Method Article

Влияние различных методов экстракции на профили биоактивности in vitro Terfezia claveryi

DOI:

10.3791/69950

⸱

March 20th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University, 2Department of Genetics and Bioengineering, Faculty of Engineering and Architecture, Kirsehir Ahi Evran University, 3Department of Physiology, Gulhane Faculty of Medicine, University of Health Sciences, 4Department of Medical Services and Techniques, Medical Laboratory Techniques Program, Vocational School of Health Services, Kirsehir Ahi Evran University, 5Department of Field Crops, Faculty of Agriculture, Kirsehir Ahi Evran University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биоактивность экстрактов Terfezia claveryi in vitro зависела от биофизического метода экстракции и полярности растворителя. Экстракт воды из экстракции с ассистированной мацерацией (MAE) проявил самую сильную антиоксидантную активность, тогда как экстракция Soxhlet (SE) вызывала большую цитотоксичность в клетках SH-SY5Y. Эти результаты демонстрируют явные методозависимые различия в биоактивности экстрактов Terfezia claveryi in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terfezia claveryi — это съедобный пустынный трюфель, традиционно употребляемый в засушливых регионах. В последние годы он привлекает растущий научный интерес благодаря своим потенциальным антиоксидантным, антимикробным и терапевтическим свойствам, что указывает на возможные применения в пищевой и медицинской сфере. Однако, несмотря на растущее количество доказательств его биологического потенциала, влияние различных стратегий экстракции на восстановление биоактивных соединений и профиль биоактивности Terfezia claveryi in vitro пока не прояснено в литературе. В этом исследовании была оценена in vitro биоактивность экстрактов Terfezia claveryi, полученных с использованием различных методов экстракции и растворителей с разной полярностью. Был определен выход экстракции, а полученные экстракты оценивались на антиоксидантную, антимикробную, антибиопленку и цитотоксичную активность с использованием устоявшихся тестовых систем. Антиоксидантная ёмкость измерялась с помощью тестов на 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH), 2,2′-азино-бис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) (ABTS) и тесты на редуцирующую антиоксидантную мощность (FRAP), а цитотоксические эффекты изучались в клетках нейробластомы SH-SY5Y. Выход экстракции варьировался как в зависимости от метода, так и от полярности растворителя, при этом наибольший выход получался из водного экстракта, приготовленного методом ультразвуковой экстракции (ОАЭ) (18,40%). Было установлено, что антиоксидантная активность демонстрирует значительные различия в зависимости от метода экстракции, а водные экстракты, полученные методом мацерационно-ассистированной экстракции (MAE), демонстрировали профиль, богатый фенолными соединениями, а также обладали самой сильной способностью к добыче радикалов. Анализ LC-MS/MS этого экстракта выявил наличие девяти фенольных соединений; Доминирующими компонентами были определены хининовая и хлорогеновая кислоты. В отличие от этого, экстракты, полученные из Soxhlet, вызывали более сильные цитотоксичные эффекты в клетках SH-SY5Y. Антимикробные и антибиопленочные ответы демонстрировали относительно небольшую вариативность между методами экстракции, что указывает на более слабую зависимость от стратегии экстракции для этих действий. В целом эти результаты показывают, что биофизический метод экстракции и выбор растворителя являются ключевыми факторами профиля биоактивности экстрактов Terfezia claveryi in vitro, с выраженными эффектами антиоксидантной и цитотоксической активности.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование различных видов грибов для улучшения здоровья, профилактики и лечения болезней восходит к древним временам 1,2,3. Макрогрибы обычно делят на две группы: эпигенные (грибы) и гипогеозные (трюфели)4. Известный как пустынный трюфель, Terfezia claveryi (T. claveryi) — всемирно известный и съедобный вид трюфелей из рода Terfezia5. T. claveryi обычно распространён в засушливых и полузасушливых регионах, где преобладают виды Helianthemum 6,7,8,9,10,11. В последние годы глобальное бремя хронических заболеваний, таких как рак и нейродегенеративные расстройства, значительно возросло, что подчёркивает острую потребность в новых, безопасных и эффективных терапевтических средствах. Согласно глобальным отчётам о здравоохранении, рак остаётся одной из ведущих причин смерти во всём мире, в то время как нейродегенеративные заболевания продолжают расти вместе со старением населения. Учитывая растущую проблему общественного здравоохранения, изучение натуральных продуктов, полученных из грибов и лекарственных растений, как потенциальных источников биоактивных соединений, стало важным приоритетомисследований.

Параллельно стремительное появление антимикробной устойчивости представляет собой ещё одну серьёзную угрозу для глобального здоровья. Лекарственная устойчивость значительно снизила эффективность традиционных антибиотиков, что создало острую необходимость в альтернативных антимикробныхстратегиях 13. Вторичные метаболиты, полученные из природных источников, особенно фенольные и полифенольные соединения, привлекают всё больший интерес благодаря своим разнообразным антимикробным механизмам и низкой склонности к развитиюрезистентности 14. Окислительный стресс является фундаментальным механизмическим фактором, лежащим в основе многих хронических заболеваний, включая рак, нейродегенеративные расстройства и метаболические синдромы. Чрезмерное образование реактивных форм кислорода (ROS) в конечном итоге может нарушить клеточный гомеостаз, вызывая повреждение ДНК, перекисление липидов и окисление белков. В этом контексте натуральные антиоксиданты, способные поглощать свободные радикалы и регулировать окислительный баланс, считаются перспективными средствами для снижения окислительного повреждения и прогрессированияболезни 15.

Трюфели богаты ненасыщенными жирными кислотами, белками, минералами, витаминами, аминокислотами, фенолами и полифенолами — компонентами, которые ассоциируются с антимикробными, антиоксидантными и противораковымисвойствами 16,17,18,19,20,21,22,23,24. Их антиоксидантная способность связана с эффективностью в подавлении свободныхрадикалов 25,26,27. Среди трюфельных видов T. claveryi особенно примечателен своей съедобной структурой, региональной экономической ценностью и сообщаемым богатством фенольныхсоединений 23. Несмотря на появление данных о традиционном потреблении и биологической активности, комплексные исследования, изучающие влияние стратегий добычи на химический состав и биологические эффекты, остаются ограниченными.

Восстановление биологически активных соединений из трюфелей сильно зависит от параметров экстракции, включая прикладную технику экстракции и полярность растворителя. Методы биофизической экстракции, такие как ультразвуковая экстракция (ОАЭ), мацерационная экстракция (MAE) и экстракция Soxhlet (SE), демонстрируют значительные различия в энергопотреблении, эффективности экстракции и селективности для полярныхсоединений 28. Однако большинство исследований опирались на один метод экстракции или ограниченные системы растворителей, и исследований, сравнительно исследующих влияние этих методов на профиль биологической активности in vitro T. claveryi, ограничены. Поэтому в этом исследовании систематически сравниваются различные методы биофизической экстракции с использованием растворителей разной полярности для оценки биологической активности экстрактов T. claveryi in vitro. Выдвигалась гипотеза, что метод экстракции и полярность растворителя приводят к различиям в биологической активности, зависящей от метода. Соответственно, цели исследования заключаются: (i) сравнить выходы экстракции между различными методами и растворителями, (ii) оценить методозависимые вариации антиоксидантной и цитотоксичной активности, и (iii) изучение антимикробных и антибиопленочных ответов с учётом их чувствительности к стратегии экстракции.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Общий экспериментальный процесс подготовки и анализа экстрактов T. claveryi схематически изложен на рисунке 1. Все материалы, использованные в исследовании, описаны в Таблице материалов.

1. Аутентификация и подготовка грибковых материалов

  1. Сбор и обработка материалов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свежие трюфели T.claveryi были собраны в мае 2023 года на степных и песчаных, необработанных (несельскохозяйственных) земель в области Кырсехир, Центральная Анатолия, Турция. Отбор проб проводился в трёх различных местах: деревня Дедели (38°54′15.8" с.ш., 34°06′40.3" в.д.; ~1050 м над уровнем моря), деревня Буюккаяпа (38°53′45.1" с.ш., 34°19′37.5" в.д.; ~1020 м над уровнем моря) и деревня Акчаагыль (39°01′39,9" с.ш., 34°12′39,8" в.д.; ~1100 м над уровнем моря). Объекты коллекции характеризуются полузасушливым континентальным климатом с холодными зимами, жарким и сухим летом и среднегодовым количеством осадков примерно 380–420 мм. Все образцы были собраны в естественный сезон плодонесения в районах без недавней сельскохозяйственной активности, чтобы минимизировать потенциальное антропогенное загрязнение.
    1. Выберите чистые и неповреждённые трюфели, очистите их и трижды вымойте дистиллированной водой.
    2. Нарежьте образцы на мелкие кусочки и сушите в тени до достижения постоянного веса (примерно 20 дней).
    3. Измельчите высушенный материал с помощью механической шлифовальной машины и пропустите решето размером 328 микронов (50 меш).
    4. Храните обработанные образцы в пакетах с зип-локом в прохладной, сухой и тёмной атмосфере при комнатной температуре до дальнейших анализов.
  2. Молекулярная идентификация T. claveryi
    1. Изолировать геномную ДНК из высушенных образцов T. claveryi для молекулярной идентификации.
    2. Оценить количество и чистоту ДНК спектрофотометрически.
    3. Провести цепную реакцию полимеразы (ПЦР) по идентификации видов путём амплификации внутреннего транскрипционированного спейсера (ITS) с помощью универсальных праймеров ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) и ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′).
    4. Растворить продукты амплификации ПЦР с помощью электрофореза на геле 1,5% агарозы, приготовленном в буфере 1x TAE и визуализируемом под ультрафиолетовым освещением после окрашивания этидий бромидом.
    5. Очищайте однополосные ПЦР-продукты согласно инструкции производителя29. Подвергаем очищенные ампликоны секвенированию Сэнгера.
    6. Сборка последовательностей вперёд и обратно считывается в консенсусные последовательности с помощью алгоритма contig assembly program (CAP).
    7. Идентификация вида была подтверждена путём сравнения консенсусной последовательности ITS с эталонными последовательностями, доступными в публичных базах данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ваучерный экземпляр T. claveryi был сохранён в лабораторной коллекции для будущего использования. Идентификация видов была подтверждена молекулярным анализом на основе ITS (Дополнительный файл 1).

2. Подготовка и извлечение грибкового материала

  1. Приготовление экстрактов T. Claveryi
    1. Весит примерно 30 г сушёного порошка T. claveryi .
    2. Добавьте 150 мл растворителя (метанол, ацетон, n-гексан, этилацетат или дистиллированную воду) для поддержания постоянного соотношения твердого и жидкого вещества во всех методах экстракции.
    3. Для всех процедур экстракции используйте аналитические растворители.
    4. Фильтруйте каждый экстракт под пониженным давлением с помощью качественной фильтрующей бумаги.
    5. Концентрируйте фильтраты под пониженным давлением при 30–45 °C с помощью ротационного испарителя.
    6. Лиофилизуйте концентрированные экстракты до полного удаления растворителем.
    7. Храните высушенные экстракты сырой нефти при −20 °C до дальнейшего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Примените идентичные этапы обработки после извлечения для всех образцов для обеспечения методологической согласованности и сопоставимости.
  2. Методы биофизической экстракции
    1. Экстракция с использованием мацерации (MAE)
      1. Поместите образец порошка T. claveryi в закрытый контейнер для экстракции.
      2. Добавьте выбранный растворитель, сохраняя постоянное соотношение растворителя к твёрдому телу.
      3. Инкубировать смесь при комнатной температуре в тёмных условиях в течение 72 часов.
      4. Держите контейнеры закрытыми, чтобы предотвратить испарение растворителя.
      5. Не применяйте внешнее перемешивание в период мацерации.
      6. Дайте смеси осесть в конце периода экстракции.
      7. Отфильтруйте экстракт перед дальнейшей обработкой.
    2. Экстракция Сокслета (SE)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечивайте правильную циркуляцию воды в конденсаторе и избегайте сухого нагрева во время рефлюкса.
      1. Поместите образец порошка в наперсток для экстракции целлюлозы.
      2. Разместите наперсток внутри камеры экстракции Soxhlet, соединённой с колбой с круглым дном.
      3. Добавьте выбранный растворитель в колбу, сохраняя постоянное соотношение растворителя к твёрдому телу.
      4. Нагрейте растворитель до рефлюкса с помощью термостатически управляемой нагревательной мантии.
      5. Поддерживайте непрерывную экстракцию в течение 24 часов.
      6. Поддерживайте температуру экстракции при температуре кипения каждого растворителя (н-гексан: 68,7 °C; этилацетат: 77,1 °C; метанол: 64,7 °C; ацетон: 56 °C; дистиллированная вода: 100 °C).
    3. Ультразвуковая экстракция (ОАЭ)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Постоянно контролируйте температуру, чтобы избежать перегрева во время звуковой обработки.
      1. Поместите порошок образца T. claveryi в сосуд для экстракции.
      2. Добавьте выбранный растворитель, сохраняя постоянное соотношение растворителя к твёрдому телу.
      3. Соник смеси на фиксированной частоте 35 кГц и выходной мощности 520 Вт в течение 25 минут.
      4. Поддерживайте температуру экстракции примерно на уровне 30 °C.
      5. Добавляйте лёд с интервалом в 5 минут, чтобы поддерживать температуру в пределах 25–28 °C во время соникации.
  3. Эффективность извлечения
    1. Взвесьте засохший грибной материал (Wp) перед извлечением.
    2. Взвесьте высушенный сырой экстракт (Wи далее) после полного удаления растворителем.
    3. Рассчитайте эффективность экстракции с помощью уравнения (1).
      figure-protocol-1(1)
    4. Каждый высушенный экстракт сырого сырья повторно растворите в соответствующем растворителе, чтобы получить стандартный раствор в стандартизированной концентрации 10 мг/мл.
    5. Готовьте запасные растворы заново перед каждым экспериментом по биоактивности in vitro .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартизируйте все концентрации экстрактов, чтобы обеспечить сопоставимость дозировки при последующих анализах биоактивности.

3. Определение антиоксидантной активности

  1. Проведите анализ антиоксидантной активности с использованием тестов DPPH, ABTS и FRAP.
  2. Приготовьте пять различных концентраций экстрактов от 0,25 до 1,0 мг/мл из свежеприготовленных бульонных растворов.
  3. Проводите все измерения в трёх экземплярах для обеспечения воспроизводимости.
  4. Зафиксируйте значения поглощения спектрофотометрически с помощью считывателя микропластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите все анализы в соответствии с установленными протоколами литературы с незначительными изменениями.
  5. Активность по отбору радикалов DPPH
    ПРИМЕЧАНИЕ: Радикальная активность экстрактов T. claveryi по DPPH была оценена по методу, описанному в литературе, с незначительнымиизменениями 30. Защитите раствор DPPH и реакционные смеси от воздействия света.
    1. Приготовьте раствор DPPH в 70% метанола.
    2. Отрегулируйте раствор DPPH на поглощение 1,00 ± 0,02 при 517 нм.
    3. Пипетта 50 мкл экстракта в различных концентрациях в микропластинчатую яму.
    4. Добавьте 250 мкл раствора DPPH в каждую скважину.
    5. Инкубировать реакционную смесь в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут.
    6. Измерьте поглощение на 517 нм с помощью микропластинчатого спектрофотометра.
    7. Используйте метанол как отрицательный контроль, а аскорбиновую кислоту — как положительный.
    8. Постройте кривые доза-ответ и рассчитайте значения IC₅₀ для количественной оценки радикальной активности скавенга.
  6. Активность по очистке радикалов катионов ABTS
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите радикальный анализ ABTS по методу, описанному в литературе, с незначительными изменениями31. Приготовьте радикальный раствор ABTS⁺ не менее чем за 16 часов до использования и защитите его от света.
    1. Получите радикальный раствор ABTS, инкубировав реакционную смесь в темноте при комнатной температуре в течение 16 часов.
    2. Разведите 1 мл раствора ABTS 80 мл этанола перед анализом.
    3. Отрегулируйте поглощение разбавлённого раствора ABTS на 0,80 ± 0,02 при 734 нм.
    4. Пипетта 50 мкл экстракта в различных концентрациях в микропластинчатую яму.
    5. Добавьте 250 мкл раствора ABTS в каждую скважину.
    6. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 10 минут.
    7. Измерьте поглощение на 734 нм с помощью микропластинчатого спектрофотометра.
    8. Постройте кривые доза–ответ и вычислите значения IC₅₀.
  7. Тест на восстанавливающую антиоксидантную мощность железы (FRAP)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите FRAP-анализ по предложенному в литературе методе, с незначительными изменениями32. Подготовьте реагент FRAP свежим перед использованием и защитите реакционную смесь от света.
    1. Подготовьте реагент FRAP согласно указанному протоколу.
    2. Пипетте 20 мкл экстракта в различных концентрациях в микропластинчатую яму.
    3. Добавьте 280 мкл свежеприготовленного реагента FRAP.
    4. Инкубировать реакционную смесь при комнатной температуре в темноте в течение 45 минут.
    5. Измерьте поглощение при 593 нм с помощью микропластинного спектрофотометра.
    6. Сгенерируйте калибровочную кривую с использованием Trolox в качестве стандарта.
    7. Экспрессируйте антиоксидантную способность в эквиваленте мг тролокса (TE) на грамм экстракта.

4. Анализ общего фенольного содержания (TPC)

ПРИМЕЧАНИЕ: Определите общее фенольное содержание (TPC) экстрактов T. claveryi с помощью метода Фолина–Чиокальтеу, описанного в литературе, с незначительными изменениями33. Защитите реакционные смеси от света во время инкубации. Приготовьте раствор карбоната натрия свежим перед использованием.

  1. Приготовьте экстрактные растворы в концентрации 1 мг/мл из свежеприготовленных бульонных растворов.
  2. Пипетте 25 мкл экстракта в микропластинчатую яму, добавьте 75 мкл дистиллированной воды, а затем 25 мкл реагента Фолин–Чиокальтеу.
  3. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 6 минут.
  4. Добавьте в каждую скважину 100 мкл раствора карбоната натрия 7% (w/v).
  5. Инкубировать реакционную смесь при комнатной температуре в темноте в течение 90 минут.
  6. Измерьте поглощение при 665 нм с помощью микропластинчатого спектрофотометра.
  7. Подготовьте калибровочную кривую с использованием галловой кислоты в качестве стандарта и вычислите общее содержание фенолов, выражая результаты в эквиваленте галловой кислоты (GAE) на мл экстракта.

5. Фитохимический анализ с использованием LC-MS/MS

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите анализ LC-MS/MS согласно ранее опубликованным хроматографическим методам с незначительнымиизменениями 34. Фильтруйте все образцы и подвижные фазы через мембранные фильтры диаметром 0,22 мкм и дегазируйте подвижные фазы перед анализом.

  1. Выберите экстракт с самым высоким содержанием фенолов для количественного фитохимического профилирования.
  2. Проведите хроматографическое разделение с помощью колонки C18 с обратной фазой при 30°C.
  3. Подготовьте подвижную фазу, состоящую из (A) 0,1% муравьиной кислоты в деионизированной воде и (B) 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле, установите расход на 0,4 мл/мин, отрегулируйте объём впрыска до 5 мкл и установите общее время работы на 17 минут.
  4. Проводить масс-спектрометрическое обнаружение в условиях электрораспыляющей ионизации (ESI), используя азот в качестве сушки, оболочки и небулайзерного газа.
  5. Установите температуру сушки газа на 350 °C с расходом 12 л/мин, температуру оболочного газа на 250 °C с расходом 5 л/мин и отрегулируйте давление небулайзера на 55 psi.
  6. Подготовьте внешние калибровочные кривые для каждого фенольного стандарта и количественно оцените анализируемые вещества с помощью соответствующих калибровочных кривых.

6. Тест на антимикробную активность

ПРИМЕЧАНИЕ: Оценивайте антибактериальную активность с помощью метода диффузии агарных скважин согласно установленным микробиологическим протоколам. Выполняйте все микробиологические процедуры в асептических условиях в шкафу для биобезопасности. Стерилизуйте все материалы до и после использования.

  1. Выберите следующие типовые штамы для антимикробного тестирования: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus cereus ATCC 14579, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Listeria monocytogenes ATCC 19115, Acinetobacter baumannii ATCC 17978, Shigella dysenteriae ATCC 13313, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, иEnterobacter aerogenes ATCC 13048.
  2. Каждый бактериальный штамм инокулируем в триптоновый соевый бульон (TSB) и инкубировать при оптимальной температуре роста до достижения оптической плотности OD₆₀₀ = 0,7.
  3. Равномерно распределите бактериальные культуры на пластины триптонного соевого агар (TSA) с помощью стерильного мазка.
  4. Punch проникает асептически в агар с помощью стерильного пробкового сверлителя.
  5. Добавьте по 100 мкл каждого экстракта (100 мкг/мл) в соответствующие скважины.
  6. Инкубировать тарелки при 37 °C в течение 18 часов.
  7. Измерьте диаметры зон ингибирования вокруг каждой скважины для оценки антимикробной активности.
  8. Проведите все эксперименты в тройном экземпляре и выражайте результаты в среднем значении.

7. Ингибирование биопленки

ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените активность антибиопленки с помощью кристаллического фиолетового окрашивателя на основе эталонных бактериальных штаммов. Выполняйте все процедуры в асептических условиях и избегайте нарушения прилипшей биопленки во время процедур промывания.

  1. Выберите Escherichia coli ATCC 25922 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 в качестве эталонных штаммов и культивируйте их в TSB при 37 °C до перехода в логарифмическую фазу роста.
  2. Отрегулировать бактериальные суспензии до оптической плотности OD₆₀₀ = 0,132.
  3. Пипетить 100 мкл растворов экстракта (0,625–10 мг/мл) в стерильные 96-колодцевые микропластины из полистирола, добавить 100 мкл бактериальной суспензии в каждую скважину и аккуратно перемешать.
  4. Инкубировать тарелки при 37 °C в течение 24 часов. Используйте колодцы, содержащие только TSB, в качестве заготовок и колодцы с бактериальной суспензией без экстракта, в качестве контроля.
  5. Аккуратно удалите неприлипающие клетки, дважды промойте колодцы дистиллированной водой и дайте пластинам высохнуть на воздухе.
  6. Добавьте в каждую скважину 200 мкл раствора кристаллической фиолетовой 0,4% (w/v) и инкубируете 30 минут.
  7. Удалите лишние пятна, дважды прополосните колодцы дистиллированной водой и дайте пластинам полностью высохнуть.
  8. Добавьте этанол для растворения связанного красителя и измерите поглощение при 595 нм с помощью считывателя микропластин.
  9. Рассчитайте активность антибиопленки с помощью уравнения (2).
    figure-protocol-2(2)

8. Анализ клеточной культуры и цитотоксической активности (MTT-анализ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените цитотоксические эффекты с помощью МТТ-анализа согласно стандартным протоколам жизнеспособности клеток. Выполняйте все процедуры в стерильных условиях в шкафу для биобезопасности и предварительно нагрейте среду и реагенты до 37 °C перед использованием.

  1. Получить линию клеток человеческой нейробластомы SH-SY5Y из аккредитованного клеточного хранилища и культивировать клетки в модифицированной среде Eagle (DMEM) Dulbecco, дополненных 10% сывороткой плода (FBS), 1% пенициллином/стрептомицином и 1% L-глутамином в колбах размером 25см² .
  2. Поддерживайте культуры при 37 °C в увлажнённой атмосфере с содержанием 5%CO2 и увеличивайте слияние клеток примерно до 80%.
  3. Отдельте клетки трипсинизацией, засейте их в пластины с 96 лунками плотностью 2 × 104 клеток в колодце и инкубируют 24 часа для прикрепления.
  4. Обрабатывайте клетки экстрактами T. claveryi в концентрациях 150, 300, 600, 1200 и 2000 мкг/мл и инкубируют в течение 24 часов.
  5. Удалите культурную среду, добавьте 100 мкл свежей среды с 10 мкл раствора MTT в каждую скважину и инкубируем 4 часа при 37 °C.
  6. Аспирировать среду, растворить кристаллы формазана, добавляя 100 мкл диметилсульфоксида (DMSO) в каждую скважину и измерять поглощение на 570 нм с помощью микропластинчатого спектрофотометра.
  7. Проводите все эксперименты в трёх экземплярах.

figure-protocol-3
Рисунок 1: Схематический обзор экспериментального рабочего процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

9. Статистический анализ

  1. Проводить статистический анализ с использованием соответствующих статистических программных пакетов и сравнивать контрольные и лечебные группы с использованием t-теста Стьюдента или двустороннего анализа дисперсии (ANOVA) по мере необходимости.
  2. Выражать все данные как среднее ± стандартной ошибке среднего значения (SEM).
  3. Определим статистическую значимость при p < 0,05.
  4. Указывайте статистическую значимость на рисунках с помощью звёздочек следующим образом: **** для p < 0,0001, *** для p < 0,001, ** для p < 0,01 и * для p < 0,05, и используйте "ns" для обозначения незначимости.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Молекулярная идентификация T. claveryi
ПЦР-амплификация области ITS проводилась с использованием универсальных праймеров ITS1 и ITS4 для молекулярной идентификации T. claveryi. Полученные последовательности анализировались и сравнивались с эталонными в базе данных NCBI с использованием алгоритма BLAST, что позволило окончательно идентифицировать вид (Дополнительный файл 1).

Эффективность извлечения...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящее исследование устанавливает сравнительную и стандартизированную платформу экстракции и биоактивности для T. claveryi, демонстрируя, что стратегия экстракции является решающим фактором как химического состава, так и биологической функциональности. Основная методологическая сила этого протокола заключается в строгом контроле параметров экстракции, в частности фиксированного соотношения твердо-жидкости, стандартизированного объёма растворителя, идентичной обработки после э...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах. Все данные, подтверждающие результаты данного исследования, доступны в основной рукописи и дополнительных информационных файлах. Наборы данных, созданные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявили, что это исследование не получило финансовой поддержки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96-колодцевые микротитровые пластины из полистиролаNest Scientific701001Клеточная культура / анализные пластины
ABTS (2,2'-азино-бис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота))Сигма-ОлдричA3219Анализ на катионные радикальные анализы
Ацетон (аналитическая степень)Сигма-Олдрич179124Растворитель для экстракции
Ацетонитрил (класс LC-MS)Сигма-Олдрич34851Органическая подвижная фаза
Acinetobacter baumanniiATCCМанассас, Вирджиния, СШАATCC 17978
Тройной четырёхцилиндровый LC-MS/MS с системой 1290 Infinity UPLCAgilent Technologies6460Количественный анализ
Аналитическая колонка (C18, 4,6 и раз; 100 мм, 3,5 и м; m)Agilent Technologies (Zorbax)959990-902Столбец обратной фазы
Антиоксидантные стандарты (аскорбиновая кислота / тролокс)Сигма-ОлдричA7506 / 238813Положительные контроли
Анализаторы ДНК Applied Biosystems 3730xlПрикладные биосистемы ДНК-анализаторы 3730xlСистема секвенирования ДНК
Прикладные биосистемы и торговля; BigDye™ Комплект секвенирования циклов Terminator версии 3.1Прикладные биосистемы 4337455Набор для секвенирования Сэнгера
Bacillus cereusATCCМанассас, Вирджиния, СШАATCC 14579
Биоинформатический анализ, программное обеспечение BioEdit, используемый алгоритм: сборка CAP contigIbis BiosciencesNAПрограммное обеспечение для сборки последовательностей
Наперсток для экстракции целлюлозыFisherbrand™  11724043Используется для экстракции Soxhlet.
Диметилсульфоксид (DMSO)Merck102952Растворитель
Набор для изоляции ДНК (Plant& Набор для изоляции ДНК грибов (Польша)EurX GeneMATRIXE3595Выделение ДНК 
DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил)Сигма-ОлдричD9132Радикальный анализ на подбор
Модифицированный Eagle Medium от DulbeccoКозерог и bbsp;DMEM-HA
Enterobacter aerogenesATCCМанассас, Вирджиния, СШАATCC 13048
Энтерококк фаекалисATCCМанассас, Вирджиния, СШАATCC 29212
Escherichia coliATCCМанассас, Вирджиния, СШАATCC 25922
ЭтанолMerck100983Растворитель
ЭтилацетатMerck109623Экстракционный растворитель
Сыворотка для плода быка (FBS)Capricorn ScientificFBS-16A
BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing KitThermoFisher4337455Набор секвенирования
Реагент Фолин-ЧиокальтеуSigma-Aldrich 47641Общее фенольное содержание
Муравьиная кислотаSigma-Aldrich 33015Мобильный фазовый аддитив
Галловая кислотаКарло Эрба406335Кривая калибровки
Gene MATRIX Plant& Набор для изоляции ДНК грибовEurX E3595Набор для выделения ДНК
GraphPad Prism (v9)Визуализация данных и статистический анализН/ДСтатистический анализ
Нагревательная мантияЭлектротермальные и bbsp;EME30500Используется для поддержания рефлюкса растворителя
HighPrep™ Система очистки ПЦРМАГБИОAC-60005
ЛёдЛабораторный уровень—Контроль температуры в ОАЭ
Klebsiella pneumoniaeATCCМанассас, Вирджиния, СШАATCC 13883
L-глутаминCapricorn ScientificГермания
Listeria monocytogenesATCCМанассас, Вирджиния, СШАATCC 19115
ЛиофилизаторScientzН/ДСублимационная сушка экстрактов
Магнитная бусина и даш; Система очистки на основе ПЦРМАГБИОAC-60005ПЦР
МетанолMerck106009Растворитель для экстракции
n-ГексанMerck103701Растворитель для экстракции
Пенициллин/стрептомицинCapricorn ScientificГермания
Pseudomonas aeruginosaATCCМанассас, Вирджиния, СШАATCC 27853
Фильтрующая бумага (No 541)Цитива1541–125 VВ процессе фильтрации экстракта
Роторный испарительBuchi R10011100V101Удаление растворителя
Дизентерии шигеллыATCCМанассас, Вирджиния, СШАATCC 13313
Карбонат натрияMerck106392Тотальный фенольный анализ
SPECTROstar Nano Microplate Reader BMG LabtechИзмерения поглощения
Золотистый стафилококкATCCМанассас, Вирджиния, СШАATCC 25923
Staphylococcus epidermidisATCCМанассас, Вирджиния, СШАATCC 12228
Программное обеспечение для статистического анализа (SPSS, v23)Анализ данныхNA
Thermo Scientific Nanodrop 2000 Термо Фишер СайентификND-2000
Триптон соевый агар (TSA)MerckГермания—
Соевый бульон из триптона (TSB)MerckГермания—
Ультразвуковой гомогенизаторScientzSCIENTZ-650LЭкстракция с помощью ультразвука

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wasser, S. P., Weis, A. L. Medicinal properties of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: current perspectives (Review). Int. J. Med. Mushrooms. 1 (1), 31-62 (1999).
  2. Wasser, S. P. Current findings, future trends, and unsolved problems in studies of medicinal mushrooms. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89 (5), 1323-1332 (2011).
  3. Badalyan, S. Medicinal aspects of edible ectomycorrhizal mushrooms. Edible Ectomycorrhizal Mushrooms: Current Knowledge and Future Prospects. Zambonelli, A., Bonito, G. M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 317-334 (2012).
  4. El Enshasy, H. A., Hatti-Kaul, R. Mushroom immunomodulators: unique molecules with unlimited applications. Trends Biotechnol. 31 (12), 668-677 (2013).
  5. Morte, A., Kagan-Zur, V., Navarro-Ródenas, A., Sitrit, Y. Cultivation of desert truffles—A crop suitable for arid and semi-arid zones. Agronomy. 11 (8), 1462(2021).
  6. Gutiérrez, A., Morte, A., Honrubia, M. Morphological characterization of the mycorrhiza formed by Helianthemum almeriense Pau with Terfezia claveryi Chatin and Picoa lefebvrei (Pat.) Maire. Mycorrhiza. 13 (6), 299-307 (2003).
  7. Loizides, M., Hobart, C., Konstandinides, G., Yiangou, Y. Desert truffles: the mysterious jewels of antiquity. Field Mycology. 13 (1), 17-21 (2012).
  8. Atila, F., Kazankaya, A. Terfezia species natural distributed in Türkiye and their ecologies. Mantar Dergisi. 13 (3), 119-130 (2022).
  9. Türkoğlu, A., Castellano, M., Trappe, J., Yaratanakul Güngör, M. Turkish truffles I: 18 new records for Turkey. Turkish J. Bot. 39, 359-376 (2015).
  10. Doğan, H., Kurt, F. New macrofungi records from Turkey and macrofungal diversity of Pozantı-Adana. Turkish J. Bot. 40, 209-217 (2016).
  11. İnci, Ş, Kırbağ, S. Nutritional content, antioxidant and antimicrobial activity of Terfezia claveryi Chatin. Artvin Çoruh Univ. J. For. Fac. 19 (2), 138-143 (2018).
  12. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J. Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  13. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P T. 40 (4), 277-283 (2015).
  14. Cushnie, T. P. T., Lamb, A. J. Antimicrobial activity of flavonoids. Int. J. Antimicrob. Agents. 26 (5), 343-356 (2005).
  15. Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 39 (1), 44-84 (2007).
  16. Morte, A., Honrubia, M., Gutiérrez, A. Biotechnology and cultivation of desert truffles. Mycorrhiza: State of the Art. Varma, A. , 467-483 (2008).
  17. Corrêa, R. C. G., et al. Biotechnological, nutritional and therapeutic uses of Pleurotus spp. related with its chemical composition: a review. Trends Food Sci Technol. 50, 103-117 (2016).
  18. Ma, G., et al. A critical review on the health promoting effects of mushrooms nutraceuticals. Food Sci. Hum. Wellness. 7 (2), 125-133 (2018).
  19. Reis, F. S., et al. Functional foods based on extracts or compounds derived from mushrooms. Trends Food Sci. Technol. 66, 48-62 (2017).
  20. Mandeel, Q. A., Al-Laith, A. A. Ethnomycological aspects of the desert truffle among native Bahraini and non-Bahraini peoples. J. Ethnopharmacol. 110 (1), 118-129 (2007).
  21. Patel, S. Food, health and agricultural importance of truffles: a review. Curr. Trends Biotechnol. Pharm. 6, 15-27 (2012).
  22. Janakat, S., Nassar, M. Hepatoprotective activity of desert truffle (Terfezia claveryi) compared with Nigella sativa in rats. Pak. J. Nutr. 9, 52-56 (2010).
  23. Al-Laith, A. A. A. Antioxidant components and activities of desert truffle (Tirmania nivea). J. Food Compos. Anal. 23 (1), 15-22 (2010).
  24. Shavit, E., Shavit, E. The medicinal value of desert truffles. Desert Truffles. Kagan-Zur, V., Roth-Bejerano, N., Sitrit, Y., Morte, A. 38, 323-340 (2014).
  25. Patel, S., et al. Potential health benefits of natural products derived from truffles. Trends Food Sci. Technol. 70, 1-8 (2017).
  26. Beara, I. N., et al. Phenolic profile, antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxic activities of truffles. Food Chem. 165, 460-466 (2014).
  27. Dahham, S. S., et al. Antioxidant, anticancer and apoptosis properties of Terfezia claveryi. Saudi J. Biol. Sci. 25 (8), 1524-1534 (2018).
  28. Azmir, J., et al. Techniques for extraction of bioactive compounds: a review. J. Food Eng. 117 (4), 426-436 (2013).
  29. Kumar, M., Shukla, P. K. PCR targeting of ITS regions for rapid diagnosis of mycotic keratitis. J. Clin. Microbiol. 43 (2), 662-668 (2005).
  30. Bondet, V., Brand-Williams, W., Berset, C. Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH method. LWT Food Sci. Technol. 30, 609-615 (1997).
  31. Re, R., et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS assay. Free Radic. Biol. Med. 26 (9-10), 1231-1237 (1999).
  32. Đorđević, T. M., et al. Effect of fermentation on antioxidant properties of cereals. Food Chem. 119 (3), 957-963 (2010).
  33. Herald, T. J., et al. High-throughput micro plate assays for screening flavonoid content and DPPH-scavenging activity in sorghum bran and flour. Sci. Food Agric. 92 (11), 2326-2331 (2012).
  34. Kısa, D., et al. Evaluation of Biological Potency of two Endemic Species Integrated with in vitro and in silico Approches: LC-MS/MS Analysis of the Plants. Chem. Biodivers. 21 (3), e202301351(2024).
  35. Kumoro, A., Singh Hasan, Effects of solvent properties on the soxhlet extraction of diterpenoid lactones from andrographis paniculata leaves. ScienceAsia. 35, 306-309 (2009).
  36. Ng, Z. X., Samsuri, S. N., Yong, P. H. The antioxidant index and chemometric analysis of tannin, flavonoid, and total phenolic extracted from medicinal plant foods with the solvents of different polarities. Food Process. Preserv. 44 (9), e14680(2020).
  37. Kıvrak, İ Analytical methods applied to assess chemical composition, nutritional value and ın vitro bioactivities of Terfezia olbiensis and Terfezia claveryi from Turkey. Food Anal. Methods. 8 (5), 1279-1293 (2015).
  38. Neggaz, S., et al. In vitro evaluation of antioxidant, antibacterial and antifungal activities of Terfezia claveryi Chatin. Phytothérapie. 13, 1-7 (2015).
  39. Monteiro, M., et al. Effect of extraction method and solvent system on the phenolic content and antioxidant activity of selected macro- and microalgae extracts. J. Appl. Phycol. 32 (1), 349-362 (2020).
  40. Pingret, D., et al. Degradation during application of ultrasound in food processing: A review. Food Control. 31, 593-606 (2013).
  41. Şahin, A., et al. Total phenol, antioxidant activity, fatty acid composition and mineral contents of the species of fungi known as domalan. J. Agroalimentary Process. Technol. 26 (3), 149-154 (2020).
  42. Fidan, M., et al. cytotoxic and protective effects of truffles. Anal. Biochem. 641, 114566(2022).
  43. Awika, J. M., et al. Screening methods to measure antioxidant activity of sorghum (sorghum bicolor) and sorghum products. J. Agric. Food Chem. 51 (23), 6657-6662 (2003).
  44. Gursoy, N., et al. Antioxidant activities, metal contents, total phenolics and flavonoids of seven Morchella species. Food Chem. Toxicol. 47 (9), 2381-2388 (2009).
  45. Elsayed, E., et al. Truffles: A potential source of bioactive compounds. Bioactive Compounds in Food. , CRC Press. 163-174 (2021).
  46. Elsayed, E. A., et al. Mushrooms: a potential natural source of anti-inflammatory compounds for medical applications. Mediators Inflamm. 2014, 805841(2014).
  47. Stanikunaite, R., et al. Cyclooxygenase-2 inhibitory and antioxidant compounds from the truffle Elaphomyces granulatus. Phytother. Res. 23 (4), 575-578 (2009).
  48. Doğan, H. H., Aydın, S. Determination of antimicrobial effect, antioxidant activity and phenolic contents of desert truffle in Turkey. Afr. J. Tradit. Complement. Altern. Med. 10 (4), 52-58 (2013).
  49. Abu-Odeh, A., et al. In vitro and In vivo Antidiabetic Activity, phenolic content and microscopical characterization of Terfezia claveryi. Molecules. 27 (15), 4843(2022).
  50. Nguyen, V., et al. Chlorogenic Acid: A systematic review on the biological functions, mechanistic actions, and therapeutic potentials. Nutrients. 16 (7), 924(2024).
  51. Suhag, R., et al. Mapping antioxidant mechanisms in plant extracts via reactivity kinetics inhibiting oil autoxidation. Appl. Food Res. 5 (2), 101476(2025).
  52. Harir, M., et al. Evaluation of antimicrobial activity of Terfezia arenaria extracts collected from Saharan desert against bacteria and filamentous fungi. 3 Biotech. 9 (7), 281(2019).
  53. Hamza, A., et al. Nutraceutical potential, antioxidant and antibacterial activities of Terfezia boudieri Chatin, a wild edible desert truffle from Tunisia arid zone. Arab. J. Chem. 9 (3), 383-389 (2016).
  54. Neggaz, S., et al. In vitro evaluation of antioxidant, antibacterial and antifungal activities of Terfezia claveryi Chatin. Phytothérapie. 13, 1-7 (2020).
  55. Dib, S., Fortas, Z. Antimicrobial activities of desert truffle extracts and their chemical ıdentification. J. Pharm. Pharmacol. 7, 1-7 (2019).
  56. Gargano, M. B., et al. Antimicrobial activity of the extracts of Terfezia Claveryi and Tirmania Pinoyi against gram-positive and gram-negative bacteria causal agent of diseases in tomato. Chem. Eng. Trans. 58, 73-78 (2017).
  57. Khojah, H. M. J., et al. Antimicrobial efficacy of extracts of Saudi Arabian desert Terfezia claveryi truffles. Saudi J. Biol. Sci. 29 (11), 103462(2022).
  58. Akyüz, M., et al. Cytotoxicity and DNA protective effects of the Terfezia and Picoa species from the eastern region of Turkey. Istanbul J. Pharm. 51 (2), 198-203 (2021).
  59. Al Obaydi, M. F., et al. Terfezia boudieri: A Desert Truffle With Anticancer and Immunomodulatory Activities. Front. Nutr. 7, 38(2020).
  60. Pakrashi, S., et al. Quercetin alleviates 6-OHDA-caused apoptosis in SH-SY5Y cells. Toxicol. Res. 13 (4), tfae117(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Terfezia ClaveryiExtraction MethodsIn Vitro BioactivityAntioxidant ActivityAntimicrobial ActivityCytotoxic ActivityUltrasound Assisted ExtractionMaceration Assisted ExtractionPhenolic CompoundsLC MS MS Analysis

Related Articles