vitro между эпидермическими кератиноцитами человека и дермальными фибробластами. Метод включает подготовку кокультуры первичных клеток, мягкую фиксацию для сохранения хрупких тротилов, маркировку мембран агглютинином из зародышей пшеницы, окрашивание F-актином с помощью фаллоидина и систематическое z-стековое изображение с помощью инвертированной конфокальной микроскопии для различия тротилов, подвешенных над субстратом, от приклеенных филоподий. Опциональное иммунное окрашивание α-тубулина позволяет оценить включение микротрубочков. ТНТ определяются тремя признаками: тонкими прямыми выступами, соединяющими две или более клеток, наличием F-актина и непрерывностью между парами клеток в последовательных оптических срезах. Репрезентативные результаты демонстрируют связывание ТНТ между дермально-дермальными, эпидермальными-эпидермическими и дермально-эпидермическими парами с изменяющимся цитоскелетным составом (только F-актин или F-актин плюс α-тубулин). Критически важные этапы включают мягкую фиксацию, использование свежих реагентов и получение достаточного количества z-плоскостей для предотвращения неправильной классификации, в то время как распространённые артефакты включают повреждение тротила и неполное окрашивание. Вместе эти оптимизированные шаги позволяют воспроизводить обнаружение ТНТ в клетках кожи и предоставляют методологическую основу для будущих исследований коммуникации, опосредованной ТНТ, в биологии и регенерации кожи.
Туннельные нанотрубки (ТНТ) — это наномасштабные каналы на основе актина, которые обеспечивают прямой межклеточный перенос органелл и сигнальных молекул. Обычно они имеют длину от 6 до 100 мкм и диаметр 50–500 мкм, некоторые достигают толщины до700 мкм. В отличие от пустых выступов мембраны, ТНТ содержат цитоскелетные нити, чаще всего F-актин, которые обеспечивают структурную жёсткость и поддерживают транспорт митохондрий 2,3,4. В двумерной культуре тротилы определяются тремя признаками: тонкими (20–700 нм), прямыми вы....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все клетки кожи, использованные в этом исследовании, ранее были замороженными первичными клетками, выделенными из человеческих кожных тканей, полученными в виде отброшенных образцов крайней плоти в ходе процедур обрезания, и были полностьюдеидентифицированы 22. Сбор образцов человеческой кожи проводился в отделении урологии Народной больницы при Университете Нинбо, а протокол исследования был утверждён институциональным комитетом по этике (Протокол No 2024104; дата утверждения: 30 октября 2024 года).
1. Идентификация тротила в первичных кожных эпидермиальных кератиноцитах и дер....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
С помощью этого стандартизированного протокола туннельные нанотрубки (ТНТ) были успешно выявлены в клетках кожи человека как при одной культуре, так и при совместной культуре. Для проверки специфичности антител для всех антител до экспериментального анализа проводились как положительные, так и отрицательные контрольные окрашивания, как показано на дополнительных рисунках 1, дополнительном рисунке 2, дополнительном рисунке 3 и дополнительном рисунке 4. Ре.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Критически важным этапом в этом протоколе является сохранение тротила во время фиксации и окрашивания, так как эти структуры крайне хрупки и легко нарушаются. Аккуратное обращение при фиксации, правильное время и использование свежих фиксаторов необходимы для поддержания целостности TNT. Использование Z-стековой конфокальной визуализации не менее важно для различия тротилов, подвешенных над субстратом, от филоподий или других прилипающих выступов, которые в противном случае могут привест.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Этот проект был профинансирован Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 82273554). Авторы выражают признательность Лаборатории биоматериалов и регенерации тканей в больнице стоматологии Нинбо за постоянную поддержку и выражают благодарность как нынешним, так и бывшим сотрудникам за их ценные обсуждения. Авторы также выражают благодарность преподавателю Фэн Ли из Исследовательского и экспериментального центра Ханчжоуского медицинского колледжа за щедрую помощь и сильную поддержку в обеспечении доступа к конфокальному микроскопу.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Трубка объёмом 15 мл | КИРГЕН | KG2611 | Стерильный, без РНаз/Днэйз и пирогенных веществ |
| 37 градусов; Инкубатор C | Thermo Scientific | 51032877 | Инкубатор CO2 под углом 37 градусов обеспечивает идеальную среду in vitro. |
| Actin-Tracker Red-Rhodamine | Beyotime | C2207 | Actin-Tracker Red-Rhodamine зонд — это фаллоидин, маркированный флуоресцентным красителем родамином, с максимальной длиной волны возбуждения 540 нм и максимальной длиной волны излучения 565 нм. |
| Конъюгат Alexa Fluor аглютинина зародышей пшеницы (WGA) | Молекулярные зонды | W11261 | Alexa Fluor 488 Conjugate |
| Антиальфа-тубулиновое антитело | Abcam | ab7291 | Антитела к альфа-тубулину — контроль нагрузки (ab7291) — это мышиное моноклональное антитело, обнаруживающее альфа-тубулин. Подходит для человека, мыши, крысы. |
| Антицитокератин-5 антитела | Abcam | ab52635 | Антитела к антицитокератину 5 — маркер цитоскелета (ab52635) — это моноклональное антитело кроликов, обнаруживающее цитокератин 5. Подходит для человека, мыши, крысы. |
| Aqua-Poly/Mount | Полинауки | 18606 | Водорастворимая, нефлуоресценционная монтажная среда, разработанная для монтажа секций из водных растворов. Полезно для иммунофлуоресцентных методов, так как усиливает и сохраняет флуоресцентные окрашивания. |
| Автоматический счётчик ячеек | Countstar | IC1000 | Автоматический счётчик ячеек для быстрого и точного подсчёта ячеек |
| Настольная центрифуга | BIORIDGE | TD5 | Настольная центрифуга для быстрого и эффективного разделения образцов в лабораторных условиях |
| Кабинет биологической безопасности | Thermo Scientific | 1379 | Биологический шкаф безопасности — это стерильное устройство для сдерживания, которое защищает операторов, образцы и окружающую среду от биологических опасностей, фильтруя воздушные патогены и предотвращая перекрёстное загрязнение во время микробиологических работ. |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | YOBIBIO | U5010-10g | BSA — это глобулин в сыворотке крупного рогатого рогатого скота, содержащий 583 аминокислотных остатка с молекулярной массой 66,430 кДа и изоэлектрической точкой 4,7 |
| Контейнер для клеточной культуры (60x15 мм) | Эппендорф | 30701119 | Тканевая культура, обработанная стерильно, без обнаруженных пирогенов, РНазы и РНазы ДНК, ДНК. |
| Камера затвора камеры Cellvis Slide-8 | Cellvis | C8-1.5H-N | Разработана для высокоразрешающей визуализации, такой как конфокальная микроскопия. |
| Раствор для окрашивания DAPI | Beyotime | C1006-10 мл | Раствор для окрашивания DAPI подходит для ядерного окрашивания всех распространённых клеток и тканей. |
| Козла против мышей IgG H& L (Alexa Fluor 405) | Abcam | ab175660 | Козла против мышей IgG H& L (Alexa Fluor 405) — вторичное антитело с максимальной длиной волны поглощения 401 нм и максимальной длиной волны излучения 421 нм. |
| Goat Anti-Rabbit IgG H& L спряжен в Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175652 | Goat Anti-Rabbit IgG H& L (Alexa Fluor 405) — вторичное антитело с максимальной длиной волны поглощения 401 нм и максимальной длиной волны излучения 421 нм. |
| Goat Anti-Rabbit IgG H& L спряжен в Alexa Fluor 594 | Abcam | AB150080 | Козла против кроликов IgG H& L (Alexa Fluor 594) — это вторичное антитело с максимальной длиной волны поглощения 590 нм и максимальной длиной волны излучения 617 нм. |
| Инвертированный конфокальный флуоресцентный микроскоп | Leica | TCS SP8 X | Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Leica SP8 X обеспечивает непревзойденную высококачественную визуализацию с передовыми возможностями обнаружения флуоресценции и анализа живых клеток. |
| Инвертированный конфокальный флуоресцентный микроскоп | Андор | BC43 | Andor BC43 — это компактный, высокоскоростной конфокальный микроскоп, предлагающий в 10 раз быстрее изображения, чем традиционные системы с возможностью 2D/3D изображения в один клик |
| NH4Cl | MedChemExpress | HY-Y1269 | Хлорид аммония как полярное соединение для регулирования pH. |
| Фаллоидиновые сопряжённые Орегон GreenTM488 | Жизненные технологии | O7466 | Цвет: зелёный. Диапазон длин волны возбуждения: 496/520. |
| Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) | Viva Cell Biosciences | C3582-0500 | Его функция — поддерживать pH среды в физиологическом диапазоне и поддерживать баланс осмотического давления внутри и вне клетки. |
| Triton-X 100 | Solarbio | T8200-100 мл | Это универсальное неионное поверхностно-активное вещество, используемое для восстановления мембранных компонентов при мягких условиях денатурирования. |
| Решение трипсина-EDTA | GIBCO | 25300054 | Благодаря своей пищеварительной силе трипсин широко используется для диссоциации клеток, рутинного прохождения культуры клеток и первичной диссоциации тканей. |
| Y-27632 | MedChemExpress | HY-10071 | Y-27632 — это перорально активный, конкурентный ингибитор ROCK-I и ROCK-II |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение