Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ формирования колоний для выявления пролиферативной способности клеток остеосаркомы, вызванных LncRNA-knockdown

420 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69910

⸱

16 января 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот экспериментальный протокол обеспечивает стабильный, экономичный и эффективный метод, сочетающий уничтожение LncRNA с анализами на формирование колоний для количественной оценки влияния lncRNA на пролиферацию клеток остеосаркомы.

Аннотация

Экспрессия аномальных длинных некодирующих РНК (lncRNA) сильно влияет на клеточную пролиферацию клеток остеосаркомы, что указывает на их возможность служить потенциальными терапевтическими целями. Однако функциональные исследования lncRNA остаются в основном теоретическими и ограничены несколькими валидациями. Анализы формирования колоний, которые конкретно отражают окончательную пролиферативную судьбу отдельных клеток, считаются золотым стандартом для оценки долгосрочного пролиферативного потенциала. Здесь этот протокол установил надёжный экспериментальный протокол с использованием анализов формирования колоний в клетках с нокдауном lncRNA для оценки влияния lncRNA на пролиферативную способность клеток остеосаркомы. Этот экспериментальный протокол обеспечивает стабильный, экономичный и эффективный анализ для оценки регуляторного влияния lncRNA на пролиферацию клеток остеосаркомы. Этот подход подходит не только для исследований клеток остеосаркомы, но и служит приемлемым инструментом для улучшения пролиферативной способности клеток, регулируемых lncRNA, у других опухолей. В этом исследовании был разработан подробный протокол обнаружения анализов на knockdown lncRNA и формирование колоний, с примером снижения малого нуклеолярного гена РНК-хозяина 6 (SNHG6) в клетках остеосаркомы (143B). Экспериментальные результаты подтвердили эффективное подавление экспрессии SNHG6, сопровождаемое заметным сокращением как числа, так и размера колоний. Эти данные свидетельствуют о том, что SNHG6 необходим для поддержания долгосрочного пролиферативного потенциала клеток остеосаркомы (143B).

Введение

Длинные некодирующие РНК (lncRNA), определяемые как транскрипты длиннее 200 нуклеотидов без потенциала кодирования белков, в последние годы стали важными регуляторами различных биологическихпроцессов 1,2. Они играют ключевую роль в возникновении и развитии различных видов рака, включая остеосаркому, рак простаты и рак лёгких 3,4,5. При остеосаркоме накопленные данные свидетельствуют о том, что аберрантная длительноя некодирующая экспрессия РНК (lncRNA) оказывает глубокое влияние на клеточную пролиферацию. Например, заглушание LNCRNA POU3F3 значительно подавляло пролиферацию и способствовало апоптозу клеток остеосаркомы (MG63 и U2OS)6. Аналогично, подавление lncRNA HOXA-AS3 уменьшило формирование колоний и замедляло рост в клетках U2OS и SW13537. Учитывая, что неконтролируемое пролиферирование является отличительной чертой биологии рака и важным фактором терапевтических стратегий, разъяснение пролиферации клеток, регулируемых lncRNA, в опухоли, особенно при остеосаркоме, остаётся очень важным и необходимым.

Хотя существует несколько подходов к оценке пролиферации клеток, каждый из них несёт врождённые ограничения. Колориметрические или метаболические анализы, такие как CCK-8 и MTT, удобны, быстры и обладают высокой производительностью. Однако они в основном обеспечивают краткосрочные показания и легко сбивают с толку из-за метаболических флуктуаций, а также имеют дополнительный риск оптических или фотохимических помех от используемыхреагентов 8. Методы, основанные на синтезе ДНК, включая включение BrdU и EdU, обеспечивают большую специфичность, при этом ограничивая моментальные анализы входа в S-фазу без отражения долгосрочных пролиферативныхрезультатов 9,10. Аналогично, иммунокрашивание маркеров пролиферации, таких как Ki-67, указывает только на мгновенную активность клеточного цикла и не предсказывает клоногеннуюемкость 10. Системы мониторинга в реальном времени, такие как RTCA, обеспечивают непрерывный анализ кривой роста с высокой воспроизводимостью, однако их высокая стоимость и ограничение краткосрочной или среднесрочной оценкой снижают ихпрактичность 11. В отличие от этого, клоногенный анализ уникально фиксирует способность одной клетки подвергаться неограниченному пролиферированию и формированию видимых колоний, что напрямую отражает её окончательную судьбу. Несмотря на трудоёмкость и трудоемкость, клоногенный анализ остаётся золотым стандартом для оценки долгосрочного потенциала пролиферативного развития, предоставляя данные, недостижимые краткосрочными или суррогатнымианализами 12.

В этой статье представлен подробный протокол обнаружения анализов на knockdown lncRNA и формирование колоний, с примером SNHG6-knockdown в клетках остеосаркомы 143B. Этот подход применим не только к исследованиям остеосаркомы, но и служит возможным инструментом для изучения пролиферации, опосредованной lncRNA, у других опухолей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Плазмидная трансфекция

  1. Семя 5 × 105 143B клеток на 10-сантиметровую миску (всего две тарелки), культивировать клетки в полной среде (DMEM + 10% FBS) при 37 °Cв инкубаторе с содержанием CO2 5%.
  2. Через 24 часа приготовьте реагенты для трансфекции, включая плазмиды (shNC и shSNHG6), PEI и Opti-MEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите вихрь и убедитесь, что всё уравновешено до комнатной температуры перед использованием.
  3. Достаньте четыре микроцентрифугных пробирки по 1,5 мл, маркируйте плазмиды (shNC и shSNHG6) и PEI (две трубки) маркерной ручкой.
  4. Добавьте 500 мкл Opti-MEM в каждую трубку.
  5. Добавьте 10 мкг плазмид в плазмидную трубку (shNC или shSNHG6) и 30 мкл PEI (1 мкг/мкл) в каждую PEI.
  6. Аккуратно перемешайте вверх и вниз, инкубуйте при комнатной температуре в течение 5 минут.
  7. Соедините плазмидную трубку и трубку PEI, аккуратно перемешайте и инкубуйте смесь при комнатной температуре в течение 20 минут.
  8. Вынимите 143B-клетки из инкубатора и аккуратно аспирируйте культурную среду. Добавьте в каждое блюдо 7 мл безсывороточной среды. Маркируйте тарелки, чтобы указать плазмиды для добавления (143B shNC или 143B shSNHG6).
  9. Добавьте заранее подготовленную смесь для трансфекции по капле в соответствующую чашу для культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте смесь медленно, используя пипетку круговыми движениями, и равномерно наливайте от внешнего края к центру блюда. Инкубировать при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2.
  10. Через 8-12 часов спишь супернатант и добавь 10 мл полного DMEM-среды в каждую 10-сантиметровую миску для культуры. Инкубировать клетки при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2 .
  11. Наблюдайте под флуоресцентным микроскопом через 72 часа после того, как супернатант отброшен и заменён полным DMEM-средой.

2. Анализ формирования колоний

  1. Удалите среду из 10-сантиметровой посевной чашки (shNC и shSNHG6), добавьте 1,5 мл трипсина-EDTA для переваривания клеток, аккуратно пипеттуйте для их отделения, а затем добавьте 5 мл полной среды, чтобы прекратить пищеварение.
  2. Перенесите суспензию ячейки в микроцентрифугную трубку объёмом 15 мл.
  3. Уберите 20 мкл суспензии ячеек и подсчитайте номера ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчёт ячеек необходимо выполнять несколько раз, чтобы обеспечить согласованность номеров ячеек в группе shNC и группы shSNHG6. Здесь мы собираем 3 × 105 клеток для RT-PCR проверки эффективности SNHG6.
  4. Семена 2 × 10— 3 клетки на одну скважину в пластине из 6 колодц. Добавьте полную среду DMEM в итоговый объём 2 мл и культивируйте клетки при 37 °C в инкубаторе с содержаниемCO2 5%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заменяйте средний носитель на свежий, полный DMEM через день.
  5. Ежедневно следите за формированием колонии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заканчивайте культуру, когда большинство колоний контрольной группы (shNC) содержат ≥50 клеток, или после 10-14 дней инкубации, в зависимости от того, что наступит раньше.
  6. Вынимите клетки из инкубатора и выбросьте супернатант.
  7. Промывайте клетки дважды с 1 мл PBS на каждую скважину и выбрасывайте PBS после каждой промывки.
  8. Фиксируйте ячейки с 1 мл раствора 10% формалина на 15 минут, затем отбрасывайте 10% раствор формалина.
  9. Промывайте клетки дважды с 1 мл PBS на каждую скважину и выбрасывайте PBS после каждой промывки.
  10. Покрасьте клетки 1 мл раствора 0,5% кристаллического фиолетового окрашивания в течение 10-30 минут, затем сбросьте раствор для окрашивания.
  11. Аккуратно промывайте клетки медленно текущей водопроводной водой.
  12. Клетки сушат на воздухе при комнатной температуре.
  13. Снимайте с помощью камеры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для оценки влияния lncRNA SNHG6 на пролиферативную способность клеток остеосаркомы мы успешно создали плазмидно-опосредованную систему knockdown и провели анализы формирования колоний. Экспериментальный процесс включал трансфекцию плазмидных клеток 143B и анализ формирования колоний (рисунок 1).

Эффективность трансфекции клеток 143B была подтверждена флуоресцентной микроскопией через 72 часа после трансфекции (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Терапевтическое воздействие на связанные с раком lncRNA, а также использование их диагностической полезности как биомаркеров, представляет собой новый подход в управлении раком. Определение роли lncRNA в патогенезе остеосаркомы имеет решающее значение для продвижения их диагностики, терапии и прогноза.

Необходимо выполнить критически важные шаги для обеспечения успеха этого анализа. Во-первых, установление суспензии на одной клеточке является абсолютным услови...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук (82174408, 82374477, 82474535 и 82205145).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
МИКРОТРУБКИ ОБЪЕМОМ 1,5 млMerckAXYMCT150C
10% нейтральный буферизованный формалинVICTREX5205000
100 - 1000 и миль; L Extended Graded Blue TipsShanghai BioScience Co., LtdBS10401ML
Лаборатория 100-мм клеточных культивных тарелокWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd704001
143BATCCATCC CRL-8303TM
Центрифуга на 15 млShanghai BioScience Co., LtdBL2002150
6 Клеточная культивативная пластинаWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd703001
CO2 инкубаторThermo Fisher Technology (China)Co., Ltd.300583057
Кристал ФиолетоваяTCI ШанхайC0428
Среда DMEMКОРПОРАЦИЯ WISENT319-005-CL
Eppendorf Research plusЭппендорф3123000233
FBS — превосходное качествоКОРПОРАЦИЯ WISENT086-150
Марк пеномZebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. YYST5
Opti-MEMGibco31985070
ПАСТЕР ПИПЕТТLabgicBS-XG-O3L
Буфер PBS (сухой порошок)LabgicBL601A
PEIПолинауки24765
Кончики пипетокMerckAXYT200Y
Фермент TrypLE ExpressGibco12604021
Трипсин/ЭДТАGibcoR001100

Ссылки

  1. Chen, N., et al. IAV inhibits the host antiviral defense mediated by LncRNA-LRIR to enhance viral replication. Int J Biol Macromol. 322 (Pt 1), 146665(2025).
  2. Zhu, J., Mo, Y. Y., Peng, W. X. RNA binding protein-mediated competing endogenous RNA mechanism in cancer. Gene. 963, 149606(2025).
  3. Zhang, Y., et al. KIAA1429-mediated ZFPM2-AS1 m(6)A modification promotes the proliferation, migration and invasion of osteosarcoma cells. Oncol Lett. 30 (4), 453(2025).
  4. Oh, M., Kadam, R. N., Charania, Z. S., Somarowthu, S. LncRNA SChLAP1 promotes cancer cell proliferation and invasion via its distinct structural domains and conserved regions. J Mol Biol. 437 (19), 169350(2025).
  5. Wang, G., et al. TBX5-AS1 induces ER stress and suppresses lung cancer growth and tumor stemness via the miR-494-3p/ATF6 axis. Cell Stress Chaperones. 30 (6), 100113(2025).
  6. Xu, S., et al. lncRNA POU3F3 promotes osteosarcoma progression through GPX4-modulated ferroptosis by interaction with IGF2BP2 to facilitate NRF2 mRNA stability. Genes Dis. 12 (5), 101439(2025).
  7. Li, R., et al. LncRNA HOXA-AS3 promotes cell proliferation and invasion via targeting miR-218-5p/FOXP1 axis in osteosarcoma. Sci Rep. 14 (1), 16581(2024).
  8. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, Limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. Int J Mol Sci. 22 (23), (2021).
  9. Harris, L., Zalucki, O., Piper, M. BrdU/EdU dual labeling to determine the cell-cycle dynamics of defined cellular subpopulations. J Mol Histol. 49 (3), 229-234 (2018).
  10. Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. J Invest Dermatol. 136 (1), e1-e7 (2016).
  11. Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicol Rep. 7, 335-344 (2020).
  12. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  13. Brix, N., Samaga, D., Belka, C., Zitzelsberger, H., Lauber, K. Analysis of clonogenic growth in vitro. Nat Protoc. 16 (11), 4963-4991 (2021).
  14. Rajendran, V., Jain, M. V. In vitro tumorigenic assay: Colony forming assay for cancer stem cells. Methods Mol Biol. 1692, 89-95 (2018).
  15. Guzman, C., Bagga, M., Kaur, A., Westermarck, J., Abankwa, D. ColonyArea: An ImageJ plugin to automatically quantify colony formation in clonogenic assays. PLoS One. 9 (3), e92444(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

SNHG6RT qPCR
Анализ формирования колоний для выявления пролиферативной способности клеток остеосаркомы, вызванных LncRNA-knockdown
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.