Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Терапевтические эффекты антиспазмолитических гранул Гуалу Гуйчжи на спастичность и ПАНоптоз в модели травмы спинного мозга у крыс

225 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69894

⸱

10 февраля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The Second Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Preparation for Medical Institutions in Fujian Province (Fujian University of Traditional Chinese Medicine), 3Department of Rehabilitation, Second Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Ultrasound, The Second Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании оценивается влияние антиспазмолитических гранул Гуалу Гуйчжи (GLGZ) на спастичность, вызванную травмой спинного мозга (ТСМ), с помощью поведенческих, биомеханических, визуализационных и гистологических методов, а также рассматриваются механизмы, связанные с ПАНоптозом.

Аннотация

Спастичность мышц после травмы спинного мозга (ТСМ) серьёзно влияет на качество жизни, при этом эффективное лечение ограничено. Антиспазмолитические гранулы Gualou Guizhi (GLGZ), разработанная в больнице традиционная китайская медицина (ТКМ), могут облегчать спазмы. Целью данного исследования было оценить эффективность GLGZ при спастичности, индуцированной ТСМ, и её связи с ПАНоптозом (новой программируемой клеточной гибелью, включающей апоптоз, некроптоз и пироптоз).

Использовались самцы крыс Спраг-Доули весом 180–200 г. ТСМ был вызван методом снижения веса по методу Аллена. Успешные модельные крысы случайным образом были распределены в модельную группу или одну из дозовых групп GLGZ: высокую, среднюю или низкую. Фальшивые крысы проходили ламинэктомию без повреждений спинного мозга. Вмешательства длились 4 недели. После вмешательства была оценена моторная функция конечностей с помощью шкалы Бассо-Битти-Бреснахана (BBB). Жесткость бедренной мышцы оценивалась с помощью ультразвуковой эластографии сдвиговых волн (SWE), а целостность спинного мозга — с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ). Для наблюдения гистопатологических изменений проводились быстрое окрашивание в гематоксилин-эозин (HE), Nissl и Luxol для наблюдения гистопатологических изменений. Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание использовалось для маркировки белка, ассоциируемого с апоптозом, содержащего CARD (ASC, зелёный), каспазу-8 (оранжевый) и серин/треонин-протеинкиназу 3 (RIPK3, жёлтый) с целью оценки PANoptosis.

GLGZ улучшил показатели BBB в зависимости от дозы: фиктивная (21,00 ± 0,00), модель (5,8 ± 1,1), высокая доза (10,6 ± 1,3), средняя доза (8,5 ± 1,2), низкая доза (7,1 ± 1,0). SWE показали снижение мышечной жесткости: модель (6,68 ± 0,74 м/с), высокие дозы (2,19 ± 0,36 м/с, P < 0,001), средняя доза (3,04 ± 0,45 м/с, P = 0,002), низкая доза (4,08 ± 0,65 м/с, P = 0,031) по сравнению с моделью. По сравнению с модельной группой (3,65 ± 1,03 мм²), GLGZ в зависимости от дозы уменьшала размер поражения спинного мозга во всех дозировочных группах (все P < 0,05) (1,33 ± 0,79 мм² в высоких дозах, 1,94 ± 0,67 мм² в средней дозе, 2,50 ± 0,79 мм² в низкодозовой группе. Гистология показала, что нейроны сохранены GLGZ и способствуют восстановлению миелина. GLGZ, зависящее от дозы, снижала экспрессию ASC, Caspase-8 и RIPK3.

Введение

Мышечный спазм — это распространённое осложнение травмы спинного мозга (ТСМ), которое серьёзно влияет на качество жизни пациентов. Патологический процесс включает начальное механическое повреждение, вторичное воспаление, окислительный стресс, апоптоз и нарушенную регенерацию нервов, а такжедругие 1,2. Современные методы лечения (хирургическая декомпрессия, фармакотерапия, реабилитация) имеют ограниченную эффективность, при этом длительное лечение вызывает побочные эффекты, такие как лекарственнаяустойчивость 3. Поэтому исследование новых механизмов и методов лечения крайне важно.

Недавние исследования выявили ПАНоптоз — запрограммированную клеточную смерть, интегрирующую апоптоз (зависимый от каспазы), некроптоз (зависимый от RIPK3/MLKL) и пироптоз (зависимый от каспазы/GSDMD)4 как ключевой патологический механизм вторичного повреждения при ТСМ. Аномальная активация (ASC, каспазы-8 и RIPK3) вызывает потерю нейронов и образование глиальных рубцов, усугубляяспастичность 5. Таким образом, нацеление на ПАНоптоз стало перспективной стратегией для прерывания каскад вторичных травмSCI 4.

Традиционная китайская медицина (ТКМ) привлекла внимание к неврологическим заболеваниям благодаря многоцелевым эффектам (например, противовоспалениям, антиоксидантному стрессу)6. Антиспазмодические гранулы Гуалоу Гуйчжи (GLGZ) получены из «Синопсиса Золотой Камеры» Чжан Чжунцзина и оптимизированы как подготовка длябольницы 7. В состав его состава входят Trichosanthes kirilowii (Tianhuafen), Cinnamomum cassia (Гуйчжи), Paeonia lactiflora (Baishao), Glycyrrhiza uralensis (Gancao), jujube и имбирь8. Предварительные исследования показали, что GLGZ облегчает спазмы после повреждения центральной нервной системы, регулируя нейромедиаторы и подавляявоспаление 9. Однако его влияние на спастичность, вызванную ТПМ, и возможную связь с ПАНоптозом остаются неясными.

В отличие от традиционных препаратов с одной целью, многокомпонентная природа GLGZ соответствует сложной патологической сети ТСМ — одновременно устраняя воспаление, потерю нейронов, повреждение миелина и, возможно, ПАНоптоз. В данном исследовании предполагается, что GLGZ улучшает мышечную спастичность у крыс с ТСМ, способствуя патологическому восстановлению спинного мозга (снижая воспаление, сохраняя нейроны, восстанавливает миелина) и подавляя ПАНоптоз. Проверяя эту гипотезу, мы стремимся предоставить экспериментальные доказательства того, что GLGZ — это перспективная терапия, интегрирующая облегчение симптомов и основное патологическое восстановление ТСМ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Моделирование животных
Это исследование было одобрено Этическим комитетом Второй аффилированной больницы Фуцзянского университета традиционной китайской медицины (Одобрение No FJPSPH-IAEC2024114) и проводились в соответствии с руководящими принципами по благополучию животных. Самцы крыс Спраг-Доули весом 180-200 г содержались в контролируемых условиях при 22-26°C и влажности 40-70%. ТСМ был индуцирован методом Аллена с понижениемвеса 10: 3-4% ингаляционная анестезия с изофлураном, разрез средней линии при T10, экспозиция сегментов T9-T11, ламинэктомия (твердая твердость сохранилась) и импактация (кончик 2 мм, скорость 0,5 м/с, глубина 1,3 мм, длительность 1 с). Фиктивные крысы проходили ламинэктомию без воздействия. Критерии включения: балл BBB < 8 через 24 часа после операции; Критерии исключения: инфекция, пересечение спинного мозга. Послеоперационный уход: обезболивание (бупренорфин, 0,1 мг/кг с жидкостью, каждые 12 часов в течение 3 дней), экспрессия мочевого пузыря (каждые 6 часов в течение 1 недели) и уход за стерильными ранами. Успешные модельные крысы были случайным образом распределены в модельную группу: группы GLGZ с высокой дозой (2,32 г/кг, n = 10), средней (1,16 г/кг, n = 10), низкой дозой (0,58 г/кг, n = 10).

Анализ моторных функций
Бассо, Бити и Бреснахан (BBB) записывали музыку слепо. Крыс наблюдали на открытом поле в течение 5 минут, отмечая движение задних конечностей, нагрузку, походку и координацию.

Эластография сдвиговых волн для измерения жёсткости прямой мышцы бедра
Использовалась доплеровская ультразвуковая система с линейным антенным зондом (18L6). Крыс помещали в боковое лежащее положение (мышцы расслаблены). SWE проводилась с зондом, расположенным под углом 90° к мышце, на глубине 1–2 см. Область интереса (ROI) была установлена на уровне 0,5 × 0,5 см, и за каждый измерение было получено десять кадров. Итоговое значение жесткости представляло среднее значение трёх действительных измерений. Фиксировалась скорость сдвиговой волны (SWV); Зелёный контроль качества показывал действительные изображения11.

МРТ-обследование
МРТ проводилось с использованием сканера 7.0T с последовательностью с подавлением жира T2 и животно-специфической катушкой. Параметры захвата были следующими: время повторения (TR) 3 800 мс, время эхо (TE) 72 мс, толщина среза 1 мм, размер вокселей 0,1 × 0,1 × 1 мм, матрица 256 × 256, поле зрения (FOV) 25,6 × 25,6 мм, четыре средние значения сигнала и респираторная система. Область поражения измерялась с помощью программного обеспечения для обработки изображений.

Гистологическое окрашивание
HE окрашивание проводилось через последовательную депарафинизацию, регидратацию, окрашивание гематоксилином в течение 5 минут, промывание в проточной воде, дифференцировку в 1% соляной кислоты-этаноле в течение 30 секунд, окрашивание эозином в течение 2 минут, обезвоживание, очистку и монтаж. В качестве визуального контрольного пункта окрашенные участки показывали синие ядра и красную цитоплазму.

Окрашивание Nissl проводилось путём депарафинизации, регидратации, инкубации в толуидиновой синей температуре 0,1% при температуре 50-60 °C в течение 30 минут, затем промывания дистиллированной водой, дифференцировки этанола, обезвоживания, очистки и монтажа. В качестве визуального контрольно-пропускного пункта в фиктивной группе явно наблюдались тёмно-синие тела Nissl.

Быстрое окрашивание Luxol в сине-кресил-фиолетовый цвет проводилось путём депарафинизации, регидратации, инкубации в Luxol fast blue при 60 °C в течение 2 час, промывания 95% этанола, дифференцировки в карбонате лития в течение 30 секунд, затем дифференцировки 70% этанола, контрокрашивания кресил-фиолетовой в течение 10 минут, обезвоживания, очистки и монтажа. Рабочая концентрация кресил-фиолетовой составляла 0,1%. В качестве визуального контрольного пункта в фиктивной группе наблюдался тёмно-синий миелин.

Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание проводилось, начиная с депарафинизации, регидратации и забора антигена с использованием цитратного буфера (pH 6,0) при 95 °C в течение 20 минут. Срезы обрабатывались перекисью водорода 3% в течение 10 минут, затем блокировали 5% BSA при 37 °C в течение 1 часа. Первичные антитела инкубировали ночью при 4 °C (ASC: 1:500; Каспаза-8: 1:400; RIPK3: 1:500). После промывания PBS-T (0,1% Tween-20, 3 x 5 минут) секции инкубировали с вторичными антителами, маркированными HRP (1:1000) при 37 °C в течение 1 часа. Затем применялась маркировка флуорохромом: YTR520 Plus для ASC, TYR570 Plus для Caspase8 и TYR690 Plus для RIPK3 (30 мин), после чего DAPI — ядерное окрашивание в течение 5 минут. Были установлены слайды, а визуализация проводилась с использованием флуоресцентного микроскопа, установленного на экспозиции 500 мс, усилении 1,0, увеличении ×200, с фильтрами, соответствующими соответствующим флюорохромам.

Для ксилола и этанола все операции проводились в выхлопной вытяжке, а во время использования носили перчатки и очки. Для окрашивающих реагентов прямой контакт с кожей строго избегался. Все реагенты для отходов утилизировались в специально отведённых контейнерах для опасных отходов. Для биологических опасных материалов перед окончательной утилизацией проводилась тщательная стерилизация автоклава, чтобы предотвратить потенциальное биологическое загрязнение.

Статистический анализ
Односторонний ANOVA с пост-хок тестом ЛСД использовался для сравнения групп. P < 0,05 считался статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Музыка BBB
Балл BBB по фиктивной группе составил 21,00 ± 0,00, что значительно выше, чем у модели (5,8 ± 1,1, P < 0,001). Баллы BBB, зависящие от дозы GLGZ: высокая доза (10,6 ± 1,3, P < 0,001), средняя доза (8,5 ± 1,2, P = 0,003), низкая доза (7,1 ± 1,0, P = 0,028) по сравнению с моделью (Рисунок 1).

Анализ жёсткости прямой мышцы бедра с помощью эластографии сдвиговых волн
Эластография сдви...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании систематически оценивались улучшение эффекта GLGZ на мышечную спастичность у крыс с ТСМ и изучена его связь с нейропротективой и ПАНоптозом. Результаты показали, что GLGZ может улучшать показатели BBB и снижать мышечную скованность у крыс с ТСМ в зависимости от дозы. Исследование также показало, что механизм действия GLGZ может быть связан с нейропротекцией, восстановлением миелина и ингибированием PANoptosis. В настоящее время клинические фармакологические методы леч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

Эта работа была профинансирована крупным научно-исследовательским проектом провинциальной комиссии здравоохранения провинции Фуцзянь (2024ZD01006), открытым проектом Клинического исследовательского института в 2023 году (LC2023001-институт), Фондом естественных наук провинции Фуцзянь (2024J01733), Исследовательским проектом медицинских инноваций Комиссии здравоохранения Фуцзянь (2022CXA052), проектом по набору лидеров на основе списков крупных инновационных проектов в области науки и технологий в Фуцзянском университете традиционной китайской медицины (XJB2022003-3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Безводный этанол 240403A1 Обезвоживание
Безводный этанол 241101A1Окрашивание
Антифлуоресцентное ослабленное пленочное покрытие (содержащее DAPI) MA0221   Иммунофлуоресцентное окрашивание
Антитела ASCBs-6741RАнализ ПАНоптоза (1:300)
Антитело Каспазы-813423-1-APАнализ ПАНоптоза (1:400)
Флуоресцентный микроскоп  NIKONЭКЛИПСЕКи-L 
Полностью автоматический цифровой стеклянный слайд-сканер  GCell-60Слайд-сканер
набор гематоксилин-эозинR23718Окрашивание гематоксилин-эозином (HE)
Программное обеспечение для анализа изображенийNIHImageJ 1.53k
Luxol Fast BlueR23193Luxol Fast Blue-Cresyl-Violet Staining
МРТ-сканерBruker7.0T
Набор для окрашивания множественной флуоресценцией;240522  Иммунофлуоресцентное окрашивание
Набор для окрашивания миелоидов  G3245 Миелоидное окрашивание 
Neutral  бальзам   MB9899 Крепление после окрашивания
Набор для окрашивания NisslR23093 Окрашивания в Ниссле
Антитела к RIPK3Bs-3551RАнализ ПАНоптоза (1:400)
SPSS 22.0программное обеспечение для статистического анализа 
Крысы Спраг-Доули Биотехнологическая компания Hangyi в Фучжоу
Винная кислота, триполифосфат натрия10019418Окрашивание
Ультразвуковая системаSIEMENS Acuson Зонд с линейной решеткой (18L6)
Ксилол240904A2Окрашивание

Ссылки

  1. Sezer, N., Akkuş, S., Uğurlu, F. G. Chronic complications of spinal cord injury. World J Orthop. 6 (1), 24(2015).
  2. Quadri, S. A., et al. Recent update on basic mechanisms of spinal cord injury. Neurosurg Rev. 43, 425-441 (2020).
  3. Huang, H., et al. Clinical neurorestorative therapeutic guidelines for spinal cord injury (IANR/CANR version 2019). J Orthop Transl. 20, 14-24 (2020).
  4. Li, P., et al. PANoptosis: cross-talk among apoptosis, necroptosis, and pyroptosis in neurological disorders. J Inflamm Res. 2025, 8131-8140 (2025).
  5. Lou, J., et al. TRIM56 modulates YBX1 degradation to ameliorate ZBP1-mediated neuronal PANoptosis in spinal cord injury. Adv Sci. 11 (42), 2407132(2024).
  6. Lu, Y., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine for treatment of spinal cord injury. Biomed Pharmacother. 127, 110136(2020).
  7. Application of Gualou Guizhi decoction in treatment of post-stroke spasm. Chinese Patent. , CN201210254594.X (2012).
  8. Huang, J., Tao, J., Xue, X., et al. Gua Lou Gui Zhi decoction exerts neuroprotective effects on post-stroke spasticity via modulation of glutamate levels and AMPA receptor expression. Int J Mol Med. 31 (4), 841-848 (2013).
  9. Han, J., et al. Gualou Guizhi decoction promotes neurological functional recovery and neurogenesis following focal cerebral ischemia/reperfusion. Neural Regen Res. 13 (8), 1408-1416 (2018).
  10. Yang, Z., et al. Hypoxic-preconditioned mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles promote recovery of spinal cord injury by affecting astrocyte phenotype through the miR-21/JAK2/STAT3 pathway. CNS Neurosci Ther. 30 (3), e14428(2024).
  11. Taş, S., et al. Shear wave elastography is a reliable and repeatable method for measuring the elastic modulus of the rectus femoris muscle and patellar tendon. J Ultrasound Med. 36 (3), 565-570 (2017).
  12. Zhang, Y., et al. Neuroprotective effects of Gualou Guizhi decoction in vivo and in vitro. J Ethnopharmacol. 158, 76-84 (2014).
  13. Wenting, C. H., et al. Effect mechanism of Gualou Guizhi granule on neurological function and synaptic plasticity in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury. Chin Pharm. 35 (16), 1951-1956 (2024).
  14. Chakraborty, A., Sankaran, V., Murugan, R., Chellappan, D. R. Comparative spasmolytic effect between Cinnamomum tamala and Cinnamomum verum leaf essential oils and eugenol through in vitro and in silico approaches. Z Naturforsch C. 76 (9-10), 383-391 (2021).
  15. Li, B., et al. Machine learning and experiments revealed key genes related to PANoptosis linked to drug prediction and immune landscape in spinal cord injury. Mol Neurobiol. 62 (6), 7364-7379 (2025).
  16. Wang, L., et al. Mechanisms of PANoptosis and relevant small-molecule compounds for fighting diseases. Cell Death Dis. 14 (12), 851(2023).
  17. Yang, J., Zhu, X., Hu, H., Lin, X. The inhibitory effect of Gualou Guizhi decoction on post-ischemic neuroinflammation via miR-155 in MCAO rats. Ann Palliat Med. 10 (2), 1370-1379 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Спастичность мышцгранулы Гуалао Гуйчжипрограммируемая клеточная гибельультразвуковая сдвиговая волнамагнитно-резонансная томографиямультиплексная иммунофлуоресценциявосстановление миелинаэкспрессия каспазы-8
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.