Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Послеоперационное восстановление и стабильность хронической внутричерепной мультиэлектроэнцефалографии у крыс

153 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69937

⸱

24 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Core Facility Center, Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Intensive Care Unit, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 3Department of Neurosurgery, Anesthesiology, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 4First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, 5Department of Cardiology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, 6Institute of Heart Lung and Blood Vessel Disease, Beijing Key Laboratory of Precision Medicine of Coronary Atherosclerotic Disease, Clinical center for coronary heart disease, Capital Medical University, 7Laboratory for Clinical Medicine, Capital Medical University, 8Department of Physiology, Amsterdam University Medical Centre

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол определяет стандартизированную основу для послеоперационной оценки после хронической многоэлектродной имплантации ЭЭГ у крыс, включая последовательный мониторинг качества сигнала, поведенческое восстановление и нейровоспалительные маркеры для определения правильного начала стабильных долгосрочных записей.

Аннотация

Внутричерепная многоэлектродная имплантация позволяет одновременно получать нейронные сигналы в разных областях мозга, но вводит послеоперационные возмущения, которые могут влиять на качество данных и время эксперимента. Этот протокол описывает стандартизированный рабочий процесс для хронической многоточковой внутричерепной имплантации ЭЭГ-электрода и структурированной послеимплантационной оценки у крыс Спрага–Доули. Вольфрамовые электроды стереотаксически имплантируются в три заранее определённых внутричерепных участка (передняя поясная кора, гиппокамп CA1 и энторинальная кора) с использованием хирургической стратегии, направленной на минимизацию разрушения тканей.

После имплантации протокол определяет продольную оценку по пяти доменам: точность локализации электродов, целостность локального потенциала поля, поведение, связанное с болью, поведение при кормлении и нейровоспалительные маркеры. Электрофизиологические и поведенческие оценки проводятся в заранее определённые послеоперационные периоды (исходные и послеоперационные дни 1, 4, 7, 10 и 13) для обеспечения последовательного мониторинга ранних послеоперационных эффектов (n = 3). Гистологический анализ используется для характеристики локальных реакций тканей в конце исследования (n = 3 на момент времени).

Операционные критерии и интервалы оценки предоставляются для руководства принятием решений о готовности к экспериментам и инициации долгосрочных записей. Этот протокол обеспечивает структурированный подход к мониторингу после имплантации и определяет соответствующее время проведения нейрофизиологических экспериментов на следующих этапах.

Введение

Внутричерепная электроэнцефалография (ЭЭГ) позволяет измерять нейронную активность с высоким разрешением, записывая сигналы непосредственно от тканимозга 1,2, что обеспечивает преимущества в пространственной специфичности и точности сигнала по сравнению с методами ЭЭГ на кожеголовы 3. Многорегиональные внутричерепные записи дают представление о взаимодействиях на уровне сети, которые широко используются для изучения нейронной динамики, лежащей в основе когниции и заболеваний, и часто применяются в моделях грызунов для механистических и продольныхисследований 4,5.

Электроды из вольфрамовой проволоки часто используются для хронических записей благодаря их механической стабильности ибиосовместимости 6,7,8. Однако имплантация требует инвазивной хирургии, которая может временно нарушить нейрофизиологию, целостность тканей и поведение животных 9,10,11. Такие проблемы, как острый хирургический стресс, локальное воспаление, глиальные реакции и изменения в питании или ноцицептивном поведении, могут влиять на качество сигнала и интерпретацию экспериментов в ранний постимплантационныйпериод 12,13,14. Однако этот период восстановления остаётся в основном эмпирическим, с сообщаемыми окнами восстановления от 5 до7 дней 15,16. Длительные задержки, напротив, могут вызвать дополнительные сложности, связанные с ремоделированием тканей или смещениемэлектродов 17.

Несмотря на широкое использование хронической внутричерепной ЭЭГ, не существует стандартизированной системы постимплантационного мониторинга, интегрирующей электрофизиологические, поведенческие, воспалительные и гистологические оценки для определения времени экспериментов. Поэтому настоящий протокол устраняет этот пробел, описывая структурированный подход к оценке состояния после имплантации в хронической внутричерепной модели многоэлектродной имплантации у анестезируемых крыс Спраг–Доули (SD) (6 недель). Используя вольфрамовые электроды, имплантированные в переднюю поясную кору (Cg1), гиппокамп CA1 и энторинальную кору (EC), протокол определяет продольную оценку стабильности электрода, характеристик сигнала ЭЭГ, поведенческих индикаторов и воспалительных маркеров в течение двух недель. Хотя оценки проводятся под общей анестезией для практического удобства, этот подход не влияет на основную цель создания основной системы имплантации и стабильности электродов. Этот протокол предназначен для руководства послеоперационного мониторинга и обеспечения последовательного определения подходящих временных моментов для начала нейрофизиологических исследований на следующих этапах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных проводились в соответствии с институциональными рекомендациями и утверждён Комитетом по уходу и использованию животных Университета Капитал Медикал (ID одобрения: AEEI-2024-391).

1. Приготовление животных

  1. Заведите 6-недельных самцов SD крыс (вес тела 220–230 г). Разместите животных в определённой среде, свободной от патогенов (24 ± 2 °C, 50 ± влажность 10%, 12 часов цикл свет/темнота). Обеспечьте кормом и водой ad libitum. Акклиматизируйте крыс в течение 7 дней до операции.
  2. После имплантации электрода крысы по отдельности находятся в одинаковых условиях, чтобы предотвратить повреждение головной сцены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блок-схема исследования и соответствующие измерения представлены на рисунке 1A. Реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

2. Операция по имплантации нескольких электродов

  1. Анестезируйте крыс с помощью изофлурана (3–4% индукции, 2% поддержания) с кислородом при 2 л/мин.
  2. Поместите крысу в стереотаксичную раму и поддерживайте температуру тела на уровне 37 °C с помощью термостатически контролируемой грелки. Нанесите эритромициновую офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
  3. Сбрийте кожу головы и продезинфицируйте раствором йодофора 0,5%.
  4. Проведите разрез на коже головы по средней линии (1 × 2 см), чтобы открыть череп, и аккуратно удалите надственность стерильными ватными палочками.
  5. Подготовка и сверление черепа
    1. Определите брегму и лямбду и выровняйте череп в передних–задних и медиально-латеральных плоскостях.
    2. Просверлите отверстия диаметром ≤2 мм) на целевых координатах с помощью низкоскоростного стоматологического сверла с периодическим солевым орошением.
  6. Подготовка и установка электродов
    1. Используйте электроды из вольфрамовой проволоки с полиимидной изоляцией (диаметр хвоста: 300 мкм) с открытой длиной наконечника 4–8 мм (заподлицозаемый конец). Измерьте импеданс электрода (| Z|) при 1 кГц; допустимые значения варьируются от 7 до 10 кОм при фазовом углу от 1° до 2°.
    2. Медленно вводите электроды в следующие области: Cg1 (передняя поясная кора): AP +1,2 мм, ML −0,2 мм, DV −2,4 мм; CA1 (гиппокамп): AP −3,3 мм, ML −1,8 мм, DV −3,0 мм; EC (энторинальная кора): AP −6,7 мм, ML −4,0 мм, DV −8,0 мм.
    3. Имплантируйте один винт из нержавеющей стали в противоположную область CA1 и используйте его как заземляющий электрод.
  7. Фиксация и закрытие электродов
    1. Проверять правильную глубину электрода и наведения с помощью стереотаксичных координат во время имплантации; подтвердить локализацию электрода постhoc путём гистологической идентификации следов электродов.
    2. Закрепите электроды и винты зубной смолой (затвердеть 30–60 с на слой).
    3. Подключите электродные провода к разъёму на головной сцене и зашивайте окружающую кожу.
  8. Фиксируйте исходную активность ЭЭГ в течение 30 минут в соответствующую точку времени (рисунок 1A) при сохранении анестезии.

3. Послеоперационный уход и лечение

  1. Дайте крысам восстановиться на согревающей подложке до полной передвижения.
  2. Домашние крысы находятся под контролируемой температурой и влажностью с мягкой подстилкой и импровизированным доступом к еде и воде для снижения стресса.
  3. Ежедневно проверяйте места разреза, стабильность электрода и целостность головной сцены.
  4. Домашние животные индивидуально, обеспечивают ежедневный уход за ранами (раствор йодофора 0,5%) и контролируют состояние без фармакологических препаратов, чтобы избежать смешивающих эффектов, согласно предыдущимисследованиям 6,18.

4. Продольная запись ЭЭГ

  1. Проводите ЭЭГ-запись на 1, 4, 7, 10 и 13 дни после имплантации.
  2. Обезболить крыс изофлураном (3–4% индукции, 1,5% поддержания).
  3. Стабилизируйте кабели записи, чтобы минимизировать артефакты движения и электромагнитный шум.
  4. Записывайте ЭЭГ на 30 минут, начиная с 9:00 утра, чтобы контролировать циркадную вариабельность.
  5. Используйте следующие параметры приёма: частота дискретизации: 1000 Гц; аппаратный полосный фильтр: 0,5–40 Гц; усиление: 8–10. Дополнительная фильтрация и удаление артефактов офлайн.
  6. Допустимые сигналы ЭЭГ показывают стабильные исходные линии, минимальный уровень шума или дрейфа, а также физиологически правдоподобное содержание амплитуды и частот; исключают записи, не соответствующие этим критериям.

5. Анализ сигналов ЭЭГ

  1. Анализируйте ЭЭГ-сигналы с помощью соответствующего программного обеспечения.
  2. Визуально осматривайте сигналы и удаляйте сегменты с помощью движущихся или электрических артефактов.
  3. Вычислите спектральную плотность мощности (PSD) с помощью FFT (функции pwelch).
  4. Количественно измерить колебательную активность, вычисляя площадь под кривой PSD (AUCpsd) для заранее определённых частотных диапазонов.
  5. Вычислите отношение сигнал/шум (SNR) как отношение мощности в целевом диапазоне сигнала (0,5–40 Гц) к диапазону фонового шума (40–80 Гц).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильные сигналы демонстрируют стабильные профили PSD в течение последовательных дней записи.

6. Оценка боли

  1. Оценивайте боль с помощью шкалы гримасы крыс19,20 за день до операции (базовый стадий) и во все дни записи.
  2. Используйте наблюдательную камеру (25 см × 15 см × 15 см) и разместите камеру в верхнем левом углу под углом 45°.
  3. Снимайте изображения лица, рандомизируйте порядок изображений и оценивайте сжатие орбиты, выравнивание носа и щёк, изменения усов, положение ушей (масштаб 0–2).
  4. Суммуйте баллы, чтобы получить общий балл боли на животное за точку времени.

7. Питание и вес тела

  1. Взвешивайте крыс и измеряйте ежедневное потребление пищи. Рассчитывайте потребление пищи, вычитая оставшуюся еду из предварительно взвешенной кормовой после 24 часов.
  2. Записывайте поведение крыс непрерывно в течение 24 часов с помощью системы видеозаписи. Анализируйте поведение кормления офлайн экспериментаторами, ослеплёнными к экспериментальным условиям.
  3. Регулярно следите за кормлением. Определите период кормления как ≥1 событие, длительное от 5 с до 15минут 21 минуты.
  4. Рассчитать рацион, скорректированный по массе тела (г × 100/г массы тела); средний приём пищи за прием пищи (г/количество случаев приёма пищи); и скорость поедания (г/общая продолжительность кормления в минуте).

8. Оценка нейровоспаления

  1. Усыпить крыс с помощью передозировки изофлурана, а затем обезглавливаться.
  2. Собирайте мозговую ткань из имплантированных полушарий на исходном и послеоперационном днях 1, 4, 7, 10 и 13 (n = 3 на момент времени).
  3. Вестерн блоттинг
    1. Извлекать общий белок из мозговой ткани и количественно определить концентрацию белка с помощью анализа на бицинхониновую кислоту (BCA). Скорректируйте все образцы до конечной концентрации 2 мкг/мкл и денатурируйте при 100 °C в течение 5 минут.
    2. Разделяйте белки на 10% SDS-PAGE при 120 В в течение 90 минут, загружая по 20 мкг белка на каждый канал.
    3. Переносите белки на мембрану PVDF при 300 мА в течение 1 часа.
    4. Блокировать мембраны и инкубировать ночью при 4 °C с первичными антителами против фактора некроза опухолей α (TNF-α) и интерлейкина-6 (IL-6) (1:1 000).
    5. Инкубировать с вторичным антителом, конъюгированным с HRP (1:20 000, 2 часа, комнатной температуры).
    6. Визуализируйте полосы с помощью ECL и снимите с помощью системы хемилюминесценции в режиме автоматической экспозиции.
    7. Проведите денситометрию с помощью ImageJ.

9. Безопасность и утилизация отходов

  1. Обрабатывайте изофлуран с помощью активной системы сбора.
  2. Утилизировать острые изделия и биологические ткани в специально отведённые контейнеры для биологической опасности.
  3. Утилизировать химические реагенты в соответствии с институциональными нормами безопасности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Все 21 крыса с SD терпели имплантацию внутричерепных электродов и завершили протокол исследования. Продольные измерения (ЭЭГ, масса тела, поведение при кормлении и болевые показатели) были собраны у одних и тех же животных за временные точки (n = 3), а нейровоспалительные оценки были терминальными в каждый момент времени (n = 3 крысы в день: исходный уровень, 1, 4, 7, 10, 13). Данные оценивались на нормальность с помощью тестов Шапиро-Уилка. Обычно распределенные данные выражаются в сред...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хроническая внутричерепная имплантация электродов для мониторинга ЭЭГ у грызунов остаётся краеугольным методом для изучения нейродинамики с высоким временным разрешением. Создание соответствующего послеоперационного окна мониторинга и восстановления критически важно для обеспечения как надёжности сигнала, так и благополучия животных. Это исследование предоставляет структурированную основу для оценки электрофизиологической стабильности, поведенческих исходов и воспалительных реакций после...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

Эта работа была поддержана проектом «Отличные молодые таланты» Капитального медицинского университета (A2308).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Активная система очистки изофторомRDWR510-31-6
ЖивотныеРека Чарльз
Набор для анализа BCASolarbioPC0020
Система визуализации ChemiDocБио-Рад17001401
Зубная смолаВершинаXG473P03
Реагент для обнаружения ECLSolarbioPE0010
Глазная мазь с эритромициномЖэньхэ1.00E+11
Вторичный антител к козлам против кроликовProteintechSA00001-2
GraphPad Prism 9.0Программное обеспечение GraphPadПрограммное обеспечение для статистического анализа
Headstage усилительBIOPAC Systems IncEEG100C
ГрелкаТехнология YuYanS-100
ImageJНациональные институты здравоохраненияПрограммное обеспечение для анализа изображений
Поликлональные антитела IL-6Proteintech21865-1-AP
ЙодофорCleanboom430-DFXDY100
ИзофлуранЗадний приводR510– 31
Устройство для нейрозаписи с NeuroExplorer (версия 5.012)ПлексонOPX-A1600-128-16CПрограммное обеспечение для анализа электрофизиологических данных
Мембрана PVDFЦитиваRPN303F
Система SDS-PAGEБио-Рад1658004
Стереотаксический аппаратЧжунши научные технологииZS-PDC
TNF и альфа; Поликлональные антителаProteintech17590-1-AP
Аппаратура для передачиБио-Рад1703937
Вольфрамовая проволокаA-M Systems785500
Система видеозаписиBasleracA1920
&бета;-актин-моноклональное антителоProteintech2D4H5

Ссылки

  1. Adewole, D. O., et al. The evolution of neuroprosthetic interfaces. Crit Rev Biomed Eng. 44 (1-2), 123-152 (2016).
  2. Patil, A. C., Thakor, N. V. Implantable neurotechnologies: a review of micro- and nanoelectrodes for neural recording. Med Biol Eng Comput. 54 (1), 23-44 (2016).
  3. Ball, T., Kern, M., Mutschler, I., Aertsen, A., Schulze-Bonhage, A. Signal quality of simultaneously recorded invasive and non-invasive EEG. Neuroimage. 46 (3), 708-716 (2009).
  4. Gao, R., Peterson, E. J., Voytek, B. Inferring synaptic excitation/inhibition balance from field potentials. Neuroimage. 158, 70-78 (2017).
  5. Wang, Z., Peng, Y. B. Multi-region local field potential signatures in response to the formalin-induced inflammatory stimulus in male rats. Brain Res. 1778, 147779(2022).
  6. Morales-Villagrán, A., Medina-Ceja, L., López-Pérez, S. J. Simultaneous glutamate and EEG activity measurements during seizures in rat hippocampal region with the use of an electrochemical biosensor. J Neurosci Methods. 168 (1), 48-53 (2008).
  7. Bragin, A., Azizyan, A., Almajano, J., Wilson, C. L., Engel, J. Jr Analysis of chronic seizure onsets after intrahippocampal kainic acid injection in freely moving rats. Epilepsia. 46 (10), 1592-1598 (2005).
  8. Andiné, P., Rudolphi, K. A., Fredholm, B. B., Hagberg, H. Effect of propentofylline (HWA 285) on extracellular purines and excitatory amino acids in CA1 of rat hippocampus during transient ischaemia. Br J Pharmacol. 100 (4), 814-818 (1990).
  9. Jech, R., et al. Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus affects resting EEG and visual evoked potentials in Parkinson's disease. Clin Neurophysiol. 117 (5), 1017-1028 (2006).
  10. Makowiecki, K., Garrett, A., Clark, V., Graham, S. L., Rodger, J. Reliability of VEP recordings using chronically implanted screw electrodes in mice. Transl Vis Sci Technol. 4 (2), 15(2015).
  11. York, M. K., et al. Cognitive declines following bilateral subthalamic nucleus deep brain stimulation for the treatment of Parkinson's disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 79 (7), 789-795 (2008).
  12. Zhang, D., et al. Tenuigenin promotes non-rapid eye movement sleep via the GABA(A) receptor and exerts somnogenic effect in a MPTP mouse model of Parkinson's disease. Biomed Pharmacother. 165, 115259(2023).
  13. Sun, X., et al. Longitudinal analysis of sleep-wake states in neonatal rats subjected to hypoxia-ischemia. Nat Sci Sleep. 14, 335-346 (2022).
  14. Rensing, N., Moy, B., Friedman, J. L., Galindo, R., Wong, M. Longitudinal analysis of developmental changes in electroencephalography patterns and sleep-wake states of the neonatal mouse. PLoS One. 13 (11), e0207031(2018).
  15. Bastianini, S., et al. Ageing-related modification of sleep and breathing in orexin-knockout narcoleptic mice. J Sleep Res. 34 (2), e14287(2025).
  16. Cao, Q., et al. a saponin derived from Radix Polygalae, exhibits sleep-enhancing effects in mice. Phytomedicine. 23 (14), 1797-1805 (2016).
  17. Chiprés-Tinajero, G. A., Núñez-Ochoa, M. A., Medina-Ceja, L. Changes in physiological and pathological behaviours produced by deep microelectrode implantation surgery in rats: a temporal analysis. Behav Neurol. 2020, 4385706(2020).
  18. Bragin, A., et al. Pathologic electrographic changes after experimental traumatic brain injury. Epilepsia. 57 (5), 735-745 (2016).
  19. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Front Mol Neurosci. 10, 284(2017).
  20. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  21. Barahona, M. J., Rojas, J., Uribe, E. A., García-Robles, M. A. Tympanic membrane rupture during stereotaxic surgery disturbs the normal feeding behavior in rats. Front Behav Neurosci. 14, 591204(2020).
  22. Moss, J., Ryder, T., Aziz, T. Z., Graeber, M. B., Bain, P. G. Electron microscopy of tissue adherent to explanted electrodes in dystonia and Parkinson's. Brain. 127 (Pt 12), 2755-2763 (2004).
  23. Kronenbuerger, M., et al. Brain alterations with deep brain stimulation: new insight from a neuropathological case series. Mov Disord. 30 (8), 1125-1130 (2015).
  24. Bishop, B. Neural plasticity: part 3. Responses to lesions in the peripheral nervous system. Phys Ther. 62 (9), 1275-1282 (1982).
  25. Bui, A., Kim, H. K., Maroso, M., Soltesz, I. Microcircuits in epilepsy: heterogeneity and hub cells in network synchronization. Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (11), a022889(2015).
  26. Gaire, J., et al. The role of inflammation on the functionality of intracortical microelectrodes. J Neural Eng. 15 (6), 066027(2018).
  27. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J Neurosci Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
  28. McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. J Neural Eng. 6 (5), 056003(2009).
  29. Radeen, K. R., et al. A cost-effective and minimally invasive protocol for chronic multi-site electroencephalography recording in freely moving mice. J Vis Exp. (224), e69314(2025).
  30. Gulino, M., Kim, D., Pané, S., Santos, S. D., Pêgo, A. P. Tissue response to neural implants: the use of model systems toward new design solutions of implantable microelectrodes. Front Neurosci. 13, 689(2019).
  31. Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29 (24-25), 3393-3399 (2008).
  32. Wang, Z., et al. Cortical complexity and connectivity during isoflurane-induced general anesthesia: a rat study. J Neural Eng. 19 (3), 036012(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.