Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Мышиная модель донорской лимфатической абляции сердца с помощью электрокоагуляции для исследований трансплантации

262 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69959

⸱

16 января 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Xenotransplantation, Animal Experimental Centre, National Centre for Cardiovascular Disease, Department of Cardiac Surgery, State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, National Center for Cardiovascular Diseases, Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали новую мышиную модель донорской сердечной лимфатической абляции при трансплантации сердца. Эта модель демонстрирует, что нарушение донорской лимфатической системы ослабляет острое отторжение, снижает повреждение миокарда и продлевает выживаемость трансплантата, предоставляя новые представления о лимфатической функции сердца в иммунитете трансплантации.

Аннотация

Хотя в последние годы сердечно-лимфатические сосуды привлекают всё большее внимание, связь между донорской сердечно-сердечной лимфатической системой и острым отторжением при трансплантации сердца остаётся проясненной.

Электрофизиологическая активность сердца оценивалась с помощью электрокардиографии (ЭКГ) у нормальных мышей до и после сердечной лимфатической абляции. Основные лимфатические сосуды донорских сердец визуализировались с помощью инъекции Эванса Блю и затем абляцировались с помощью электрокоагуляции. Была создана модель трансплантации сердца, включающая донорскую лимфатическую дисфункцию сердца, на основе сердца, подвергшихся лимфатической абляции. Функция сердечного трансплантата оценивалась с помощью эхокардиографии, вестерн-блоттинга и ИФЗ. Влияние донорской лимфатической абляции на острое отторжение оценивалось с помощью окрашивания гематоксилин-эозином (HE) и мониторинга времени выживаемости трансплантата.

Результаты ЭКГ не показали значимых изменений в электрофизиологии сердца до и после лимфатической абляции, что подтверждает, что крупные сосуды сердца остались неповреждёнными. Эванс Блю был введён в вершину сердца для маркировки лимфатических сосудов. Основные лимфатические вещества затем абляцировались с помощью электрокоагуляции. После завершения процедуры абляции мыши были гепаринизованы, а их сердца были извлечены. Аорта и легочная артерия были пересечени, а верхняя и нижняя полая вена вместе с легочными венами были связаны. Затем были пересадены подготовленные (абляционные) донорские сердца. Уровни cTnI и фракция выброса показали, что лимфатическая абляция не усугубляет повреждения сердца. HE окрашивание показало, что абляция донорских сердечных лимфатических систем облегчает острое отторжение, снижает повреждение миокарда и продлевает выживаемость трансплантата.

Мы успешно разработали модель трансплантации мышиного сердца с донорской лимфатической дисфункцией сердца и показали, что абляция донорских сердечных лимфатических заболеваний может смягчить острое отторжение, ослабить повреждение миокарда и продлить выживаемость трансплантата. Эти результаты дают новые знания и основу для понимания роли сердечной лимфатической системы в трансплантации сердца.

Введение

Отторжение сердечного аллотрансплантата остаётся одним из самых частых и серьёзных осложнений после трансплантации сердца, в основном классифицируемым на острое клеточное отторжение и отторжение, опосредованное антителами. Хотя современные иммуносупрессивные методы значительно повысили выживаемость трансплантата, отторжение по-прежнему остаётся основным фактором исходов трансплантации. Согласно литературе, примерно 12% пациентов испытывают хотя бы один эпизод умеренного или тяжёлого острого отторжения в течение первого года послетрансплантации 1.

Сердечная лимфатическая система привлекает всё больше внимания за свою потенциальную роль в отторжении трансплантатов. Помимо хорошо устоявшихся функций в балансе жидкости и иммунном надзоре, лимфатическая система играет важную роль в модулировании иммунных ответов. Лимфатические сосуды служат основными каналами для входа и выхода иммунных клетокиз тканей 2,3. В сердце лимфатическая сеть обеспечивает фундаментальную инфраструктуру для транспортировки и рециркуляции иммунных клеток, включая лимфоциты. По этому пути лимфоциты мигрируют из кровотока в межмежпространство, где осуществляют иммунный надзор. Затем они дренируются в лимфатические узлы и в конечном итоге возвращаются в системныйкровообращение 2,4. Кроме того, исследования показывают, что Т-клетки и их подгруппы играют центральную роль в острых реакциях на отторжение, а активация и миграция этих клеток могут зависеть от лимфатическойсистемы 5.

Хотя известно, что лимфатические сосуды существуют в сердце и образуют сети, аналогичные кровеносным сосудам, их значение за эти годы не получало сравнительного внимания. Исследования показали, что отсутствие функциональных лимфатических сосудов приводит к выраженной гипертрофии и отёкам сердца, что указывает на ключевую роль лимфатических сосудов в поддержании гомеостаза сердечнойткани 6. Кроме того, нарушенный или отсутствующий лимфатический дренаж может снижать эффективность клиренса воспалительных клеток, тем самым усугубляя локальные воспалительные реакции и влияя на процесс ремоделированиясердца 7.

При сердечно-сосудистых заболеваниях существуют различные вмешательства, направленные на лимфатические сосуды. В мышиных моделях сердечный лимфатический дефицит может быть вызван генерацией мышей Vegfc+/- 8. Клинически для лечения хилозного перикардического выпота могут применяться интервенционная медиастинальная лимфатическаяэмболизация 9 и минимально инвазивная перикардиальная операция10. Для пациентов с физиологией циркуляции Фонтана лимфатическая декомпрессия может быть выполненахирургическим путём 11, чрескожной декомпрессией грудных протоков 12 или установлением лимфовенозного анастомоза13. Методы окклюзии включают эмболизацию грудныхпротоков 14, селективную эмболизацию лимфатическихпротоков 15 и лигацию грудныхпротоков 16. Однако прямые вмешательства, направленные на самих лимфатические сосуды сердца, остаются ограниченными.

Учитывая критическую роль сердечных лимфатических сосудов, мы создали новую модель трансплантации мышиного сердца, абляцируя основные лимфатические сосуды в донорских сердцах с помощью электрокоагуляции. Эта модель была использована для изучения влияния лимфатической дисфункции донорского трансплантата на острое отторжение после трансплантации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Самцы мышей C57BL/6J и BALB/c (самцы, 6-8 недель, вес 25-28 г) содержались в определённых условиях, свободных от патогенов. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с протоколами, утверждёнными Комитетом по этике животных больницы Фувай (номер одобрения: 0108-7-800-ZX(X)-019).

Визуализация и абляция сердечных лимфатических сосудов у мышей
Для имитации сердечно-лимфатической дисфункции крупные сердечные лимфатические сосуды были абляцированы с помощью электрокоагуляции.

Все мыши были анестезиированы через внутрибрюшинную инъекцию 1,25% триброметанола при дозировке 0,2 мл на 10 г массы тела и механически вентилировались на протяжении всей процедуры. После анестезии трибромеэтанолом мыши BALB/c прошли эндотрахеальную интубацию с помощью катетера 22-го калибра и были подключены к электрокардиограмме (ЭКГ) (рисунок 1A, дополнительный рисунок S1). В параметрах аппарата вентиляционной вентиляции дыхательные данные были установлены на уровне 1:1 или 1:2, с приливным объёмом 0,3 мл и частотой дыхания 100 вдохов в минуту. После подключения катетера к аппарату ИВЛ состояние мыши тщательно отслеживалось; Интубация считалась успешной, если частота дыхания мыши совпадала с частотой аппарата искусственной вентиляции лёгких, тогда как нестабильные частоты или вздутие живота указывали на неудачу, требующую повторной интубации. Затем была проведена торакотомия в левом межреберном пространстве 3–4 с длиной разреза примерно 1 см, а ретрактор использовался для обнажения всего сердца (рисунок 1B). Впоследствии 5 мкл синего красителя Эванса было введено внутримышечно в вершину сердца для визуализации лимфатических сосудов, с периодом ожидания в 1 минуту после инъекции для полной мутности (рисунок 1C, E; Дополнительный рисунок S2A-B), отмечая, что синий Эванс должен вводиться очень медленно. После визуализации расположение основных сердечных лимфатических сосудов было подтверждено путём сравнения с ранее опубликованными анатомическимиданными 17,18, а абляция проводилась с помощью электрокоагуляторной ручки, установленной на 10 Вт в непрерывном режиме, с временем коагуляции примерно 3–7 секунд (см. рисунок 1D,F). Электрокардиография (ЭКГ) проводилась до и после абляции для обеспечения отсутствия сосудистых повреждений (рисунок 1G,H). Наконец, после крупной лимфатической абляции мышей гепаринизировали в подготовке к последующему взятию донорского сердца. Схематическое изображение хирургической процедуры приведено на рисунке 2.

Трансплантация гетеротопического сердца на брюшной полости
Гетеротопическая трансплантация сердца в брюшную полость мышей была проведена, как описаноранее 19. Краткий протокол приведен ниже:

Донорская процедура
Лапаротомия была проведена вдоль линии альба у мышей с BALB/c, а 1 мл гепаринового физиологического раствора с содержанием 50 U/mL при температуре 4 °C был введен в нижнюю полую вену, а брюшная аорта была разрезана для индуцирования системной гепаринизации. После этого сердце было открыто, и счёт 8-0 Швы использовались для перевязывания левой и правой верхней полой вены, которые затем пересекивались на дистальном конце швов (рисунок 3A,B). Впоследствии аорта была выделена от окружающей жировой ткани и разрезана рядом с дугой аорты (рисунок 3C), а аналогичная процедура была проведена для изоляции и пересечения легочной артерии (рисунок 3D). Нижняя полая вена в грудном сегменте была связана 8-0 швы и пересечени на дистальном конце (рисунок 3E), после чего легочные вены были перевязаны и пересечени швами 7-0 в швах (рисунок 3F). Наконец, изрезанное донорское сердце сохранялось в физиологическом физиологическом растворе при 4 °C для последующего трансплантирования, при этом все сердца сохранялись примерно на одинаковую продолжительность примерно 30 минут для обеспечения экспериментальной консистенции.

Процедура получателя
Анестезия мышей-реципиентов C57BL/6J в подготовке к пересадке абдоминального сердца. Лапаротомия была проведена вдоль линии альба для обнажения брюшной аорты и нижней полой вены у мыши-реципиента (рисунок 4A). После перевязки сосуды верхней ветви нижней полой вены с помощью 10-0 нейлоновых швов, сосудистые зажимы использовались для блокировки кровотока через брюшную аорту и нижнюю полую вену (рисунок 4B). Впоследствии было создано окно в брюшной аорте и нижней полой вене у мыши-реципиента, и кровь была смыта из сосудов гепариновым физиологическим раствором. С помощью 11-0 нейлоновых швов был проведён конечно-боковой анастомоз для соединения легочной артерии донорского сердца с нижней полой веной реципиента и аорты донорского сердца с брюшной аортой реципиента (рисунок 4C-E). В конце концов сосудистые зажимы были освобождены для восстановления кровотока к мыши-реципиенту (рисунок 4F).

Экспериментальная конструкция
Экспериментальная группа: Сердечные лимфатические сосуды у мышей BALB/c визуализировались с помощью синего красителя Evans и абляцировались электрокоагуляторной ручкой. Сердца мышей BALB/c с абляцией лимфатических сосудов были пересадены мышам C57BL/6J.

Контрольная группа: Сердечные лимфатические сосуды у мышей BALB/c визуализировались с помощью красителя Evans Blue, но абляция не проводилась. Сердца мышей BALB/c были пересадены мышам C57BL/6J.

В этом исследовании размер выборки был стандартизирован для всех экспериментальных групп и временных периодов: n=5 мышей на группу для анализов через 24 часа после трансплантации сердца, n=5 на группу для анализов через 7 дней после трансплантации и n=5 на группу для наблюдения времени выживания сердечного трансплантата.

Собранные донорские сердца хранили в холодном физиологическом растворе при температуре 4 °C в течение 30 минут перед трансплантацией сердца. Как экспериментальное, так и контрольное сердце доноров поддерживались в физиологическом растворе одинаковое время.

Длительность биения сердечных трансплантатов оценивалась ежедневно с помощью пальпации в обеих группах (n=5 на группу).

Гистологическая оценка и оценка паренхимального отторжения (PR)
Образцы ткани миокарда подвергались фиксации 10% формалином в течение 48 часов, затем обезвоживались с помощью градуированной серии этанолов (70%, 80%, 95%, 100%), очистки ксилолом, вложения парафина и сечения микротомов (4 мкм), при этом результирующие срезы окрашены с использованием гематоксилина и эозина (H&E). Отторжение трансплантата оценивалось с использованием PR-балла при пересадке сердца, а степень повреждения трансплантата оценивалась слепо20.

Эхокардиографическое исследование
Функция сердца оценивалась с помощью ультразвуковой системы (датчик зонда 40 МГц 550). Мышей помещали в положении на спине на вращающейся 360-градусной платформе животного. После удаления брюшных волос сердечная функция была оценена под анестезией 1,0% изофлурана. Фракция выброса (EF) сердечного трансплантата измерялась с помощью эхокардиографии в M-режиме.

Обнаружение маркеров повреждения миокарда
Степень повреждения ткани миокарда оценивалась путём экспрессии кардиомиоцитно-специфических ферментов в сыворотке. Уровень сердечного тропонина I (cTnI) анализировался согласно инструкции производителя.

Вестерн блоттинг
Через 24 часа после трансплантации сердца была собрана ткань миокарда из основных лимфатических сосудов сердечных трансплантатов как в контрольной, так и в экспериментальной группах. Следуя ранее описанномупротоколу 21, была проанализирована экспрессия маркеров, связанных с лимфатическими сосудами. Сердечные ткани были тщательно лизированы в буфере лизиса RIPA, содержащем ингибиторы протеазы (фенилметан сульфонилфтор). До термоденатурации концентрация белка определялась с помощью набора BCA и корректировалась до равномерной концентрации. Общий белок каждой группы отделялся с помощью SDS-PAGE и затем переносился на мембрану PVDF. Мембрана PVDF была заблокирована 5% обезжиренным молоком (комнатной температуры 1-2 часа), а затем инкубировала ночью при 4 °C с соответствующими первичными антителами. На следующий день мембрану обработали вторичным антителом (анти-кролик, 1:1000) при комнатной температуре в течение 30 минут. Мембранные полоски инкубировали раствором ECL (1-2 мл) и экспонировали для захвата изображений.

Использовались следующие антитела: поликлональные антитела LYVE1 (1:500), антитела к подопланину (1:500) и анти-VEGF рецептор 3 (1:50).

Статистический анализ
Все результаты выражаются как среднее ± стандартной ошибке среднего (SEM). При сравнении двух групп статистический анализ проводился с использованием t-теста Стьюдента или теста ранга Уилкоксона, в зависимости от распределения данных и характеристик. Статистическая значимость была определена как p < 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оценка функции сердечного трансплантата
Модели трансплантации сердца на мышях были установлены как в контрольной, так и в экспериментальной группах согласно описанному протоколу. Функциональное состояние трансплантатов оценивалось через 24 часа после трансплантации. Уровень экспрессии сердечного тропонина I в сыворотке (cTnI) был выше в экспериментальной группе, чем в контрольной, но разница не была статистически значимой (см. рисунок 5A)...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сердечная лимфатическая система является важным компонентом поддержания гомеостаза тканевой жидкости и поддержки иммунной функции сердца. Обеспечивая реабсорбцию интерстициальной жидкости, транспорт липидов и транспортировку иммунных клеток, он обеспечивает работу сердца как при физиологических, так и в патологических состояниях. В последние годы всё больше данных подчеркивает критическое участие сердечно-лимфатической системы в различных сердечно-сосудистых заболеваниях, таких как инфар...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук для выдающихся молодых учёных Китая (82125004; Цзянпин Сун), ключевым проектом Frontier Biotechnology в рамках Национальной ключевой программы исследований и разработок Министерства науки и технологий Китая (2023YFC3404300; Цзянпин Сун) и Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 82300464 Юаню Чану).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Электрокоагуляционная ручкаВэйтайV70
Микроскопические щипцыЦзиньчжунWA3030
Микроскопические щипцыЦзиньчжунWA2040
Микроскопический держатель для иглыЦзиньчжунYZE010
Микроскопический держатель для иглыЦзиньчжунYZE020
Микроскопические ножницыЦзиньчжунYBC010
Микроскопические ножницыЦзиньчжунYBC020
Держатель для иглыЦзиньчжунJ32010
НожницыЦзиньчжунY00010
Вентилятор мелких животныхЧжоудиDW-300

Ссылки

  1. Khush, K. K., et al. The international thoracic organ transplant registry of the international society for heart and lung transplantation: Thirty-sixth adult heart transplantation report - 2019; focus theme: Donor and recipient size match. J Heart Lung Transplant. 38 (10), 1056-1066 (2019).
  2. Ravaud, C., Ved, N., Jackson, D. G., Vieira, J. M., Riley, P. R. Lymphatic clearance of immune cells in cardiovascular disease. Cells. 10 (10), 2594(2021).
  3. Miyasaka, M., Tanaka, T. Lymphocyte trafficking across high endothelial venules: Dogmas and enigmas. Nat Rev Immunol. 4 (5), 360-370 (2004).
  4. Cooper, S. T. E., Lokman, A. B., Riley, P. R. Role of the lymphatics in cardiac disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (6), 1181-1190 (2024).
  5. Chen, Z., et al. Single-cell RNA sequencing reveals immune cell dynamics and local intercellular communication in acute murine cardiac allograft rejection. Theranostics. 12 (14), 6242-6257 (2022).
  6. Lin, Q. Y., Zhang, Y. L., Bai, J., Liu, J. Q., Li, H. H. VEGF-C/VEGFR-3 axis protects against pressure-overload induced cardiac dysfunction through regulation of lymphangiogenesis. Clin Transl Med. 11 (3), e374(2021).
  7. Roh, K., et al. Exercise-induced cardiac lymphatic remodeling mitigates inflammation in the aging heart. Aging Cell. 24 (6), e70043(2025).
  8. Karkkainen, M. J., et al. Vascular endothelial growth factor C is required for sprouting of the first lymphatic vessels from embryonic veins. Nat Immunol. 5 (1), 74-80 (2004).
  9. Agrawal, A., Verma, B. R., Brooksbank, J., Khayata, M., Klein, A. L. Symptomatic recurrent chylopericardium: How to manage this rare entity. JACC Case Rep. 3 (10), 1318-1321 (2021).
  10. Long, W., Cai, B., Liu, Y., Zheng, S., Luo, J. A novel minimally invasive surgical technique (Long procedure) for treating chylopericardium. J Thorac Dis. 16 (12), 8743-8753 (2024).
  11. Hraska, V., et al. Innominate vein turn-down procedure for failing Fontan circulation. Semin Thorac Cardiovasc Surg Pediatr Card Surg Annu. 23, 34-40 (2020).
  12. Smith, C. L., Hoffman, T. M., Dori, Y., Rome, J. J. Decompression of the thoracic duct: A novel transcatheter approach. Catheter Cardiovasc Interv. 95 (2), E56-E61 (2020).
  13. Weissler, J. M., et al. Lymphovenous anastomosis for the treatment of chylothorax in infants: A novel microsurgical approach to a devastating problem. Plast Reconstr Surg. 141 (6), 1502-1507 (2018).
  14. Nadolski, G. J., Itkin, M. Lymphangiography and thoracic duct embolization following unsuccessful thoracic duct ligation: Imaging findings and outcomes. J Thorac Cardiovasc Surg. 156 (2), 838-843 (2018).
  15. Tomasulo, C. E., et al. Lymphatic disorders and management in patients with congenital heart disease. Ann Thorac Surg. 113 (4), 1101-1111 (2022).
  16. Bender, B., Murthy, V., Chamberlain, R. S. The changing management of chylothorax in the modern era. Eur J Cardiothorac Surg. 49 (1), 18-24 (2016).
  17. Flaht-Zabost, A., et al. Cardiac mouse lymphatics: Developmental and anatomical update. Anat Rec (Hoboken). 297 (6), 1115-1130 (2014).
  18. Pu, Z., et al. Cardiac lymphatic insufficiency leads to diastolic dysfunction via myocardial morphologic change. JACC Basic Transl Sci. 8 (8), 958-972 (2023).
  19. Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123-1128 (2001).
  20. Stewart, S., et al. Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection. J Heart Lung Transplant. 26 (12), 1229-1242 (2007).
  21. Li, P., et al. FPR1 affects acute rejection in kidney transplantation by regulating iron metabolism in neutrophils. Mol Med. 31 (1), 23(2025).
  22. Wang, Y. C., et al. Lymphangiogenesis, a potential treatment target for myocardial injury. Microvasc Res. 145, 104442(2023).
  23. Garmy-Susini, B., et al. Cardiac lymphatic system. Med Sci (Paris). 33 (8-9), 765-770 (2017).
  24. Wang, T., et al. The important role of the chemokine axis CCR7-CCL19 and CCR7-CCL21 in the pathophysiology of the immuno-inflammatory response in dry eye disease. Ocul Immunol Inflamm. 29 (2), 266-277 (2021).
  25. Cursiefen, C., et al. Inhibition of hemangiogenesis and lymphangiogenesis after normal-risk corneal transplantation by neutralizing VEGF promotes graft survival. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (8), 2666-2673 (2004).
  26. Nykanen, A. I., et al. Targeting lymphatic vessel activation and CCL21 production by vascular endothelial growth factor receptor-3 inhibition has novel immunomodulatory and antiarteriosclerotic effects in cardiac allografts. Circulation. 121 (12), 1413-1422 (2010).
  27. Edwards, L. A., et al. Chronic rejection of cardiac allografts is associated with increased lymphatic flow and cellular trafficking. Circulation. 137 (5), 488-503 (2018).
  28. Gong, H., et al. Fibroblasts facilitate lymphatic vessel formation in transplanted heart. Theranostics. 14 (5), 1886-1908 (2024).
  29. Choi, Y. H., et al. Dual role of vascular endothelial growth factor-C in post-stroke recovery. J Exp Med. 222 (2), e20231816(2025).
  30. Kim, J. D., et al. APOA1 binding protein promotes lymphatic cell fate and lymphangiogenesis by relieving caveolae-mediated inhibition of VEGFR3 signaling. Nat Commun. 16 (1), 9286(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.