Method Article

Гидрогели на основе полиакриламида ZrOH для пространственно разрешённого отбора проб карбоксилатов, выделяющихся из корней, растущих в почве

DOI:

10.3791/69921

⸱

April 24th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Agricultural, Environmental and Food Sciences, Free University of Bolzano, 2Competence Centre for Plant Health, Free University of Bolzano, 3Institute of Plant Nutrition, Justus Liebig University Giessen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе мы подробно описываем использование гидрогелей полиакриламида циркония гидроксида (гидрогелей ZrOH) как неразрушительного, in-situ метода отбора проб карбоксилатов из корней из целых корней, выращенных в почве, на различных стадиях развития культур. Также описывается последующее локальное картирование и количественная оценка этих карбоксилатов с помощью ионной хроматографии-масс-спектрометрии (IC-MS).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отбор проб и достоверная количественная оценка корневых выделений из нетронутых корней растений, выращенных в почве, остаются сложными. Мы также разработали неразрушительный метод отбора проб, двумерного картирования и количественной оценки семи карбоксилатов (аконитат, цитрат, фумарат, лактат, малат, оксалат, сукцинат), выделяемых из корней растений, выращенных в ризобоксе. Описанный здесь метод использует гидрогели полиакриламида циркония гидроксида (гидрогели ZrOH), которые поглощают все испытанные карбоксиляты и могут быть элюированы с эффективностью от 95,3% ± 3,12% до 111% ± 1,99%. Гидрогели ZrOH обладают высокой способностью связывания карбоксилатов — до 1,82 мкмоль см-2, в зависимости от pH раствора и видов карбоксилата, что превышает концентрацию, обычно присутствующую в ризосфере. Кроме того, связанные карбоксиляты на гидрогелях ZrOH остаются стабильными и могут храниться несколько недель при температуре 4 °C перед анализом. Для применения растения культивируют в корневенных корневых корнеплодах в течение 24 часов. После извлечения гидрогелей ZrOH их разрезают для картирования, а детали геля элюируются для последующего анализа карбоксилата (например, с помощью ионной хроматографии-масс-спектрометрии). Наши результаты показывают, что гидрогели ZrOH эффективны для захвата и определения концентрации карбоксилатов в ризосфере. Новизна этого метода заключается в его способности брать образцы корневых выделений из целостных корней растений, выращенных в почве, а также в возможности временного отбора проб по сравнению с традиционными методами (гибридный подход почвы и гидропоны), которые часто бывают разрушительными и позволяют брать пробу только за один раз. Самое главное — он позволяет создавать количественные, высокоразрешающие двухмерные изображения в миллиметровом масштабе, облегчая визуализацию эксудации карбоксилата вдоль оси корня и её пространственного распределения внутри ризосферы. Кроме того, этот метод облегчает отбор проб корневых эксудатов на различных стадиях роста в течение цикла роста.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Корни растений выделяют различные соединения в ризосферу, формируя их физические, химические и биологическиесвойства 1. Когда растения подвергаются воздействию абиотических и биотических стрессовых условий, особенно активируется выделение корней. Корневые выделения могут фактически влиять на доступность и мобилизацию питательных веществ и металлов, микробные сообщества и активность, стабильность почвенных агрегатов и защиту растений от патогенов прямо иликосвенно 1,2,3. Среди наиболее важных корневых эксудатов — карбоксиляты, связанные с их ролью в растворимости питательных веществ (включая фосфор (P), железо (Fe), медь (Cu) и цинк (Zn)), толерантность к тяжёлым металлам и усиление полезных микроорганизмов вризосфере 2,3,4,5.

Особенно выделяются карбоксиляты цитрат, лактат, оксалат, малат, сукцинат ифумарат 6,7,8. Например, цитрат играет важную роль в получении P, мобилизуя P, связанный с Fe или алюминия (Al)(гидро)оксидами 7,9. Однако точная отбор проб и количественная оценка корневых эксудатов из почвенных растений остаётся экспериментальной задачей, главным образом из-за трудностей получения физического доступа к нетронутым почвенным корневым системам и получения образцов корневых экссудатов10,11. Кроме того, экспозиционные соединения быстро подвергаются микробной деградации (в течение нескольких минут или часов)12 и сильно адсорбируют минеральные поверхностипочвы 1,10. Ещё одной проблемой в исследованиях эксудации корней является мониторинг эксудации со временем, поскольку большинство методов сбора нарушают корни или требуют сбора растений, выращенных в почве, что затрудняет повторную оценку того же корня 1,11. Поэтому точный отбор проб, количественная оценка и мониторинг корневых эксудатов требуют техники, фиксирующей пространственные вариации и способствующую повторному отбору проб во время ростарастений 11.

В текущем исследовании мы представляем неразрушительный, in-situ метод, изначально разработанный для цитратов Тициани и др.12, который теперь дополнительно усовершенствован и применён для отбора проб, точной пространственной локализации и количественной оценки шести дополнительных карбоксилатов (аконитат, фумарат, лактат, малат, оксалат и сукцинат), выделяющихся из целостных корней растений, культивируемых в почве в ризобоксах. Метод использует полиакриламидные гидрогели на основе гидроксида циркония (гидрогели ZrOH) для отбора проб корневыхэксудатов 13. Гидрогели ZrOH обладают сильной способностью к связыванию анионов (включая карбоксиляты), которые легко элюируются 12,13,14. Гидрогели ZrOH (1) позволяют брать образцы корневых карбоксилата из корней растений, выращенных в почве, просто размещая гидрогель на корневой системе с минимальными возмущениями, (2) обеспечивают эффективную защиту связанных карбоксилятов от микробной минерализации не менее 6 недель, (3) пространственное распределение карбоксилатов в ризосфере сохраняется при их связывании с гелем, и (4) позволяют 2D-картографирование карбоксилатов на миллиметровоммасштабе 12.

Существующие методы отбора корневых экссудатов классифицируются как почвенные методы из выращенных в почве (например, промывка корней или гибрид почвы и гидропоники, устройства сборщика экссудата почвы и корней (SOIL-REC), микроприсоски, фильтрующие бумаги/агарные листы, эксудационные ловушки и техника RHIZOtest), либо гидропонные методы отбора проб экссудата. Метод промывания корней или гибрид почвы и гидропоники включает аккуратное удаление всего растения из почвы, промывку корневой системы и погружение в пробный раствор для сбора корневыхэкссудатов 15. Это наиболее часто используемый метод отбора экссудатов из почвенных растений благодаря своей простоте. Однако удаление корней из почвы несёт риск потери корневых волосков и более тонких корней. Кроме того, требуется тщательная очистка корней, что может повредить корни, ухудшить качество и количество корневых экссудатов и исключить временное отборпроб 8,11. Метод SOIL-REC предполагает выращивание растений в специально разработанной системе ризобокса с корнями, растущими между двумя пористыми нейлоновыми сетками (≤ 30 мкм), а также сбор корневых экссудатов с помощью инструмента для сбора корневых экссудатов16,17. Этот подход сохраняет корневую систему, минимизирует загрязнение почвы и позволяет многократно собирать корневые экссудаты. Однако у него сложная конструкция (с небольшим количеством реплик), более высокая разбавленность эксудатов из больших объёмов, используемых для дискретизации, и всё равно требуется оптимизация, так как воспроизводимость сложна, а междурепликами 8 существуют огромные различия.

Нанесение мелких кусочков смол, листов агар-геля или фильтрующей бумаги, способных уравновеситься с окружающим раствором или адсорбировать, выделяется на интересующих корневых сегментах доступных целых корней, выращенных в почве корней (например, с использованием ризобоксов или корневых окон)18,19. Этот метод позволяет временно отбирать пробу и частично измерять локализованный состав экссудата, хотя и с низким пространственным разрешением. С другой стороны, он подвержен воздействию артефактов микробной минерализации и неудобен в обращении. Аналогично, экссудатные ловушки используются для отбора корневых эксудатов из отдельных корневых сегментов, где один корень задерживается в горизонтальных боковых камерах, с герметичными кольцами из плексига, содержащими раствор для отбора проб, которые расположенылокально 8. Метод применим как к гидропонным, так и к почвенным корням и позволяет локализованно отбиратьпробу 12. Однако при небольших объёмах собираются пробы с временным разрешением практически невозможно, а выделение отдельных корней подвержено механическому напряжению, что может повлиять на метаболизм и экссудациюкорней 8. Микроприсоски используются для сбора почвенного раствора в ризосфере, что позволяет проводить отбор проб на месте из выращенныхкорней 20. Однако собираются небольшие объёмы, отбор проб частично разрешается по времени, а эксудаты подвержены адсорбции и разложению микроорганизмов16. Метод RHIZOtest предполагает гидропонное выращивание корней в небольших цилиндрах, при этом дно покрыто нейлоновой сеткой толщиной 30 мкм, а затем их перенос на почвенный диск, обеспечивая обмен растворёнными веществами между корнем ипочвой 8,21,22. Экссудаты собираются путём погружения корневой коврик в пробный раствор. Этот метод сохраняет контакт с корнями и почвой, но использует искусственные условия роста. Он ограничен краткосрочных экспериментами и не имеет временного отбора проб. Среди этих методов можно использовать только смолы, листов агар-геля, фильтрующую бумагу, эксудационные ловушки и микроприсоски для определения пространственных паттернов экссудации.

Методы гидропонного отбора проб экссудата охватывают гидропонику и полугидропоникные методы. Гидропоника — это часто используемый и простой метод сбора корневых экссудатов, при котором растения выращивают в питательном растворе, который затем заменяют пробным раствором (H2O, CaSO4, CaCl2, микропур) для получения образцовэкссудата 15,23. Метод прост и создаёт минимальное механическое напряжение на корни. Он высоковоспроизводимый и стерилен при необходимости, что повышает качество корневых экссудатов и позволяет временно разрешать отбор проб 5,16. Тем не менее, это высоко искусственная система, способная изменять физиологию, морфологию растений (например, развитие корневых волосков) и процессы экссудациикорней 6,15. В полугидропонике растения культивируют на стеклянных шариках, песке или вермикулите с непрерывно перколингующим питательным раствором, а эксудаты собираются в перколяторномрастворе 8,18. Этот подход немного менее искусствен, чем гидропоника, и позволяет отбирать пробы с временным разрешением. Однако система почти полностью насыщена водой, поэтому требуется растения, устойчивые к частично анаэробным условиям.

По сравнению с альтернативными методами, метод гидрогеля ZrOH обладает рядом преимуществ. Гидрогели ZrOH позволяют брать пробные эксудаты корней в почвенной культуре (близко к естественным условиям) с минимальным воздействием корневой системы, отбор проб с временным разрешением в течение жизненного цикла растения, а сбор корневых эксудатов более 24 часов возможен благодаря снижению разложения микроорганизмов и высокой способности к связываниюкарбоксилата 12. Кроме того, для пробы и сохранения гидрогелей не требуется биоцид (например, микропур,NaN 3), что в долгосрочной перспективе может повлиять на аналитический прибор и мешать химическому анализу. Это связано с тем, что карбоксиляты химически связаны с гидрогелем ZrOH. Кроме того, образцы могут храниться от нескольких недель до месяцев до анализа, поэтому можно собрать множество образцов из одной экспериментальнойустановки 12, что можно объяснить антимикробными свойствами Zr вгидрогеле 24,25. Кроме того, гидрогели ZrOH позволяют 2D-миллиметровое картографирование выделенных соединений и других анионов в ризосфере, с возможностью отбора проб всей корневойсистемы 12,14,26. Гидрогели ZrOH занимают меньше места в холодильнике (4 °C) по сравнению с большими объёмами, требуемыми классическими методами, которые обычно хранятся в морозильнике (-20 °C). Основное ограничение — привыкнуть к производству высококачественных гидрогелей ZrOH с минимальным количеством или отсутствием пузырьков воздуха, а также то, что ризобоксы остаются системами искусственной среды для выращивания. Ещё одним ограничением является то, что метод был разработан только для семи карбоксилатов (аконитат, цитрат, фумарат, лактат, малат, сукцинат и оксалат)12, сульфониламидов (сульфадиазин, сульфаметазин, сульфахлорпиридазин и клиндамицин)27 и неорганических анионов (сульфиды и оксианионы P, V-ванадия, ас-мышьяк, Se-селен, мо-молибден, Sb-сурьма)14,26,28,29. Гидрогель ZrOH также использовался в сочетании с реагентом взвешенных частиц — иминодиацетовой кислотой для отбора проб и картирования катионов на месте (Al, Fe, Ca-кальций, Mg-магний, Mn-марганец, Ni-никель и Zn-цинк) в ризосфере 28,29,30.

Здесь мы предлагаем метод на основе гидрогеля ZrOH, позволяющий временно и пространственно разрешённый in-situ отбор проб карбоксилатов из корневой системы, выращенной в почве. Мы подробно описываем процесс проведения эксперимента с ризобоксом, включая отбор проб и двумерное картирование корневых эксудатов с использованием гидрогелевой техники ZrOH. Он охватывает подготовку гидрогеля, заполнение ризобокса, культивацию растений, нанесение гидрогеля, извлечение и резку, элюирование карбоксилата из гидрогеля и анализ, а также последующий двухмерный анализ изображений. Кроме того, приводятся заметки по критическим этапам, таким как анализ карбоксилата с использованием ионной хроматографии-масс-спектрометрии (IC-MS).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка гидрогеля ZrOH

ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления геля необходимы чистая среда и материалы, чтобы избежать загрязнения. При приготовлении растворов, промывании гелем и гидратации используйте только лабораторную воду первого класса (≤18 МΩ·см) для обеспечения качества. Убедитесь, что контейнеры с токсичными отходами (жидкие и твёрдые) уже помещены в вытяжку перед началом подготовки гидрогеля. Перед началом подготовки гелей нагрейте духовку примерно до 42─45 °C в течение 1 часа. Подробности о материалах и химикате приведены в таблице материалов.

  1. Подготовка стеклянной сборки
    1. Подготовьте 10% (w/v) кислотную ванну с HNO₃, добавив 153,8 мл 65% HNO₃ до 846,2 мл лабораторной воды первого класса в выхлопной вытяжке.
    2. Замочите стеклянные пластины (6,1 x 17 см), пинцеты, тефлоновые U-образные прокладки (0,25 мм или 0,4 мм) и пластиковые зажимы в кислотной ванне не менее 4 часа.
    3. Вынимите стеклянные пластины, пинцеты, пластиковые зажимы и тефлоновые прокладки из кислотной ванны, а затем как минимум три раза промойте лабораторной водой первого класса. Затем дайте им тщательно высохнуть на воздухе в ламинарном потоке или чистом столе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные пластины следует готовить в тот же день, что и гель, и избегать их сушки бумагой, чтобы минимизировать загрязнение.
    4. Поставьте проставку в форме буквы «U» на сухую стеклянную пластину, добавьте вторую и закрепите их вместе с помощью зажимов. Сместите стеклянные пластины примерно на ~1 мм, чтобы упростить пипетирование (см. рисунок 1A).
    5. Перед отливкой гелевого раствора положите стеклянную пластину на чистую пластиковую фольгу под капюшон плёнки.
  2. Полиакриламидная гель-подготовка31
    1. Гель-раствор: Приготовьте гелевой раствор объёмом 100 мл, смешав 15 мл диффузионных градиентов в тонких пленках (DGT) гелевого сшивателя с лабораторной водой первого класса 47,5 мл в чистом пластиковом флаконе, затем добавьте 37,5 мл акриламида (40%). Тщательно перемешайте смесь при добавлении каждого раствора. Гелевый раствор можно хранить в холодильнике (4 °C) не менее трёх месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы пипетируете и взвешивают правильное количество каждого раствора и используйте только акриламидный раствор без бисакриламида, так как он образует мягкие гели при размещении в буфере 2-(N-морфолино)-этансульфоновая кислота (MES).
    2. Приготовьте раствор персульфата аммония (APS) с 10% (w/v), растворив 0,1 г APS в 1 г H2O. Готовьте раствор свежим каждый день и убедитесь, что он полностью растворён перед использованием.
    3. Приготовьте гелевый коктейль, смешав гелевой раствор объёмом 4 мл с 28 мкл 10% APS, а затем добавьте 10 мкл 99% N,N,N'N-тетраметилэтилендиамина (TEMED) в чистые пластиковые флаконы. Перемешайте после добавления каждого раствора. Раствор можно приготовить для до 3 гелей по мере быстрого полимеризации смеси. Объём коктейля можно регулировать в зависимости от размера используемых пластин и прокладок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пузырьков и пенения при смешивании различных реагентов.
    4. Медленно пипетируйте гелевую смесь между стеклянной пластиной от середины, как показано на рисунках 1B,C26. Если есть воздушные пузырьки, удалите их, аккуратно наклонив стеклянную конструкцию или постучая по стеклянным пластинам ручкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить гели без пузырьков, избегайте использования поцарапанных стеклянных пластин и храните их в кислотной ванне после использования, промывая только перед следующим использованием, а не храните в полиэтиленовых пакетах. Используйте пипетку 1 мл или 5 мл с небольшим наконечником, чтобы отлить гель и медленно добавлять гелевый коктейль от центра, чтобы он равномерно распределялся при наклоне пластин под углом 45°.
    5. Поместите сборку в предварительно нагретую духовку и поддерживайте температуру 42─46 °C не менее 1 часа, чтобы гель полностью застыл (жидкость не капает капель).
    6. Аккуратно выдержите сборку с помощью чистого, безржавого лезвия бритвы по углам и смойте гели со стеклянных пластин водой лабораторного класса I в бутылке для стирки (рисунок 1D–F). Для удобства удаления геля замочите его в воде на несколько минут, а затем смойте в стакан объемом 1 л с лабораторной водой первого класса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте вытягивания геля пинцетом, чтобы он не прилип к пластине, это может привести к деформации геля. После полимеризации видимые пузырьки обычно расположены между гелем и стеклянной пластиной, а не внутри самого геля, что становится прозрачным после снятия пластины.
    7. Меняйте воду не менее 3–4 раза в течение 24 часов после гидратации (желательно с интервалом в 2 часа после приготовления) для смывания оставшихся химикатов полимеризации. При многократной замене воды во время гидратации выведут примеси, такие как нереагированные реагенты, и pH снижается, предотвращая накопление заряда внутри геля.
    8. Храните гели в воде лабораторного класса I (на короткий срок примерно 24 часа) или в холодильнике с содержанием 0,01 моль L-1 NaCl или NaNO3 в холодильнике (4 °C), если гель-листы не используются сразу для осадков ZrOH. Эти гели можно хранить в NaCl до 1 месяца до выпадения осадков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем осаждать гели сразу после полимеризации, чтобы минимизировать загрязнение, которое может появиться во время мойки.
  3. Осаждение гелейZrOH 14
    1. Растворить 3,22 г октагидрата оксида циркония дихлорида (ZrOCl2,8H 2O) в 40 мл лабораторной воды первого класса в пластиковом стакане объёмом 250 мл.
    2. Разместите до 4 листов геля и заполните до 100 мл. В качестве альтернативы растворите 1,66 г ZrOCl2,8H 2O в 20 мл лабораторной воды первого класса, нанесите 2 геля и заполните до 50 мл.
    3. Замочите гель-листы не менее чем на 2 часа, чтобы обеспечить равномерное распределение Zr в гелях.
    4. Переместите каждый гель в 100 мл с 0,05 моль L-1 2-(N-морфолино)-этансульфоновая кислота (MES), буферированную при pH 6,7 (pH регулируется с 1 молем L-1 NaOH) для осадка. Аккуратно перемешайте гель пинцетом в первые 30–60 секунд, чтобы получить однородное осадко.
    5. Аккуратно встряхивайте на шейкере при ≤100 об/мин в течение 40 минут для полного осадка Zr(OH)4 в геле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительнее более медленное встряхивание, чтобы гели не прилипали друг к другу.
    6. Поместите гели в лабораторную воду класса I в стакан объёмом 1─2 л на 24 часа для удаления клионов и замените воду не менее 3 раз с интервалом2 часа 32 часа. Тщательное удаление Cl- ионов можно проверить, измерив проводимость раствора для промывания или проведя тест на хлориды.
    7. Храните гель в 0,03 моль L-1 NaNO 3 или NaCl, но NaCl предпочтительнее для экспериментов с почвой, так как нитрат быстро усиливает микробную активность почвы и также является важным питательным веществомдля растений 13,32.
    8. Гидрогели ZrOH тестировались до 60 недель (хранятся в холодильнике при 4 °C) и показали, что сохраняют свои характеристики и хорошую эффективность (±10% от целевых значений)32.
  4. Резка гелем
    1. Очистите непоцарапанную пластину из плексигласа, пинцет и острое, безржавое лезвие бритвы. При отсутствии плексигласовой пластины можно использовать любую толстую и прочную стеклянную пластину.
    2. Смочите плексигласную пластину лабораторной водой первого класса, чтобы помочь распределить листы гидрогеля ZrOH.
    3. Разложите лист гидрогеля ZrOH на пластине из плексигласа с помощью пинцета, убедившись, что он лежит ровно и без пузырей. Определите области с отверстиями в листах; эти участки следует избегать при резке.
    4. Точно вырежьте листы гидрогеля ZrOH острым лезвием бритвы до нужного размера. Удаление воды с пластины после резки помогает чётко видеть вырезанные участки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения идентификации сторон при двумерном картировании мы рекомендуем вырезать части гидрогеля ZrOH в трапецию под прямым углом, самая длинная сторона которой находится в левом верхнем углу.
    5. Храните гидрогели ZrOH в лабораторной воде класса I (для краткосрочного хранения и непосредственно перед нанесением геля) или в 0,03 моль L-1 NaNO 3/NaCl для длительного хранения (>24 часа).

2. Настройка эксперимента Rhizobox

ПРИМЕЧАНИЕ: Растения выращиваются в корневищниках, заполненных почвой, которые различаются по конструкции. Рекомендуем использовать ризобоксы с отверстиями внизу или сзади для облегчения полива и обеспечения равномерного распределения воды (см. дополнительный рисунок 1). Подробности о материалах и химикате приведены в Таблице материалов.

  1. Определение наполнения и водоёмкостиRhizobox 26
    1. Проситай почву на воздухе с помощью 2-мм сита и униформируй почву. Мы рекомендуем использовать почву средней текстуры, но также могут применяться песчаные или глинистые при условии определённого обращения (например, тип ризобокса, заполнение, открытие и полив).
    2. Взвесьте все компоненты ризобокса (пустые) вместе с зажимами и пластиковой фольгой и запишите вес ( см. дополнительный рисунок 2C). Добавьте 2–3 дополнительных ризобокса к необходимому числу для определения водоудерживаемости (WHC).
    3. Оцените массу сухой почвы, необходимую для заполнения ризобокса. Обычно ризобокс заполняют до 2 см ниже верхней части. Рекомендуемая объёмная плотность составляет примерно 1,0–1,4 г см-3.
    4. В зависимости от типа ризобокса и удобства обращения, аккуратно заполняйте ризобокс сухой почвой. Во время и после засыпки почву можно выровнять с помощью плоской пластины без уплотнения. Слегка увлажнённая почва также может использоваться для заполнения ризобокса, сохраняя структуру почвы, особенно для мелкотекстурных или тяжёлых глинистых (см. Wagner et al.26 для подробного описания).
    5. Или, если ризобокс заполнен сверху, закрепите пластиковую фольгу на неё, накройте её передней пластиной, а затем зажимите (см. дополнительный рисунок 2A–D).
    6. Для удобства установите мембрану ядра во время заполнения и убедитесь, что она лежит ровно на поверхности. При отборе проб корневых экссудатов требуется мембрана ядрепор.
    7. Запишите вес ризобоксов, заполненных почвой, вместе с зажимами. Вычислите массу сухой почвы (mсухой почвы) для каждого ризобокса, вычитая вес пустых ризобоксов от заполненных почвой, и запишите вес.
    8. Водоёмкость определяется сначала насыщением ризобоксов деионизированной водой, а затем их дренажем в течение ~8 час. Взвесьте ризобоксы и вычислите массу воды (mw), вычитая вес ризобоксов, заполненных почвой, записанных на шаге 2.1.7, от текущего веса. Затем определите WHC (g g-1), деля mw наm сухой почвы, получается соотношение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте ризобоксы, используемые для определения WHC, для фактического картографирования, так как насыщение водой может привести к анаэробии и, соответственно, к окислительно-окислительным артефактам.
    9. Оптимальное содержание воды для большинства растений во время роста должно поддерживаться на уровне 50%─60% WHC (то есть коэффициент WHC, fWHC = 0,5─0,6), в зависимости от типа почвы и вида растения. Оцените количество воды, которую нужно добавить (mw add) в каждый корневищник следующим образом: mw add = WHC xf WHC x mсухой почвы.
    10. Перед посадкой поливайте ризобокс с помощьюmw add. Если поливайте через отверстия, добавьте 5-10 мл воды на поверхность.
    11. Запишите массу политых корневищников, которые необходимы для полива растений во время роста.
  2. Выращивание и управлениерастениями 12,26
    1. Стерилизуйте семена перед прорастанием или посадкой. Обычно их помещают в 70% этанол на 3 минуты, а затем в 1% NaClO на 15 минут, чтобы предотвратить рост грибка. Затем промывайте семена деионизированной водой (примерно 6─7 раза).
    2. Предварительно проращивайте семена между фильтрующей бумагой или прорастающими рулонами, увлажнёнными водой или 0,05 ммоль L−1 CaSO 4 , пока не появится радикул.
    3. Пересадите по одному саженцу в каждую ризобокс, положите его ближе к передней пластине, накройте немного земли и добавьте немного воды.
    4. Оберните ризобоксы в аль-фольгу, чтобы предотвратить фотохимическое восстановление ризосферы, предотвратить рост водорослей и других фотосинтетических микроорганизмов, а также избежать напряжения корней при воздействии света. В качестве альтернативы доступны чёрные передние пластины, которые не пропускают свет и могут использоваться вместо Al foil.
    5. Разместите ризобоксы на стойке, чтобы они были наклонены в камере роста или теплице с контролируемой температурой, относительной влажностью и интенсивностью света. Рекомендуем наклон 25°─35°.
    6. Поливайте ризобоксы гравиметрически не менее 2─3 раза в неделю, в зависимости от потребностей растений. Это делается путем взвешивания ризобоксов с добавлением воды, чтобы компенсировать разницу от веса, зафиксированного в шаге 1.2.11. Однако, когда биомасса растения значительна и потребность в воде увеличивается, биомасса должна учитываться и соответственно корректировать объём полива.
    7. Специфические методы управления культурами (например, удобрение) проводятся в зависимости от экспериментальной установки, характеристик почвы, культивируемых видов растений и преобладающих потребностей в борьбе с болезнями и вредителями во время роста растений.
    8. Период роста и отбор корневых экссудатов во многом зависят от размера корневищ, видов растений и целей исследования.

3. Выборка корневого экссудата 12,26

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы предоставляем подробную информацию о неразрушительной пробе корневых экссудатов. Убедитесь, что все необходимые материалы подготовлены до отбора проб, а экспериментальные заготовки включены во время отбора. Подробности о материалах и химикате приведены в Таблице материалов.

  1. Постепенно за день или не менее чем за 2 часа до отбора пробы доводите содержание воды в ризобоксах до 90%─95% WHC (80% для высокочувствительных культур к кислородному стрессу) за день или как минимум за 2 часа до отбора проб. Это можно точно достичь, сначала рассчитав количество воды для добавления (mw add) на шаге 2.1.9 с использованием 90%─95% WHC, затем пересчитав общий вес ризобокса, влажной почвы и оценив вес растения. Используя баланс, добавьте деионизированную воду, пока ризобокс не достигнет перерассчитанного веса.
  2. Размотайте Al фольгу из корневищницы, определите и нарисуйте интересующую область на передней пластине. Этот шаг необходим только при анализе только корневых сегментов или молодых растений.
  3. Вырежьте пластиковую фольгу и гидрогель ZrOH (см. шаг 1.3) в указанные размеры в зависимости от области интереса и размера ризобокса. Если мембрана нуклеопора не была установлена во время процесса заполнения, разрежьте её до нужных размеров, немного больше, чем у гидрогеля ZrOH.
  4. Поставьте корневищницы на плоскую подставку так, чтобы снимаемая передняя пластина была направлена вверх, и аккуратно откройте их (см. рисунок 2A). Медленно доставайте пластиковую фольгу, следя за тем, чтобы корни и почва не были нарушены.
  5. Разместите линейку на интересующей области и сделайте снимки высокого разрешения, которые понадобятся для последующей обработки данных. Линейка служит эталоном для точного определения размера непосредственно с изображения во время обработки, особенно если требуется выборка многих ризобоксов.
  6. Добавьте небольшое количество воды в целевую область корня, пока на поверхности не появится тонкая водяная пленка (см. рисунок 2B). Более высокое содержание влаги (предпочтительно 90%–95% WHC или 80% для высокочувствительных культур к кислородному стрессу) в почве обеспечивает хороший контакт почвы с гелем при отборе проб. Для постоянного притока молекул к гидрогелю необходимо более высокое содержание влаги.
  7. Поставьте предварительно вырезанную мембрану ядзера непосредственно на интересующую поверхность почвы/корневую область и убедитесь, что она лежит ровно на границе почвы и корней (см. рисунок 2C).
  8. Поместите гидрогель ZrOH прямо и как можно ровнее на мембрану нуклепора в интересующей области и сделайте фото вместе с линейкой, расположенной слева от гидрогеля ZrOH (см. рисунок 2D). Линейка может помочь определить размер гидрогеля ZrOH и, в случае изменений свойств во время отбора, выбранную область, а также определить боковые части при длительном хранении (>1 год).
  9. Защитите гидрогель ZrOH от передней пластины, положив пластиковую фольгу на гидрогель ZrOH (см. рисунок 2D).
  10. Аккуратно закройте ризобокс, чтобы уменьшить движение гидрогеля ZrOH. Минимальное движение гидрогеля ZrOH при закрытии ризобокса также можно достичь, прикрепив сэндвич геля (мембрана нуклепоры + гидрогель ZrOH + пластиковая фольга) к чистой передней пластине ризобокса виниловой изолентой, как описано в Вагнереи др. 26.
  11. Снова оберните ризобокс в аль-фольгу и поместите его обратно в камеру роста/теплицу на 24 часа. Корнеплодные эксудаты можно собирать дольше или реже, при условии, что гель не высыхает, а также в зависимости от экспериментальной установки и целей исследования.
  12. После периода нанесения аккуратно откройте ризокоробку, аккуратно снимите ленту и мембрану, а также достаньте гидрогель. Поместите гидрогель в стерильный герметичный пакет, добавьте несколько капель воды перед закрытием, а затем храните в холодильнике (4 °C) до анализа. Храните пустые гели аналогичным образом как контроль. Для 2D-картирования поднимите гидрогель ZrOH вместе с пластиковой плёнкой и отметьте верх.
  13. Удалите корни и определите морфологические параметры корня, свежий вес и сухой вес для нормализации данных экссудата, если эксперименты с временным разрешением не проводятся.
  14. Если проводятся временные исследования, закройте ризобокс и поместите его обратно в климатическую камеру или теплицу.

4. Элюция и измерениекарбоксилатов 12

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки заготовок и стандартов требуется свежая лабораторная вода I класса и аналитические стандарты высокой чистоты. В качестве обеспечения качества следует использовать сертифицированные стандарты контроля качества. Убедитесь, что растворы (образцы и стандарты) не содержат частиц, фильтруя образцы через нейлоновые фильтры диаметром 0,2 мкм или 0,45 мкм перед анализом, чтобы предотвратить засорение трубок. Подробности о материалах и химикате приведены в Таблице материалов.

  1. Вынимите загруженные и пустые гидрогели ZrOH из холодильника, измерьте размеры с помощью линейки, а затем рассчитайте объём каждого, используя толщину 0,4 мм для прокладки 0,25 мм и 0,64 мм для прокладки 0,4 мм. Для 2D-картирования разрежьте гидрогели ZrOH до нужного размера с помощью чистого лезвия бритвы. Имейте в виду, что нижний предел составляет около 2 x 2 мм из-за трудностей с резкой мелких деталей и обработкой соответствующих объёмов элюции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо линейки используйте миллиметровую миллиметровую бумагу для резки плексигласовой пластины, что облегчает разрезку гидрогелей ZrOH на почти идеальные куски. Толщина гидрогелей ZrOH подтверждена с помощью верньерного суппорта.
  2. Поместите гидрогели ZrOH или ZrOH в пластиковые флаконы, элюируйте их, добавив 0,5 моль L-1 NaOH с соотношением элюента 1 мл на 0,196 см3 ZrOH гидрогеля и встряхивайте на шейкере 24 часа при 150 об/мин.
  3. Если объём элюции невелик при очень маленьком (например, 2 x 2 мм) гидрогеля ZrOH, то добавьте лабораторную воду первого класса по весу, чтобы получить 45-60 мкл, в зависимости от минимального объёма, необходимого для аналитического метода, используемого для количественной оценки карбоксилатов (например, для IC-MS требуется не менее 45 мкл образца для автопромплера, в зависимости от прибора). Запишите точное количество добавленной воды, чтобы увеличить объём до 45-60 мкл, так как это потребуется для коэффициента разбавления и фактического расчёта концентрации.
  4. Отфильтруйте образцы (нейлоновые фильтры 0,2 мкм или 0,45 мкм) и перенесите их в флаконы. Рекомендуем использовать пластиковые флаконы IC объёмом 1,5 мл, так как их можно замораживать без разбивания. Флаконы по 330 мкл также можно использовать для небольших объёмов, но важно следить за отсутствием воздушных пузырьков.
  5. Количественно измерить карбоксиляты в растворе элюирования с помощью предпочтительного аналитического метода (например, IC-MS, HPLC). Рекомендуем их разделение с помощью IC в сочетании с обнаружением MS. Альтернативно, в сочетании с различными детекторами могут использоваться высокопроизводительная или сверхпроизводительная жидкостная хроматография (HPLC или UHPLC).
  6. В конце измерения образцы вместе со стандартами могут храниться в морозильнике. Мы рекомендуем хранить все растворы, содержащие карбоксиляты, при -20 °C в течение максимального периода 1 год. Для сроков хранения более 1 года можно подготовить и измерить свежие стандарты для проверки качества.
  7. Вычислите общее количество каждого карбоксилята в общем объёме элуата (то есть объём NaOH + объем гидрогеля + добавленная вода) и нормализуйте по массе корня или корневой площади, умножьте на коэффициенты эффективности элюирования: 0,94 для аконитата, 1,00 для цитрата, 0,90 для фумарата, 1,02 для лактата, 1,05 для малата, 0,91 для оксалата и 1,00 для сукцината (см. дополнительную таблицу 1). Убедитесь, что коэффициенты разбавления учитываются, если они были внесены во время элюирования и измерения.

5. 2D-отображение

ПРИМЕЧАНИЕ: Не существует специального программного обеспечения для создания 2D-изображений данных эксудации. Отображение можно выполнять с помощью Microsoft Excel и Python.

  1. Вставьте данные, полученные на шаге 4.7 с каждого куска геля, в соответствующую ячейку внутри 2D-сетки (строки x столбцов). Сетка генерируется на фотографиях, сделанных с корней при отборе проб (см. шаг 4.1).
  2. Определите размер сеток и проверьте совпадение данных.
  3. Выберите цветовую шкалу и закажите цветовые коды, отражающие наименьшие и самые высокие значения.
  4. Укажите числовой диапазон данных для легенды, чтобы он точно совпадал с выбранной шкалой.
  5. Создайте тепловую карту и убедитесь, что на ней нет меток или сеточных линий. Тепловую карту легко создать в программном обеспечении R, используя пример скрипта R, представленный в дополнительном файле 1.
  6. Обработайте изображение и разместите его рядом с фотографией корней, полученной при выборке, чтобы интерпретировать пространственное распределение карбоксилатов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сегодня картирование также можно выполнять с помощью инструментов искусственного интеллекта. Процедура проста: просто скопируйте и вставляйте числовую сетку из Excel в чат, затем запросите тепловую карту с нужными размерами геля и цветовой шкалой для легенды. Имейте в виду, что результат может быть не всегда идеальным с первого раза, но повторение процесса обычно даёт точные результаты. Этот подход имеет преимущество значительно быстрее ручных методов.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод гидрогеля ZrOH был изначально разработан для отбора проб цитратов из корней растений, выращенных в почве, и успешно использовался для определения пространственного распределенияэкссудации 11. Перед использованием этого метода для других карбоксилатов мы охарактеризовали гидрогели ZrOH, чтобы убедиться, что они пригодны и для использования с другими карбоксилатами (см. дополнительную таблицу 1). Кроме того, мы элюировали и проанализировали нагруженные хранящиеся гидрогели ZrOH из эксперимента с ризобоксом, проведённого в 2019 году. Гидрогели ZrOH могут поглощать 100% от нагруженного количества в течение 5 часов (~0,2 мкмоль, 10 мл) аконитата, цитрат, фумарата, лактата, малата, оксалата и сукцината, используя те же параметры элюирования, установленные Tiziani et al.12 (1 мл, 0,5 моль L-1 NaOH). Гидрогели ZrOH могут связываться с карбоксилатами до 3,29 мкмоль см-2 ± 0,40 мкмоль см² (см. дополнительную таблицу 1), что значительно выше, чем концентрации (часто в диапазоне нмоль), обычно встречающиеся в ризосфере. Кроме того, гидрогели ZrOH, нагруженные карбоксилатом, остаются стабильными и могут храниться несколько недель до анализа, что минимизирует микробное разложение во время и после отбора проб.

Результаты на рисунке 3 показывают двумерную визуализацию пространственного распределения эксудации цитратов вдоль кластерного корня выращенного в почве растения Lupinus albus L (люпин), выращенного в почве с дефицитом P. Карта включает 48 отдельных измерений, проведённых на кусочках геля размером 5 x 2 мм, в которые гель ZrOH был секциран в августе 2025 года после отбора проб цитратов в августе 2019 года. Очевидно, что гидрогели ZrOH эффективно поглощали выделенный цитрат, с количественными результатами даже на небольшом геле (0,10см²), без необходимости предварительной концентрации элуата. Самые высокие показатели экссудации цитратов были обнаружены в корневых областях кластера (до 2,8 нмоль-2 см² гель H-1), что соответствует 67,2 нмоль-см2 гелю в первый день, тогда как самые низкие показатели наблюдались только на кусочках геля, контактирующих с почвой. Длина корней кластеров варьировалась от 0,2 мм до 15,6 мм, общая длина составляла 250 мм. Эти результаты подтверждают пригодность гидрогелей для отбора проб карбоксилата, высвобождённого из корня, в течение 24 часов. Гидрогели ZrOH также смогли связывать другие карбоксилаты, такие как лактат, фумарат, малате и оксалаты, помимо цитратов (Таблица 1). Обнаружение большинства карбоксилатов из гидрогелей ZrOH, которые хранились при 4 °C в течение 6 лет, свидетельствует о минимальной деградации карбоксилатов. Однако продолжаются эксперименты по сбору значительно большей информации о семи протестированных карбоксилатах различных видов растений.

figure-results-1
Рисунок 1: Критические этапы подготовки полиакриламидного геля. (A) Выравнивание стеклянной пластины с смещением ~1 мм. (B) Литье гелем и (C) равномерное распределение раствора геля в пластине от центра пластины. (D) Рычаг стеклянной пластины с помощью лезвия бритвы от угла. (E) Замачивание гелей для их отсоединения от стеклянной пластины. (F) Промывка геля в стакан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Отбор образцов экссудата корней из сегмента корневой системы растений, выращенных в ризобоксе, с использованием гидрогелей ZrOH. (A) Открыть ризобокс после снятия передней пластины и пластика. (B) Правильное смачивание границы почвы и корня с помощью деионизированной воды в бутылке для промывания. (C) Мембрана для травления нуклепора, прикреплённая к влажной границе почва и корня. (D) Rhizobox с гидрогелем ZrOH, нанесённым на интересующую область, покрытым пластиковой фольгой для гелевого покрытия от передней пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Отбор проб корневого экссудата с использованием гидрогеля ZrOH и миллиметрового 2D-изображения эксудации цитратов. (A) Фото гидрогеля ZrOH, наложенного на интересующую область корня во время отбора проб для создания сеток для картографирования. (B) Миллиметровое двумерное изображение, показывающее распределение скорости эксудации цитратов (nmol–cm–2 gel h–1) белого корня Lupinus albus L. (люпин), выращенного в почве с дефицитом фосфора. Каждая сетка представляет собой гелевый кусок размером 5 x 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

РастениеЛечениеАконитатЦитратФумаратЛактатМалатеОксалатКраткое содержание
мг P кг-1 почваNMOL CM-2 H-1
Люпен50 0.020.210.15 0.06
Люпен250 0.020.40.170.020.2
Люпен250 0.050.310.090.010.19
Люпен0 0.030.210.150.020.1
Райс (DJ123)250 0.010.240.040.020.1
Райс (DJ123)250 0.010.390.12 0.1
Рис (Nerica4)50 0.010.240.35 0.09

Таблица 1: Коэффициенты выделения аконита, цитрат, фумарата, лактата, малата, оксалатов и сукцината растений Lupinus albus L. (люпин) и Oryza sativa L. (рис), выращенных в почве с содержанием 0, 50 и 250 мг P кг-1. LOQ — предел количественной оценки

Дополнительная таблица 1: параметры элюции NaOH (1 мл, 0,5 моль L-1) (эффективность элюции и коэффициент коррекции) и ёмкость гидрогеля ZrOH для семи карбоксилатов. Данные представляют собой средние ± стандартных отклонений среднего значения (n = 4 — эффективность элюции и ёмкость отдельных карбоксилатов и n = 40 — карбоксилатная смесь). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 1: Схематическое изображение рекомендуемого ризобокса для облегчения полива. Ризобокс состоит из рамки ризобокса с равномерно расположенными водоёмами внизу и сзади для равномерного распределения воды во время полива и съёмной прозрачной передней пластины для мониторинга роста корней во время эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Процесс сборки Rhizobox и заполнения почвы. (A) Закройте отверстия на задней части рамы ризобокса клейкой лентой. (B) Прикрепите (мембрану для нуклепора), затем пластиковую фольгу к передней или открытой стороне рамы Rhizobox (убедитесь, что она достаточно плотная и ровная). (C) Поставьте переднюю пластину и зажмите ризобокс. (D) Заполните ризобокс, наклонив его вперёд, чтобы мелкие частицы падали на съёмную поверхность, чтобы получить гладкую поверхность, как на фото. (E) В качестве альтернативы заполнить покрытую раму ризобокса (A) с открытой стороны, выровнять её съёмной пластиной, а затем покрыть мембраной нуклеопора, пластиковой фольгой и передней пластиной. (F) Окончательная установка Rhizobox, полив и посадка. Альтернативная процедура наполнения приведена в Wagner и др. (2020). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Файл содержит сведения о скрипте R, используемом для создания тепловой карты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь метод отбора проб карбоксилатов использует гидрогели ZrOH, для которых крайне важна правильная подготовка и обработка геля. Для обработки гидрогелей ZrOH рекомендуем поддерживать их влажностью с помощью нескольких капель лабораторной воды. Во время подготовки важно сразу после приготовления гелевой смеси отлить гель (шаг 1.1.3) и следить за отсутствием пузырьков между стеклянными пластинами. Пузырьки, расположенные в центре гидрогеля ZrOH, особенно важны, так как они могут мешать отбору проб. В отличие от этого, пузырьки по краям можно удалить, обрезая гель перед нанесением. Кроме того, карбоксиляты, высвобождающиеся из корня, связываются с осадённым ZrOH в гидрогелях, что делает равномерное распределение Zr во время осадка. Неравномерное распределение Zr внутри геля может привести к латеральной диффузии карбоксилатов, что искажает их пространственное распределение и снижает надежность 2D-локализации26. Равномерное распределение Zr можно достичь, погружая полиакриламидные гели в растворZrOCl 2·8H 2Oболее чем на 2 часа в более широком стакане и размещая меньшегелей 12 (шаг 1.2.3). Кроме того, распределение Zr можно проверить с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM, S-3400N II, Hitachi, Япония) по рекомендации Гуана и др.14, разработавших гидрогели ZrOH. Однако SEM не является стандартной процедурой для больших образцов.

Ещё одним важным этапом является заполнение ризобокса, нанесение мембраны нуклепор и полив перед нанесением геля для отбора проб карбоксилата. Особое внимание необходимо уделять при заполнении и работе с песчаными или тяжёлыми глинистыми почвами, чтобы обеспечить равномерно гладкую поверхность, что необходимо для правильного контакта с гелем и поддержания хорошо дренированных условий. Гладкая поверхность также необходима для правильного крепления мембраны нуклепора. Крайне важно установить хороший контакт между корнем и гидрогелем ZrOH, обеспечивая правильное прилипывание ядерной мембраны к поверхности почвы с минимальным количеством пузырьков воздуха. Перед нанесением геля ZrOH также важно правильно насыщать почву, чтобы гидрогель ZrOH можно было прочно прикрепить, удержать и сохранить влажность при отборе проб. При нарезке геля для 2D карбоксилатного картирования достижение миллиметровых разрезов может быть непростым; Поэтому мы рекомендуем не опускаться ниже разрешения 2 x 2 мм. Кроме того, поскольку гели уменьшаются при высыхании, важно поддерживать их влажность после отбора проб для сохранения целостности (шаг 3.12). Текущий метод был адаптирован из Tiziani et al.12, которые рекомендовали использоватьNaN3 в качестве ингибитора микроорганизмов для предотвращения деградации карбоксилатов. В этом протоколе мы не используем микробные ингибиторы, которые обычно применяются для отбора корневых эксудатов (NaN 3 или micropur, материал на основе AgCl 3)23 из-за их вмешательства в аналитические методы и потенциального влияния на систему IC-MS.

На сегодняшний день метод был проверен исключительно для семи карбоксилатов (аконитат, цитрат, фумарат, лактат, малат, оксалат, сукцинат), тогда как корневой экзудом состоит из сложной смеси соединений (например, фенолы, аминокислоты, углеводы и карбоксиляты). Эти другие важные соединения в настоящее время не учитываются в методе, а гидрогели ZrOH не были охарактеризованы для их отбора. Наличие других оксианионов в почве (таких как фосфат, нитраты) может влиять на поглощение, ёмкость и элатуру карбоксилатов, а также на количественную оценку карбоксилата на IC или HPLC. Кроме того, отбор проб очень крупных целых корневых систем у крупных растений (например, деревьев или кустарников) может быть очень сложным из-за трудностей при получении очень крупных гидрогелей ZrOH (>30 см). Однако это проблема во всех современных методах отбора пробэкссудата 8. Ещё одним ограничением является использование ризобоксов. Хотя рост растений в ризобоксах гораздо реалистичнее, чем в гидропонныхсистемах 8, это остаётся искусственной установкой с ограниченным трёхмерным пространством для развитиякорней 33. Кроме того, отбор проб происходит на двумерной поверхности, что теоретически может привести к потере карбоксилатов в других направлениях, не контактирующих с гелями. Однако это ограничение можно смягчить диффузией, более высокой способностью связывания гидрогелей ZrOH для карбоксилатов и высоким содержанием воды в почве ризосферы при нанесении. Однако для определения этих аспектов необходимы дополнительные валидации.

Гидрогелевой метод ZrOH для отбора проб карбоксилатов, высвобождающихся из корня, обладает рядом преимуществ по сравнению с широко используемыми методами (например, гибридные и гидропонные методы почвы). Этот новый подход позволяет на месте отбирать образцы карбоксилатов из нетронутой почвенной корневой системы, отбор проб с временным разрешением (Santner, Mühlbacher и др., неопубликованные данные) и двухмерное картирование по масштабу mm. Кроме того, гидрогели ZrOH могут использоваться на корнях не менее 24 часа12 часов. Также должен быть возможен повторный отбор проб одного и того же корневого сегмента в более длительные периоды с разрешением времени. Этот метод гораздо лучше разработан и характеризуется, чем аналогичные методы, такие как применение фильтрующихбумаг 8. Длительное отбор проб с гидрогелями ZrOH возможен благодаря высокой гелевой ёмкости карбоксилатов, например, минимальной — 0,44 мкмоль см-2 ± 0,04 мкмоль⁻2 геля для малата до максимального — 1,66 мкмоль см-2 ± 0,10 мкмоль⁻2 для сукцината при pH 4,00 с общим содержанием 3,29 мкмоль см-2 ± 0,40 мкмоль⁻² при смешивании карбоксилатов (см. дополнительную таблицу 1). Исключение этапа промывания корней (который обычно занимает 20–30 минут на растение) в методе почво-гидропонного гибридного метода значительно снижает повреждение корневой системы и соответствующее смещение, что приводит к более реалистичным и репрезентативным данным.

В частности, загруженные гидрогели ZrOH не требуют специальных условий хранения, только охлаждения, и мы пока не обнаружили необходимости предварительной концентрации после элюирования в наших приложениях. Гидрогели ZrOH также связывают другие анионы, которые элюируются при тех же условиях и могут быть проанализированы с помощью IC14,34. Это позволяет связать экссудацию карбоксилата с пространственным распределением питательных веществ вризосфере 29.

В заключение, этот новый подход к отбору проб карбоксилатов, высвобождаемых корнями, является фундаментальным этапом исследований ризосферы. Поскольку карбоксиляты играют ключевую роль в мобилизации и приобретении растительных питательных веществ (например, P, Fe)35,36, а также в привлечении полезных микроорганизмов, этот метод может использоваться для скрининга сортов на корневые признаки и селекцию растений.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы признаём финансовую поддержку, финансируемую «Автономной провинцией Больцано/Бозен – Южный Тироль» (Совместные проекты Südtirol-DFG 2023, D-SÜD, контракт No 6/34, CUPI53C22003410003, DGT Exudates AG2222) и «Deutsche Forschungsgemeinschaft» (DFG, Немецкий исследовательский фонд, проект номер 525026426). Мы также признаём финансовую поддержку Фонда открытого доступа Свободного университета Бозен-Больцано. С глубокой скорбью мы также отмечаем покойного доктора Фабио Тревизана, чья преданность и опыт сыграли ключевую роль в разработке аналитических методов и продвижении проекта DGT root.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ЭтанолСигма-Олдрич70%
Щавелевая кислотаСигма-Олдрич194131-250G98%
трансаконитовая кислотаСигма-Олдрич122750-25G98%
Октагидрат оксида циркония дихлорида (ZrOCl2 и раз; 8H2O, 98%)Thermo ScientificA12342.2298%
Лимонная кислотаСигма-ОлдричC83155-500G99%
Селитра натрияVWR ChemicalsНомер лота: 19H224150100%
Азотная кислота (HNO3)Сигма-ОлдричCAS-No: 7697-37-2>65% для анализа EMSURE® Рейг. Ph Eur, ISO
Фумариновая кислотаСигма-Олдрич240745-100G>99%
Гидроксид натрияСигма-ОлдричS8045-500G≥ 98%
Персульфат аммония (APS_(NH4)2S2O8)Thermo Scientific201531000≥ 98,0%, очень чистый для электрофореза
Сукциновая кислотаСигма-ОлдричS3674-100G≥ 99%
2-(N-морфолино)-этансульфоновая кислота (MES) буферСигма-ОлдричM8250-250G≥ 99.5%
Хлорид натрияСигма-Олдрич71376-1KG≥ 99.5%
Перекрёстный связчикDGT Research Ltd (Ланкастер, Великобритания)на2%, производная агарозы
Пластинчатый или горизонтальный шейкерAny 
Ионная хроматография или IC-MSThermo Fischer ScientificнаЛюбая высокопроизводительная или сверхэффективная жидкостная хроматография (HPLC или UHPLC) может использоваться в сочетании с различными детекторами, включая продвинутые MS (например, time-of-flight или Orbitrap) или спектрофотометрические детекторы
pH-метрМожно использовать любой лабораторный электрод pH.
ДуховкаПапканаМожно использовать любую маленькую духовку с определённой температурой, желательно меньшую.
Нейлон filters_13 мм 0,45 и микро; MТехнология фильтра GVSНомер участка: 7135431Также можно использовать более крупные нейлоновые фильтры, но предпочтительнее меньшие, так как объём элуата небольшой.
Дигидрат сульфата кальцияСигма-ОлдричC3771-1KG /CAS-No: 10101-41-4CaSO4 также может использоваться.
Акриламидный раствор, 40%G-Biosciences786-508Не используйте акриламидный раствор, смешанный с   Бисакриламид. Токсичное соединение, с которым следует обращаться осторожно в паре.
Ризобоксыhttps://www.rhizosphere.com/наНаши ризобоксы изготавливаются на заказ по дизайну Rhizosphere.com
Набор для флаконов с полипропиленом, 1,5 млThermo Scientific79812Пластиковые флаконы IC предпочтительнее, так как их можно заморозить, не разбиваясь. 330 & micro; L также можно использовать, но необходимо следить за отсутствием воздушных пузырьков
цис-аконитовая кислотаThermo ScientificA16010.06Тех. 85%
N,N,N',N'-
тетраметилэтилендиамин (TEMED)		Сигма-ОлдричНомер участка: BCBN1173VТоксичное соединение, с которым следует обращаться с осторожностью
Флаконы PP объёмом 250 млСарштедтНомер участка: 2406082
Алюминиевая фольгаМестный супермаркетна
Beakers_1 L/ 2 L
ЗажимыМестный складна
Стеклянная пластина (6,1 x 17 x 0,4 см)Местный складна
L-(-)-яблочная кислотаСигма-ОлдричM6413-25G
Лактатный стандарт для ICСигма-Олдрич07096-100ML
Ламинарный потоковый стенд
L-молочная кислота безводнаяThermo ScientificL13242.14
Nuclepore Track-etch Membrane_0.2 и микро; mЦитиваНомер участка: A29983896
Пластиковая фольга/пластиковые пакетыМестный складна
Пластиковые пинцетыСемадени602
Пластина из плексигласаМестный складна
Флаконы PP 30 млAptaca spaНомер участка: 250552
PTFE spacer_0.25/0.4 mm https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
Лезвия для бритвыМестный складна
ПравительМестный книжный магазинна
Гипохлорит натрия (NaClO)CARLO ERBA РеагентыCAS-No: 7681-52-9
Syringes_1 млХЕНКЕ САСС ВОЛЬФ (HENKE-JET)Лот No: 22A17C8
Виниловая изолентаМестный складна

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

ZrOH HydrogelsRoot Exudate SamplingCarboxylate QuantificationSpatial MappingRhizobox CultivationPolyacrylamide HydrogelIon ChromatographyMass SpectrometryRoot ExudationRhizosphere Analysis

Related Articles