Методическая статья

Стандартизированный метод обнаружения туннельных нанотрубок в клетках кожи человека для применения в тканевой инженерии

790 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69883

⸱

13 января 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital, 4Department of Urology, the Affiliated People's Hospital of Ningbo University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен стандартизированный протокол визуализации туннелирования нанотрубок между человеческими эпидермальными кератиноцитами и дермальными фибробластами с использованием мембранной и F-актиновой маркировки с z-стековой конфокальной визуализацией, с опциональной α-тубулиновой ко-окрашкой, что позволяет воспроизводить обнаружение и охарактеризовать цитоскелет для применения тканевой инженерии.

Аннотация

Туннельные нанотрубки (ТНТ) — это тонкие актиновые межклеточные каналы, обеспечивающие дальнодействующую передачу органелл и сигнального груза. Хотя их присутствие в клетках кожи человека широко описано в различных типах клеток, они не были подробно описаны. В этой статье описывается стандартизированный протокол обнаружения и характеристики ТНТ in vitro между эпидермическими кератиноцитами человека и дермальными фибробластами. Метод включает подготовку кокультуры первичных клеток, мягкую фиксацию для сохранения хрупких тротилов, маркировку мембран агглютинином из зародышей пшеницы, окрашивание F-актином с помощью фаллоидина и систематическое z-стековое изображение с помощью инвертированной конфокальной микроскопии для различия тротилов, подвешенных над субстратом, от приклеенных филоподий. Опциональное иммунное окрашивание α-тубулина позволяет оценить включение микротрубочков. ТНТ определяются тремя признаками: тонкими прямыми выступами, соединяющими две или более клеток, наличием F-актина и непрерывностью между парами клеток в последовательных оптических срезах. Репрезентативные результаты демонстрируют связывание ТНТ между дермально-дермальными, эпидермальными-эпидермическими и дермально-эпидермическими парами с изменяющимся цитоскелетным составом (только F-актин или F-актин плюс α-тубулин). Критически важные этапы включают мягкую фиксацию, использование свежих реагентов и получение достаточного количества z-плоскостей для предотвращения неправильной классификации, в то время как распространённые артефакты включают повреждение тротила и неполное окрашивание. Вместе эти оптимизированные шаги позволяют воспроизводить обнаружение ТНТ в клетках кожи и предоставляют методологическую основу для будущих исследований коммуникации, опосредованной ТНТ, в биологии и регенерации кожи.

Введение

Туннельные нанотрубки (ТНТ) — это наномасштабные каналы на основе актина, которые обеспечивают прямой межклеточный перенос органелл и сигнальных молекул. Обычно они имеют длину от 6 до 100 мкм и диаметр 50–500 мкм, некоторые достигают толщины до700 мкм. В отличие от пустых выступов мембраны, ТНТ содержат цитоскелетные нити, чаще всего F-актин, которые обеспечивают структурную жёсткость и поддерживают транспорт митохондрий 2,3,4. В двумерной культуре тротилы определяются тремя признаками: тонкими (20–700 нм), прямыми выступами, подвешенными над субстратом, соединяющими две или более клеток; наличие F-актиновых нитей; и возможность перевозки груза.

С момента их первой идентификации в клетках PC-12 Рустомом и др.5 ТНТ изучались в различных системах, включая сердечно-сосудистую6,иммунную 7 идыхательные 8 системы, эпителийроговицы 9, опухоли10 и нервнуюсистему 11,12. Они участвуют в физиологических и патологических процессах, таких как иммунная сигнализация, апоптоз, транспорт материалов иангиогенез 13,14,15. ТНТ могут обеспечивать дальнодействующую передачу различных грузов, включая митохондрии, эндоплазматический ретикулум, нуклеиновые кислоты, ионы и дажевирусы 5,16,17.

Кожа — структурно сложный орган, эпидермис и дерма зависят от постоянной связи для гомеостаза, заживления ран и регенерациипридатков 18,19,20. Хотя ТНТ были описаны во многих тканях, включая иммунную систему, нейронную систему и эпителийроговицы 7,9,12, их присутствие в клетках кожи человека не сообщалось в опубликованной литературе. Опираясь на методологическую основу, описанную Саэнсом-де-Санта-Марией и др.21, мы представляем стандартизированный и оптимизированный протокол обнаружения тротила между эпидермическими кератиноцитами и дермическимифибробластами 22 с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания в сочетании с инвертированной конфокальной микроскопией.

По сравнению с альтернативными методами обнаружения ТНТ, этот протокол обеспечивает практический баланс между чувствительностью и доступностью. Живоклеточная визуализация может фиксировать динамику TNT, но ограничена фототоксичностью и кратковременным характеромTNT 1,23. Электронная микроскопия обеспечивает ультраструктурные детали, но часто не сохраняет длинные пролёты ТНТ и не подходит для рутинного анализа первичных клетоккожи 24,25. Репортерные нанотрубочные системы позволяют отслеживать в реальном времени, но требуют генетической манипуляции, что обычно неэффективно для первичных кератиноцитов ифибробластов 24,26. В отличие от этого, настоящий протокол использует стандартную иммунофлуоресцентную и конфокальную микроскопию, что позволяет воспроизводить обнаружение ТНТ на независимо подготовленных культурах клеток кожи, сохраняя совместимость с хрупкими первичными клетками.

Этот метод особенно подходит для анализа с фиксированными образцами, где интересны состав цитоскелета и распространённость тротила. Поскольку ТНТ очень хрупкие, этапы фиксации и обработки остаются ключевыми ограничениями, и подход не может отражать динамику ТНТ в реальном времени. Тем не менее, для лабораторий, работающих с первичными клетками человеческой кожи, этот стандартизированный рабочий процесс обеспечивает доступный и последовательный способ визуализации ТНТ и поддерживает дальнейшие исследования их потенциальных функций в тканевой инженерии и регенерации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все клетки кожи, использованные в этом исследовании, ранее были замороженными первичными клетками, выделенными из человеческих кожных тканей, полученными в виде отброшенных образцов крайней плоти в ходе процедур обрезания, и были полностьюдеидентифицированы 22. Сбор образцов человеческой кожи проводился в отделении урологии Народной больницы при Университете Нинбо, а протокол исследования был утверждён институциональным комитетом по этике (Протокол No 2024104; дата утверждения: 30 октября 2024 года).

1. Идентификация тротила в первичных кожных эпидермиальных кератиноцитах и дермальных фибробластах

  1. Подготовка раствора
    1. Приготовьте фиксационный раствор 1 (200 мкл), добавив 4% PFA (100 мкл), 2,5% глутаральдегида (4 мкл), 1 M HEPES (40 мкл) и 1x PBS (56 мкл). Приготовьте свежий и прогрейте до 37 °C перед использованием.
    2. Приготовьте фиксационный раствор 2 (200 мкл), добавив 8% PFA (100 мкл), 1 M HEPES (0,4 мкл), 1x PBS (99,6 мкл). Приготовьте свежий и прогрейте до 37 °C перед использованием.
    3. Приготовьте фиксирующий раствор 3 (200 мкл), добавив 8% ПФА (100 мкл), 2,5% глутаральдегида (4 мкл), 1x PBS (96 мкл). Приготовьте свежий и прогрейте до 37 °C перед использованием.
  2. Клеточная культура
    1. Оттаять и культивировать человеческие эпидермальные кератиноциты и дермальные фибробласты в 60-мм чашках с использованием соответствующей среды роста. Дополните культуры кератиноцитов Y-27632 при конечной концентрации 5 мкм во время реанимации. Поддерживайте культуры при 37 °C в увлажнённом инкубаторе, пока клетки не достигнут ~80% слияния.
    2. Снимите среду и кратко промите клетки 1 мл 1x PBS (используется для поддержания физиологического pH и осмолярности во время промывания). Аспирируйте PBS.
    3. Добавьте 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА, равномерно распределите и инкубируйте при 37 °C в течение 1,5–2,5 минут.
    4. Аккуратно подвесьте клетки с помощью пипетирования. Добавьте 2 мл среды для роста, перенесите в трубку на 15 мл и центрифугите при 200 x г в течение 5 минут при комнатной температуре.
    5. Сбросьте супернатант и снова суспензируйте гранулу в 1-2 мл среды. Считайте ячейки с помощью автоматического счётчика.
    6. Семена 12 000 дермальных фибробластов или 20 000 кератиноцитов в каждую яме 8-луночной камеры в итоговом объёме 400 мкл. После посева хорошо перекрёстно встряхните камеру, чтобы равномерно распределить клетки. Инкубировать в течение ~24 часов при 37 °C.
    7. После примерно 24 часов инкубации наблюдайте слияние клеток под микроскопом. Если он достигает ~80%, переходите к последующим этапам фиксации.
  3. Фиксация
    1. Когда культуры достигают ~80% слияния, аккуратно наносите несколько капель фиксирующего раствора 1 непосредственно в камеру для предварительной фиксации клеток. Инкубировать 4 минуты при комнатной температуре. Убедитесь, что фиксатор равномерно распространяется, не нарушая клетки.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с ними аккуратно, чтобы избежать нарушений работы тротила. Поскольку фиксирующие растворы содержат токсичные компоненты, такие как ПФА и глутаральдегид, всегда носите защитные перчатки, защитную одежду и маску, а также обращайтесь с ними в вытяжке. Обязательно тщательно мойте руки после процедуры. Собирайте PFA и глутаральдегид-фиксирующие отходы отдельно в маркированные контейнеры для утилизации опасных химикатов.
    2. Аспирируйте префиксатив и замените его на 140 мкл свежего фиксационного раствора 1, чтобы вся скважина была покрыта. Инкубировать 15 минут при 37 °C.
    3. Удалите фиксационный раствор 1 и добавьте 140 мкл фиксирующего раствора 2. Инкубировать 15 минут при 37 °C. Убедитесь, что раствор полностью покрывает клетки для равномерной фиксации.
    4. Удалите фиксатор, затем добавьте 140 мкл 100 мМ NH₄Cl для закалки остаточных альдегидов. Инкубировать 10-30 минут при комнатной температуре.
    5. Промывайте образцы 3 раза с помощью 1x PBS по 30 секунд при комнатной температуре, аккуратно проводя пипетой вдоль стенки камеры, чтобы не смывать клетки и не ломать тротил.
  4. Окрашивание мембраны и цитоскелета
    1. Инкубировать клетки с 140 мкл 1:300 (v/v) WGA (Wheat Germ Agglutinin) — Alexa Fluor, который маркирует гликопротеины плазматической мембраны для визуализации мембранных ТНТ, в 1x PBS в течение 20 минут в темноте при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие шаги должны выполняться в тёмной обстановке.
    2. Стирайте 3 раза с 1x PBS (по 30 секунд каждая). Инкубировать с 140 мкл фаллоидина конъюгата, разбавленного 1:250 (v/v) в 1% BSA в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре.
    3. Стирайте 3 раза с 1x PBS (по 30 секунд каждая). Инкубировать с 140 мкл раствора DAPI в течение 5 минут при комнатной температуре в темноте.
    4. Стирайте 3 раза с 1× PBS. Добавьте 2-3 капли монтажного материала, инкубуйте 20 минут при комнатной температуре и храните не менее 20 минут при 4 °C в темноте до проведения визуализации.
  5. Визуализация
    1. Получайте изображения с помощью инвертированного конфокального микроскопа с объективом 40x. Выберите случайные поля и соберите Z-стеки (10-20 слоёв) снизу вверх ячеек. Конкретные параметры микроскопа, используемые для получения изображений, перечислены ниже:
      Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп: ZEISS LSM 900
      Лазерные линии: Путь 1 (561 нм, 4,0%), Путь 2 (488 нм, 16,0%), Путь 3 (405 нм, 60,0%)
      Усиление датчика: 525 В
      Z-шаговый размер: 20 оптических сечений (общая глубина: 5,32 мкм)

2. Совместная культура эпидермальных и дермальных клеток

  1. Подготовьте кератиноциты и фибробласты в соответствии с шагами 1.2.1–1.2.5.
  2. Сеять 10 000 кератиноцитов и 6 000 фибробластов в камеру в 400 мкл среды. После посева хорошо перекрёстно встряхните камеру, чтобы равномерно распределить клетки. Инкубировать 24 часа при 37 °C.
  3. После примерно 24 часов инкубации наблюдайте слияние клеток под микроскопом. Если он достигает ~80%, переходите к последующим этапам фиксации.
  4. Фиксируйте и окрашивайте мембраны, как описано в шагах 1.3-1.4.
  5. Пермеабилизуйте клетки с 0,1% Triton X-100, чтобы обеспечить доступ антител к внутриклеточным мишеням, в течение 3 минут при комнатной температуре, затем промывайте 3 раза с помощью 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 0,1% Triton X-100 должен быть свежеприготовленным перед использованием.
    ВНИМАНИЕ: Triton X-100, вредный для водных организмов, также должен утилизироваться как химические отходы и никогда не выливаться в канализацию.
  6. Блокируйте 140 мкл 2% BSA в PBS, чтобы уменьшить связывание неспецифических антител на 20 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 2% BSA должно быть свежеприготовленным перед использованием.
  7. Инкубировать ночь при 4 °C с антителами к антицитокератину 5, разбавленной 1:200 (v/v) при 2% BSA.
  8. Промывайте 3 раза с 1x PBS, затем инкубируйте вторичным антителом, конъюгированным Alexa Fluor 594, в течение 1-2 часа при комнатной температуре в темноте.
  9. Стирайте 3 раза с 1× PBS. Окрашивайте ядра с помощью DAPI и изображения в соответствии с шагами 1.4.5-1.5.2.

3. Идентификация цитоскелетных компонентов тротила

  1. Клеточная культура
    1. Культивировать и фиксировать клетки в соответствии с шагами 1.2-1.3. Пермеабилизуйте с 0,1% Triton X-100 в течение 3 минут при комнатной температуре, затем стирайте с помощью 1x PBS.
    2. Блокируйте 2% BSA на 20 минут при комнатной температуре. Инкубировать ночь при 4 °C с анти-α-тубулиновыми антителами.
    3. Промывайте 3 раза с 1x PBS и инкубируйте вторичным антителом, конъюгированным Alexa Fluor, в течение 1-2 часа при комнатной температуре в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие шаги должны выполняться в тёмной обстановке.
    4. Постирайте 3 раза с 1x PBS. Маркировать F-актин фаллоидином и изображением как в шагах 1.4.3-1.5
  2. Кокультурирование клеток
    1. Подготовьте совместные культуры в соответствии с шагами 2.1-2.2. Фиксируйте фиксационным раствором 3 на 15 минут при комнатной температуре.
    2. Замените на 140 мкл 100 мМNH 4Cl и инкубируете 10-30 минут при комнатной температуре. Постирайте 3 раза с 1x PBS.
    3. Во-первых, идентифицировать эпидермические клетки путём проведения проницаемости, блокировки и иммунокрашивки CK5 точно так, как описано в шагах 2.4-2.8.
    4. Затем выполните иммунокрашивку α-тубулином по шагам 3.1.2-3.1.4.
    5. Наконец, окрасьте F-актин фаллоидином и приступите к визуализации, как описано в шагах 1.4.2-1.5.2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С помощью этого стандартизированного протокола туннельные нанотрубки (ТНТ) были успешно выявлены в клетках кожи человека как при одной культуре, так и при совместной культуре. Для проверки специфичности антител для всех антител до экспериментального анализа проводились как положительные, так и отрицательные контрольные окрашивания, как показано на дополнительных рисунках 1, дополнительном рисунке 2, дополнительном рисунке 3 и дополнительном рисунке 4. Ре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критически важным этапом в этом протоколе является сохранение тротила во время фиксации и окрашивания, так как эти структуры крайне хрупки и легко нарушаются. Аккуратное обращение при фиксации, правильное время и использование свежих фиксаторов необходимы для поддержания целостности TNT. Использование Z-стековой конфокальной визуализации не менее важно для различия тротилов, подвешенных над субстратом, от филоподий или других прилипающих выступов, которые в противном случае могут привест...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Этот проект был профинансирован Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 82273554). Авторы выражают признательность Лаборатории биоматериалов и регенерации тканей в больнице стоматологии Нинбо за постоянную поддержку и выражают благодарность как нынешним, так и бывшим сотрудникам за их ценные обсуждения. Авторы также выражают благодарность преподавателю Фэн Ли из Исследовательского и экспериментального центра Ханчжоуского медицинского колледжа за щедрую помощь и сильную поддержку в обеспечении доступа к конфокальному микроскопу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Трубка объёмом 15 млКИРГЕНKG2611Стерильный, без РНаз/Днэйз и пирогенных веществ
37 градусов; Инкубатор CThermo Scientific51032877Инкубатор CO2 под углом 37 градусов обеспечивает идеальную среду in vitro.
Actin-Tracker Red-RhodamineBeyotimeC2207Actin-Tracker Red-Rhodamine зонд — это фаллоидин, маркированный флуоресцентным красителем родамином, с максимальной длиной волны возбуждения 540 нм и максимальной длиной волны излучения 565 нм.
Конъюгат Alexa Fluor аглютинина зародышей пшеницы (WGA)Молекулярные зондыW11261  Alexa Fluor 488 Conjugate
Антиальфа-тубулиновое антителоAbcamab7291Антитела к альфа-тубулину — контроль нагрузки (ab7291) — это мышиное моноклональное антитело, обнаруживающее альфа-тубулин. Подходит для человека, мыши, крысы.
Антицитокератин-5 антитела Abcamab52635Антитела к антицитокератину 5 — маркер цитоскелета (ab52635) — это моноклональное антитело кроликов, обнаруживающее цитокератин 5. Подходит для человека, мыши, крысы.
Aqua-Poly/MountПолинауки18606Водорастворимая, нефлуоресценционная монтажная среда, разработанная для монтажа секций из водных растворов. Полезно для иммунофлуоресцентных методов, так как усиливает и сохраняет флуоресцентные окрашивания.
Автоматический счётчик ячеекCountstarIC1000Автоматический счётчик ячеек для быстрого и точного подсчёта ячеек
Настольная центрифугаBIORIDGETD5Настольная центрифуга для быстрого и эффективного разделения образцов в лабораторных условиях
Кабинет биологической безопасностиThermo Scientific1379Биологический шкаф безопасности — это стерильное устройство для сдерживания, которое защищает операторов, образцы и окружающую среду от биологических опасностей, фильтруя воздушные патогены и предотвращая перекрёстное загрязнение во время микробиологических работ.
Бычий сывороточный альбумин (BSA)YOBIBIOU5010-10gBSA — это глобулин в сыворотке крупного рогатого рогатого скота, содержащий 583 аминокислотных остатка с молекулярной массой 66,430 кДа и изоэлектрической точкой 4,7
Контейнер для клеточной культуры (60x15 мм)Эппендорф30701119Тканевая культура, обработанная стерильно, без обнаруженных пирогенов, РНазы и РНазы ДНК, ДНК.
Камера затвора камеры Cellvis Slide-8CellvisC8-1.5H-NРазработана для высокоразрешающей визуализации, такой как конфокальная микроскопия.
Раствор для окрашивания DAPIBeyotimeC1006-10 млРаствор для окрашивания DAPI подходит для ядерного окрашивания всех распространённых клеток и тканей.
Козла против мышей IgG H& L (Alexa Fluor 405) Abcamab175660Козла против мышей IgG H& L (Alexa Fluor 405) — вторичное антитело с максимальной длиной волны поглощения 401 нм и максимальной длиной волны излучения 421 нм.
Goat Anti-Rabbit IgG H& L спряжен в Alexa Fluor 405Abcamab175652Goat Anti-Rabbit IgG H& L (Alexa Fluor 405) — вторичное антитело с максимальной длиной волны поглощения 401 нм и максимальной длиной волны излучения 421 нм.
Goat Anti-Rabbit IgG H& L спряжен в Alexa Fluor 594AbcamAB150080Козла против кроликов IgG H& L (Alexa Fluor 594) — это вторичное антитело с максимальной длиной волны поглощения 590 нм и максимальной длиной волны излучения 617 нм.
Инвертированный конфокальный флуоресцентный микроскопLeicaTCS SP8 XЛазерный сканирующий конфокальный микроскоп Leica SP8 X обеспечивает непревзойденную высококачественную визуализацию с передовыми возможностями обнаружения флуоресценции и анализа живых клеток.
Инвертированный конфокальный флуоресцентный микроскопАндорBC43Andor BC43 — это компактный, высокоскоростной конфокальный микроскоп, предлагающий в 10 раз быстрее изображения, чем традиционные системы с возможностью 2D/3D изображения в один клик
NH4Cl MedChemExpressHY-Y1269 Хлорид аммония как полярное соединение для регулирования pH.
Фаллоидиновые сопряжённые Орегон GreenTM488Жизненные технологииO7466Цвет: зелёный. Диапазон длин волны возбуждения: 496/520.
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Viva Cell BiosciencesC3582-0500Его функция — поддерживать pH среды в физиологическом диапазоне и поддерживать баланс осмотического давления внутри и вне клетки.
Triton-X 100SolarbioT8200-100 млЭто универсальное неионное поверхностно-активное вещество, используемое для восстановления мембранных компонентов при мягких условиях денатурирования.
Решение трипсина-EDTAGIBCO25300054Благодаря своей пищеварительной силе трипсин широко используется для диссоциации клеток, рутинного прохождения культуры клеток и первичной диссоциации тканей.
Y-27632MedChemExpressHY-10071Y-27632 — это перорально активный, конкурентный ингибитор ROCK-I и ROCK-II

Ссылки

  1. Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Commun Integr Biol. 7 (1), e27934(2014).
  2. Liu, Z., Sun, Y., Qi, Z., Cao, L., Ding, S. Mitochondrial transfer/transplantation: an emerging therapeutic approach for multiple diseases. Cell Biosci. 12 (1), 66(2022).
  3. Yang, F., et al. Tunneling Nanotube-Mediated Mitochondrial Transfer Rescues Nucleus Pulposus Cells from Mitochondrial Dysfunction and Apoptosis. Oxid Med Cell Longev. 2022, 3613319(2022).
  4. Yang, C., et al. Mitochondria transfer from early stages of erythroblasts to their macrophage niche via tunnelling nanotubes. Br J Haematol. 193 (6), 1260-1274 (2021).
  5. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  6. Alarcon-Martinez, L., et al. Pericyte dysfunction and loss of interpericyte tunneling nanotubes promote neurovascular deficits in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (7), 2110329119(2022).
  7. Zhu, C., Shi, Y., You, J. Immune Cell Connection by Tunneling Nanotubes: The Impact of Intercellular Cross-Talk on the Immune Response and Its Therapeutic Applications. Mol Pharm. 18 (3), 772-786 (2021).
  8. Zhang, F., et al. TFAM-Mediated mitochondrial transfer of MSCs improved the permeability barrier in sepsis-associated acute lung injury. Apoptosis. 28 (7-8), 1048-1059 (2023).
  9. Jiang, D., et al. Mitochondrial transfer of mesenchymal stem cells effectively protects corneal epithelial cells from mitochondrial damage. Cell Death Dis. 7 (11), e2467(2016).
  10. Zheng, Y., et al. Tunneling nanotubes mediate KRas transport: Inducing tumor heterogeneity and altering cellular membrane mechanical properties. Acta Biomater. 185, 312-322 (2024).
  11. Dilsizoglu Senol, A., et al. α-Synuclein fibrils subvert lysosome structure and function for the propagation of protein misfolding between cells through tunneling nanotubes. PLoS Biol. 19 (7), e3001287(2021).
  12. Scheiblich, H., et al. Microglia rescue neurons from aggregate-induced neuronal dysfunction and death through tunneling nanotubes. Neuron. 112 (18), 3106-3125.e8 (2024).
  13. Solimando, A. G., et al. Tunneling nanotubes between bone marrow stromal cells support transmitophagy and resistance to apoptosis in myeloma. Blood Cancer J. 15 (1), 3(2025).
  14. Korenkova, O., et al. Tunneling nanotubes enable intercellular transfer in zebrafish embryos. Dev Cell. 60 (4), 524-534 (2025).
  15. Ma, L., et al. Dynamic three-dimensional culture enhances tunneling nanotubes-mediated mitochondrial transfer in mesenchymal stromal cells to accelerate wound healing. J Nanobiotechnol. 23 (1), 559(2025).
  16. Sahinbegovic, H., et al. Intercellular Mitochondrial Transfer in the Tumor Microenvironment. Cancers (Basel). 12 (7), 12071787(2020).
  17. Gurke, S., Barroso, J. F., Gerdes, H. H. The art of cellular communication: tunneling nanotubes bridge the divide. Histochem Cell Biol. 129 (5), 539-550 (2008).
  18. Kobielak, K., Pasolli, H. A., Alonso, L., Polak, L., Fuchs, E. Defining BMP functions in the hair follicle by conditional ablation of BMP receptor IA. J Cell Biol. 163 (3), 609-623 (2003).
  19. Nowak, J. A., Polak, L., Pasolli, H. A., Fuchs, E. Hair follicle stem cells are specified and function in early skin morphogenesis. Cell Stem Cell. 3 (1), 33-43 (2008).
  20. Woo, W. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop. Genes Dev. 26 (11), 1235-1246 (2012).
  21. Sáenz-de-Santa-María, I., Henderson, J. M., Pepe, A., Zurzolo, C. Identification and Characterization of Tunneling Nanotubes for Intercellular Trafficking. Curr Protoc. 3 (11), e939(2023).
  22. Liu, Z., et al. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J Vis Exp. (138), e57784(2018).
  23. Dupont, M., Souriant, S., Lugo-Villarino, G., Maridonneau-Parini, I., Vérollet, C. Tunneling Nanotubes: Intimate Communication between Myeloid Cells. Front Immunol. 9, 43(2018).
  24. Gerdes, H. H., Rustom, A., Wang, X. Tunneling nanotubes, an emerging intercellular communication route in development. Mech Dev. 130 (6-8), 381-387 (2013).
  25. Sartori-Rupp, A., et al. Correlative cryo-electron microscopy reveals the structure of TNTs in neuronal cells. Nat Commun. 10 (1), 342(2019).
  26. Dagar, S., Pathak, D., Oza, H. V., Mylavarapu, S. V. S. Tunneling nanotubes and related structures: molecular mechanisms of formation and function. Biochem J. 478 (22), 3977-3998 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

F

Похожие статьи