Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Фосфор-31 магнитно-резонансная спектроскопия для серийных измерений сердечной энергетики при сохранении сердца с контролируемой температурой

310 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70070

⸱

17 марта 2026 г.

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы описали воспроизводимый, контролируемый температурой протокол экс виво магнитно-резонансной спектроскопии фосфора-31, позволяющий проводить последовательную количественную оценку энергетики миокарда при сохранении органов.

Аннотация

Надёжное сохранение органов имеет решающее значение для увеличения доступности доноров и улучшения результатов трансплантации. Хотя статическое хранение остаётся стандартом для донорских сердец, существует необходимость в точные методы мониторинга энергетики миокарда на протяжении всего сохранения.

Фосфор-31 магнитно-резонансная спектроскопия (31P MRS) позволяет проводить прямое и динамическое измерение ключевых энергетических метаболитов, включая фосфокреатин (PCr), аденозинтрифосфат (АТФ), неорганический фосфат (Pi) и внутриклеточный pH. Этот метод позволяет проводить продольное, количественное и точное оценивание метаболического состояния миокарда во время хранения экс виво . Преимущества MRS включают динамическую оценку энергетического состояния и глобальную оценку желудочковой энергии.

Протокол начинается с восстановления донора свиньи, введения кардиоплегии и кардиэктомии. Аортальная дуга вырезана проксимально к плечоцефалическому стволу, чтобы максимально увеличить длину восходящей аорты. Ребристая канюля закреплена в дистальной восходящей аорте, левый предсердий отмечен, а сердце помещается в цилиндрический изолированный контейнер, заранее заполненный температурно-специфической кардиоплегией. Крышка соединяется с канюлей, подвешивая внутри сердце, а контейнер запечатывается с поддержанием температуры в пределах 1 °C в течение 1 часа.

Контейнер помещается в специализированную коробку из пенопласта с отверстием для фосфорно-настроенной спирали, выравнивая центр катушки с центром левого желудочка (LV). Скаутские снимки подтверждают расположение LV рядом с катушкой 31P. Шимминг B0 обеспечивает равномерное возбуждение, за которым следует приобретение нелокализованного спектра MR-диапазона 31P. Постобработка определяет спектральные пики для расчёта PCr/ATP, PCr/Pi и внутриклеточного pH.

В нашем протоколе 31P MRS выполняется в последовательных временных точках от h 0 до 8. Между временными точками сердце хранится в стандартном устройстве хранения при нужной температуре.

31P MRS позволила нам изучать временно-зависимые изменения истощения энергии и роль температуры хранения в смягчении её истощения со временем.

Введение

Трансплантация сердца остаётся окончательным методом лечения для отдельных пациентов с терминальной стадией сердечнойнедостаточности 1. Однако постоянный дефицит подходящих донорских органов и ограничения текущих стратегий сохранения являются серьёзными препятствиями для достижения оптимальных результатов и расширения доступноститрансплантации 2,3. Традиционно донорские сердца сохраняют с помощью холодного статического накопления, что просто и экономично, но подвержено субклиническому энергетическому истощению при длительномтранспорте 2,4. По мере того как программы всё чаще принимают органы с высоким риском и географически удалённые органы, растёт потребность в объективных инструментах, которые характеризуют метаболическое состояние миокарда во время сохранения, а не полагаются исключительно на ишемическое время и валовую инспекцию 5,6,7. Кроме того, метаболизм миокарда и ишемическая толерантность сильно зависят от температуры, и недостаточное охлаждение и чрезмерная гипотермия могут усугублять энергетическое истощение и повреждение клеток во время хранения. Оценка донорских сердец при нескольких клинически значимых температурах сохранения помогает выявить условия, которые наилучшим образом поддерживают жизнеспособность миокарда вовремени3.

Точная и динамическая оценка биоэнергетики миокарда во время хранения необходима для совершенствования методов сохранения и максимизации использования органов. В настоящее время стандартная практика основана на статическом холодном хранении при температурах примерно 4-8 °C 8. Хотя этот протокол показал успешные результаты при коротких периодах хранения, длительное хранение при такой температуре может поставить под угрозу целостность миокарда. Поэтому крайне важно проводить серийные измерения метаболической активности в диапазоне температур и продолжительностей, чтобы определить оптимальные условия хранения, необходимые для успешной трансплантации органов. Традиционная оценка повреждений при сохранении часто основана на гистологическом исследовании или биохимических анализах из биопсий миокарда, которые являются инвазивными, разрушительными и дают лишь периодические, региональные снимки состояниятканей 9. В отличие от этого, спектроскопия магнитного резонанса фосфора-31 (31P MRS) — это мощная, неразрушительная методика, позволяющая прямое, серийно измерять ключевые энергетические метаболиты, включая фосфокреатин (PCr), аденозинтрифосфат (АТФ), неорганический фосфат (Pi) и внутриклеточную pH, внутри целостной сердечнойткани 6,10,11,12. Позволяя многократные измерения в одном и том же органе без дополнительной обработки тканей, 31P MRS предоставляет глобальные и продольные представления о энергетическом состоянии миокарда, повышая экспериментальную точность и воспроизводимость по сравнению с методами биопсии или сывороточных суррогатныхрешений 6,13.

Оценка жизнеспособности сердечного трансплантата при 31P MRS была рассмотрена Бернардом идр. 14. Здесь представлен подробный, контролируемый температурный протокол для экс виво 3 Tesla 31P MRS свиного сердца во время консервации. Этот метод предоставляет практическую основу для мониторинга истощения субстрата, тестирования переменных хранения и валидации мер сохранения. Протокол особенно подходит для лабораторий, которые проводят последовательное измерение целого желудочка во время статического холодного хранения, например, исследования температурно-зависимого сохранения, ишемии-реперфузионного повреждения или оптимизации решений для маргинальных и расширенных критериев донорских сердец.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол соответствует институциональным рекомендациям по уходу за животными и был утверждён Комитетом по уходу и использованию животных Университета Джонса Хопкинса (протокол номер SW24M319) для всех процедур, связанных с живыми животными вплоть до и включая хирургический сбор. Все последующие экс-виво эксперименты проводились с использованием тканей, полученных после эвтаназии.

1. Процедура предварительного сбора

  1. Установите температуру инкубатора на 2 °C ниже целевой температуры сохранения. Дайте инкубатору стабилизироваться как минимум 2 часа.
  2. Положите 6-7 пакетов со льдом в инкубатор, чтобы предварительно охлаждать их до установленной температуры. Убедитесь, что ледяных пакетов достаточно, чтобы поддерживать температуру во время транспортировки.
  3. Приготовьте модифицированное решение для кардиоплегии Сент-Томаса:
    1. В 1 л раствора пакета Lactated Ringer добавьте
      1. 30 мл 8,4% бикарбоната натрия
      2. 5 мл 30 ммоль/10 мл хлорида калия
      3. 2,5 мл сульфата магния 20 ммоль/10 мл
      4. 15 мл декстрозы 50%
      5. 100 мг 50 мг/10 мл нитроглицерина
      6. 5000 U холодного эритропоэтина
    2. Приготовьте в общей сложности 3 литра раствора для кардиоплегии и храните его в предварительно охлаждённом инкубаторе.
  4. Отложите изолированный охладитель с встроенной силиконовой трубкой, которая позволяет оптимально расположить вертикальную высоту сердца. Поставьте чёрную отметку на силиконовую трубку в точке, которая находится прямо под кончиком отверстия крышки холодильника.
  5. Отложите ребристую канюлю для закрепления и подвески собранного сердца. Разместите чёрный эталонный знак на внешней поверхности канюлы, чтобы он служил воспроизводимой точкой выравнивания.

2. Процедура сбора урожая

  1. Усыпить животное с помощью комбинации телазола, кетамина и ксилазина, смешанных в одном шприце и введённого внутримышечно, чтобы минимизировать стресс и боль, связанные с множественными инъекциями.
    1. Телазол (50 мг тилетамина + 50 мг золазепама) по 4,4 мг/кг на каждый компонент.
    2. Кетамин — 2,2 мг/кг.
    3. Ксилазин — 2,2 мг/кг.
  2. Интубируйте и анестезируйте животное.
    1. Приливный объём составляет 5-10 мл/кг.
    2. Частота дыхания составляет 12-15 вдохов в минуту.
    3. Положительное давление в конце выдоха при 5 см H2O.
    4. Вдыхал изофлуран в концентрации 0,5-2% с потоком кислорода 1-2 л/мин.
  3. Установите периферические внутривенные линии, проведите стернотомию и откройтеперикард 15. При необходимости назначайте антиаритмические препараты.
  4. Вставьте иглу для кардиоплегии в восходящую аорту, расположенную выше аортального клапана, но ниже дуги аорты.
  5. Поднимите и подключите 1 литр раствора кардиоплегии к игле.
  6. Проветривайте левое предсердие, нижнюю полую вену и верхнюю полую вену.
  7. Приложите аортальный крестовый зажим проксимально к дуге.
  8. Инициировать кардиоплегию через коронарные клетки при давлении примерно 75-80 мм рт. ст. Измеряйте давление с помощью линейного манометра.
  9. Собирайте сердце при сохранении анатомической целостности.
  10. Зальте предварительно охлаждённый физиологический раствор на собранное сердце, чтобы быстро охладить его поверхность.
  11. Положите сердце в миску с холодным раствором кардиоплегии.
  12. Вставьте датчик температуры миокарда на вершине сердца и термометр в чашу с кардиоплегическим раствором для контроля температуры.
  13. Отдельте аорту от легочной артерии (ПА).
  14. Закрепите ребристу канюлю в аорте с помощью шёлковых и пластиковых стягителей, убедившись, что отмеченная часть канюли соответствует положению левого желудочка (LV).
  15. Наполните холодильник раствором Saint Thomas до 60-70%, затем перелейте сердце и раствор чаши в холодильник для полного заполнения, максимизируя погружение.
  16. Измерьте и задокументируйте итоговый раствор и температуру ткани.
  17. Крепите ребристу канюлю к крышке холодильника силиконовой трубкой на заранее заданной метке. Убедитесь, что отметки на ребристой канюле и силиконовой трубке выровнены, чтобы LV сохраняла одинаковую ориентацию относительно крышки при закрытии охлаждения, обеспечивая воспроизводимое расположение LV при каждом сканировании (рисунок 1A).
  18. Деэр органа для обеспечения оптимальной однородности МР-поля и хорошего соотношения сигнал/шум во время сбора MR-данных.
  19. Зафиксируйте крышку холодильника, убедившись в выравнивании LV.
  20. Положите пакеты со льдом и холодильник в сумку для перевозки.

3. Протокол спектроскопии

  1. Этот протокол оптимизирован для 3T МР-сканера. МРТ-сканер оснащён многоядерной спектроскопией, включая широкополосный радиочастотный усилитель мощностью 4 кВт и приёмник, включая стандартную фосфорную катушку (P140, предоставляемую производителем). Катушка 31P — это одноконтурная передающая/приёмная катушка диаметром 14 см с двумя стержнями для настройки и согласования.
  2. Уведомите персонал МРТ-центра перед транспортировкой и подтвердите наличие сканирования.
  3. Подготовьте коробку из пенопласта со следующими внешними размерами: длина 33,5 см, ширина 28 см (более длинный край), ширина 23 см (короткий край) и толщина 4 см. Сделайте щель шириной 3,3 см с одной стороны коробки, чтобы разместить катушку 31P рядом с сердцем (рисунок 1B).
  4. Вставьте кулер с подвешенным сердцем рядом с центральной осью катушки, нацелившись на место LV (рисунок 1C). Подготовьте холодильник высотой 25,4 см и шириной 11,4 см. Силиконовая трубка закреплена на длине 7 см от внутренней поверхности крышки, в точке крепления сердца (рисунок 1D).
  5. Поместите ледяные пакеты в щели вокруг кулера, стараясь не образовать пространство между кулером и катушкой, затем заклейте крышку коробки скотчем для стабильности при сканировании (рисунок 1E).
  6. Центрируйте охладитель по изоцентру магнита с помощью лазерных направляющих и ориентира, чтобы обеспечить оптимальную однородность B0 (см. рисунок 1F).
  7. Подключите катушку 31P к разъёму сканирования и подключите к катушке настройщики и согласование стержней (рисунок 1F).
  8. Получите изображения разведчика с помощью трёхплоского локализатора для проверки расположения катушки и оптимальной близости LV к 31-порнойкатушке (рисунок 2).
  9. Если позиционирование LV неверное, поверните крышку кулера и повторите сканер скаута.
  10. Получите отображение статического поляB 0 для локализованного шага2-го порядка 16, чтобы обеспечить равномерное магнитное поле по интересующей области, необходимое для высокого спектрального качества:
    1. После приобретения картыB 0 автоматически запускается «Shimtool»16 с загруженной этой картой (рисунок 3).
    2. Точки щелчки сглаженного многоугольника, очертающего сердечную мышцу во всех срезах (рисунок 3A).
    3. Затем «Шимтул» выполняет ограниченную подгонку наименьших квадратов для определения локализованной резонансной частоты и первой (x, y, z) и второй порядка (xy, xz, yz, x2-y 2, z2-(x2+y2)/2) коррекций промежуточных полей (рисунок 3C). Загрузите эти термины исправления в сканер и примените их к следующим сканам.
  11. До получения 31P MRS поворачивайте настройочные стержни катушки для оптимальной настройки радиочастотной катушки и согласование её импеданса с MR-системой, что максимизирует эффективность передачи сигнала и минимизирует отражения в радиочастотной системе (см. рисунок 4).
  12. Получите начальный нелокализованный 31P MR спектр (время повторения [TR]: 10 с, угол переворота = 90° с использованием адиабатических импульсов B 1-Нечувствительного вращения-4 (BIR-4); время эхо-сигнала [TE] = 0,1 мс; полоса полосы =3000 герц (Гц); 1024 спектральных точки, 5 средних уровней) для определения резонансной частоты в центре между пиками PCr и γ-ATP. Общее время приобретения: 50 с.
  13. Затем получите полностью расслабленные нелокализованные 31P MR спектры после корректировки смещения частоты на основе расчёта в 3.12 (TR: 16 с, угол переворота = 90° с использованием адиабатических импульсов BIR-4; TE = 0,1 мс; полоса пропускания = 3000 Гц; 512 спектральных точек, 20 средних). Общее время приобретения: 5 мин 20 с.
  14. После сканирования измеряйте температуру жидкости и миокарда; обеспечивая отклонение от цели ≤1 °C.
  15. Храните сердце в инкубаторе при нужной температуре до следующего запланированного сканирования.

4. Анализ данных

  1. Экспортируйте полностью расслабленные 31P MRS-данные как . SDAT-файлы и загрузка в графический пользовательский интерфейс для обработки (рисунок 5A)17.
  2. Сначала аподизуйте спектры с помощью лоренцевого фильтра 15 Гц (рисунок 5B), затем примените фазовый сдвиг 0 и1-го порядка и установите частоту на 0 частей на миллион (ppm) в центре пика PCr (рисунок 5C).
  3. Подгонить спектры с помощью функцииAMARES 18 , используя значения знаний, указанные в Таблице 1.
  4. Проанализируйте анализ на предмет адекватной подгонки в следующем окне (рисунок 6), убедившись, что каждый пик правильно идентифицирован (отдельные компоненты) и что после анализа остаётся минимальный остаточный сигнал (остаток).
  5. Рассчитайте соотношения метаболитов миокарда PCr/АТФ и PCr/Pi на основе спектроскопической амплитуды пика (рисунок 7). Резонанс γ-АТФ используется как мера АТФ.
  6. Вычислите внутриклеточное pH на основе химического смещения между Pi и PCr после корректировки, чтобы отразить температурноеусловие 14.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить после каждого МРТ (шаг 3.15). Убедитесь, что температура поддерживается на протяжении всего этапа.

5. Уравнения

  1. Рассчитайте внутриклеточное pH (pH i), как описаноранее 19:
    Уравнение 1
    Где T — температура в °C, аδ 0 — наблюдаемая разница химических сдвигов между резонансами PCr и Pi в ppm.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Локализованное shimming2-го порядка 16 приводило к более однородному магнитному полю B0 в интересующей области, что подтверждается уменьшением стандартного отклонения в каждой временной точке (0 ч: 14,0 до 4,0 Гц; 4 ч: 17,5 до 3,2 Гц; 8 ч: 16,0–3,2 Гц). Это обеспечивало отличное спектральное качество в каждой точке времени (рисунок 7). Изменения метаболизма миокарда во время экс виво холодного хранения свидетельствуют о быстром истощении...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой рукописи описывается хирургическая подготовка и протокол получения и анализа МРС с 31P для серийной оценки энергетики миокарда во время сохранения сердца. 31P MRS позволяет проводить серийную, неразрушительную оценку ключевых сердечных метаболитов при различных температурах холодного хранения, что даёт новые представления о метаболической жизнеспособности ткани миокарда. Этот протокол MRS с 31P относительно быстрый, требующий минимального времени р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У нас нет конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотим выразить признательность нашей команде в Университете Джонса Хопкинса в отделении кардиохирургии и радиологии за успешное проведение этих исследований. Это исследование было профинансировано Американской ассоциацией торакальной хирургии (AATS).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ИнкубаторBenchmark Scientific H2265-HCMyTemp 65HC отопительный охлаждающий инкубатор
Изоляционный охладительGatoradeUPC 052000047097Утеплённый спортивный охладитель Gatorade
jMRUI версии 7.0Яваwww.jmrui.euГрафический пользовательский интерфейс для анализа данных
Датчик температуры миокардаДеРоял81-030415Датчик температуры миокарда серии DeRoyal 400 (15 мм)
Магнитно-резонансный сканерPhilipshttps://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingAchieva 3T, Philips Healthcare
Одноконтурная фосфорная катушкаPhilips Healthcare https://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingP140, Philips Healthcare

Ссылки

  1. Lechiancole, A., et al. Graft preservation in heart transplantation: current approaches. Front Cardiovasc Med. 10, 1253579(2023).
  2. Kounatidis, D., et al. Donor heart preservation: current knowledge and the new era of machine perfusion. Int J Mol Sci. 24 (23), 16693(2023).
  3. Ughetto, A., et al. Heart graft preservation technics and limits: an update and perspectives. Front Cardiovasc Med. 10, 1248606(2023).
  4. Wang, C. C., et al. Understanding preservation time thresholds in the modern era of heart transplantation. Sci Rep. 15 (1), 1-10 (2025).
  5. Tang, P. C., et al. Risk factors for heart transplant survival with greater than 5 h of donor heart ischemic time. J Card Surg. 36 (8), 2677-2684 (2021).
  6. Peterzan, M. A., Lewis, A. J. M., Neubauer, S., Rider, O. J. Non-invasive investigation of myocardial energetics in cardiac disease using 31P magnetic resonance spectroscopy. Cardiovasc Diagn Ther. 10 (3), 625-639 (2020).
  7. Lerman, J. B., et al. Donor heart recovery and preservation modalities in 2024. JACC Heart Fail. 12 (3), 427-437 (2024).
  8. Al-Ani, M. A. Z., Farr, M. A., Shah, P. Cold precision: enhancing organ preservation with controlled hypothermia. J Heart Lung Transplant. 43 (9), 1527-1529 (2024).
  9. Mishra, P. K., et al. Guidelines for evaluating myocardial cell death. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 317 (5), H891-H922 (2019).
  10. Abdurrachim, D., Prompers, J. J. Evaluation of cardiac energetics by non-invasive 31P magnetic resonance spectroscopy. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1864 (5), 1939-1948 (2018).
  11. Sourdon, J., Lewsey, S. C., Schär, M., Weiss, R. G. Measuring myocardial energetics with cardiovascular magnetic resonance spectroscopy. Heart Fail Clin. 17 (1), 149-156 (2021).
  12. Samuel, T. J., et al. Myocardial ATP depletion detected noninvasively predicts sudden cardiac death risk in patients with heart failure. JCI Insight. 7 (12), e157557(2022).
  13. Buchthal, S. D., et al. 31P-magnetic resonance spectroscopy studies of cardiac transplant patients at rest. J Cardiovasc Magn Reson. 2 (1), 51-56 (2000).
  14. Bernard, M., Kober, F., Caus, T. Assessing cardiac transplant viability with MRS. eMagRes. 4 (3), 627-633 (2015).
  15. Pla, M. M., et al. A porcine heterotopic heart transplantation protocol for delivery of therapeutics to a cardiac allograft. J Vis Exp. (180), e63114(2022).
  16. Schär, M., Kozerke, S., Fischer, S. E., Boesiger, P. Cardiac SSFP imaging at 3 Tesla. Magn Reson Med. 51 (4), 799-806 (2004).
  17. Naressi, A., Couturier, C., Castang, I., De Beer, R., Graveron-Demilly, D. Java-based graphical user interface for MRUI, a software package for quantitation of in vivo/medical magnetic resonance spectroscopy signals. Comput Biol Med. 31 (4), 269-286 (2001).
  18. Vanhamme, L., Van den Boogaart, A., Van Huffel, S. Improved method for accurate and efficient quantification of MRS data with use of prior knowledge. J Magn Reson. 129 (1), 35-43 (1997).
  19. Taylor, D. J., Bore, P. J., Styles, P., Gadian, D. G., Radda, G. K. Bioenergetics of intact human muscle: a 31P nuclear magnetic resonance study. Mol Biol Med. 1 (1), 77-94 (1983).
  20. Kothari, P. Ex vivo preservation of heart allografts-an overview of the current state. J Cardiovasc Dev Dis. 10 (3), 105(2023).
  21. Kober, F., Caus, T., Riberi, A., Le Fur, Y., Bernard, M. Time course of high-energy phosphate depletion during cold storage of human heart grafts using the Celsior solution. Transpl Int. 37, 12994(2024).
  22. Tsampasian, V., Cameron, D., Sobhan, R., Bazoukis, G., Vassiliou, V. S. Phosphorus magnetic resonance spectroscopy (31P MRS) and cardiovascular disease: the importance of energy. Medicina (Kaunas). 59 (1), 174(2023).
  23. Gupta, A. Cardiac 31P MR spectroscopy: development of the past five decades and future vision-will it be of diagnostic use in clinics. Heart Fail Rev. 28 (2), 485-532 (2023).
  24. Michel, S. G., et al. Preservation of donor hearts using hypothermic oxygenated perfusion. Ann Transplant. 19, 409-416 (2014).
  25. Caenegem, O. V., et al. Hypothermic continuous machine perfusion enables preservation of energy charge and functional recovery of heart grafts in an ex vivo model of donation following circulatory death. Eur J Cardiothorac Surg. 49 (5), 1348-1353 (2016).
  26. Spencer, B. L., et al. Extending heart preservation to 24 h with normothermic perfusion. Front Cardiovasc Med. 11, 1325169(2024).
  27. Iyer, A., et al. Normothermic ex vivo perfusion provides superior organ preservation and enables viability assessment of hearts from DCD donors. Am J Transplant. 15 (2), 371-380 (2015).
  28. Brouckaert, J., Dellgren, G., Wallinder, A., Rega, F. Non-ischaemic preservation of the donor heart in heart transplantation: protocol design and rationale for a randomised, controlled, multicentre clinical trial across eight European countries. BMJ Open. 13 (12), e073729(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Спектроскопия на ядрах фосфора-31метаболизм миокардасердце ex vivoэнергетические метаболитывведение кардиоплегического растворасоотношение PCr/ATPвнутриклеточный pH

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно