Метод взаимодействия хроматина с ДНК с РНК

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для захвата РНК-ассоциированных взаимодействий хроматина ДНК-ДНК для картирования трехмерной организации генома, связанной с РНК.

Аннотация

Метод взаимодействия ДНК-ДНК с РНК, ассоциированный хроматином (RDD), — это целевая стратегия картирования хроматиновых взаимодействий, закреплённых на конкретной РНК. Он одновременно идентифицирует геномные локусы, связанные с интересующей РНК, и разрешает дальние контакты ДНК между этими локусами, что позволяет делать выводы о пространственной организации и регуляторных связях. В РДД биотинилированные антисенсовые зонды, комплементарные к целевой РНК, используются для обогащения РНК-хроматиновых комплексов. Клетки сшиваются, хроматин фрагментируется и восстанавливается на концах, а близкая лигация проводится с использованием специально разработанного линкера для соединения фрагментов ДНК, которые пространственно соседствуют внутри захваченных комплексов. Продукты лигирания очищаются, преобразуются в библиотеки секвенирования и анализируются с помощью высокопроизводительного секвенирования для создания РНК-якорных карт взаимодействия. RDD применим как к эндогенным РНК, так и к экзогенным РНК, полученным от микроорганизмов и вирусов, инфицирующих хозяина, и совместим с различными типами клеток и экспериментальными условиями. Метод даёт локусоспецифичные, высокоразрешающие контактные профили, подходящие для анализа пары энхансер-промотор, дальнодействующей регуляции и трёхмерной архитектуры генома, связанных с регуляторным кодированием и некодируемыми РНК. Интегрируя биохимическое обогащение с близким лигированием и секвенированием следующего поколения, RDD обеспечивает надёжный и воспроизводимый рабочий процесс для выявления того, как РНК организуют хроматин и влияют на экспрессию генов.

Введение

Hi-C и ChIA-PET трансформировали исследования трёхмерной (3D) организации генома, преобразуя пространственную близость между фрагментами хроматина в ковалентные ДНК-соединения, которые можно секвенировать для вывода физических контактов на разных масштабах от петель до^{компартментов 1,2}. Помимо белков, множество РНК участвуют во взаимодействии хроматина, влияя на коммуникацию энхансер/репрессор-промотор и организацию хроматина^{высшего порядка 3}; однако, несмотря на достижения в белоковых анализах, остаётся сложно напрямую определить, как конкретная РНК организует дальнодействующие взаимодействия ДНК между связанными локусами. Главная цель метода взаимодействия ДНК-ДНК с РНК-ассоциированным хроматином (RDD)⁴ — создать высокоразрешающие, закреплённые на РНК карты взаимодействия хроматина, которые показывают, как определённый вид РНК ассоциируется с хроматином и координирует контакты ДНК-ДНК в своей локальной окрестности, что позволяет механистически делать выводы о коммуникации энхансер/репрессор-промотор и архитектуре генома высшего порядка, основанной на этой^РНК5. Методологически RDD обогащает связанные РНК-хроматиновые комплексы биотинилированными антисенсовыми зондами против интересующей РНК, выполняет связывание по близости на комплексе с помощью спроектированного линкера для соединения пространственно соседних фрагментов ДНК и создаёт секвенирующие библиотеки для получения специфических для локуса контактных профилей, подходящих для гипотетического анализа в различных типах клеток и состояниях, включая контексты, связанные с экзогенными бактериальными или вирусными РНК у инфицированных хозяев. Эти характеристики позиционируют RDD как РНК-якорный аналог устоявшихся методов конформации хромосом, предоставляя интерпретируемую контактную информацию с разрешениями, подходящими для регуляторного анализа.

Обоснование RDD связано с ограничениями существующих стратегий картирования РНК-хроматина. Целенаправленные методы захвата, такие как ChIRP-seq и CHART-seq, определяют геномную заселение ДНК одной РНК — одной РНК ко всем парадигмам ДНК, которая сообщает о связывании, но не о физических контактах ДНК между занятыми^{локусами 6,7}. Глобальные анализы, включая GRID-seq и MARGI, распространились на всю РНК на всю ДНК, каталогизируя близкости РНК по всему геному, но не имея явного разрешения контактов ДНК-ДНК внутри РНК-центрированных^{комплексов 3,8}. Мультиплексированные методы, такие как RD-SPRITE, сообщают о более высоком порядке ко-локализации между многими РНК и локусами ДНК и передают аспекты ядерной^{топологии 9}, но сигналы обычно доминируют обильными РНК, которые могут скрывать регуляторные РНК с низкой численностью и ограничивать целевой глубину для сети взаимодействия одной РНК. Стратегии обогащения и лигирования, основанные на белках или метках, такие как^{ChIA-PET 10},^{PLAC-seq 11} и HiChIP¹², эффективно отображают циклы, ориентированные на факторы, но не закрепляют взаимодействия с определённой РНК без специфического модуля захвата РНК, оставляя измерение ДНК-ДНК, закреплённое на РНК, нерешённым. Интегрируя целенаправленное биохимическое обогащение с близкой связью на комплексе, RDD напрямую захватывает контакты ДНК-ДНК между хроматиновым фрагментами, ко-занятыми^{интересующей РНК 4}, повышает чувствительность и специфичность для РНК с низким и умеренным количеством, а также генерирует высокоразрешающие, специфичные для локуса контактные карты, которые дополняют методы, ориентированные на заселение (ChIRP/CHART)^6,7 и глобальные методы, ориентированные на близость (GRID-seq/MARGI/RD-SPRITE^{)3, 8,9}, концептуально параллелизируя стратегии связывания, основанные на белковых факторах (ChIA-PET/PLAC-seq/HiChIP)10,11,12. Читателям следует рассмотреть РРД, когда биологический вопрос требует разрешения пространственных связей между хроматиновыми локусами, непосредственно связанными с целевым РНК — особенно когда предполагается, что эта РНК поддерживает каркас, мост или ограничивает долгосрочные геномные взаимодействия для настройки транскрипции — или при приоритете предполагаемых регуляторных целей из связывающего набора РНК, отличая прямые РНК-центрированные хабы от простого совместного занятия, определение сетей энхансеров/репрессоров для конкретных РНК или отслеживание перепроводки контактов, закреплённых с РНК, через нарушения, стадии развития или инфекции. В таких случаях RDD удовлетворяет неудовлетворённую потребность, предоставляя информацию о взаимодействии ДНК-ДНК, закреплённые на РНК, с чувствительностью, специфичностью и разрешением, необходимыми для строгих механистических исследований.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого метода RDD примерная система использует клетки Drosophila S2 и обе ncRNA roX2 и 7SK ; реакционные реагенты приведены в таблице 1, состав буферов — в таблице 2, детали реагентов и приборы — в разделе Материалы . Рисунок 1 даёт обзор протокола генерации библиотек RDD. Процедуры, связанные с вращением (F8), используют следующие параметры: F8, 20 об/мин, uu20 и UU30. Для всех буферов, используемых с Step 2 по Step 10, свежая добавка 1x ингибитором протеиназы (PI) и ингибитором РНазы (RI, 0,05 U/μL).

Принципы проектирования зонда: Для новых, не зафиксированных РНК спроектируйте зонды онлайн с помощью Stellaris Probe Designer, затем отфильтруйте неспецифические последовательности с помощью инструментов выравнивания (например, BLAST-подобное выравнивание) или UCSC BLAT, после чего выбранных зондов следует 3′-биотинилирование. Для новых целевых РНК проектируют последовательности, соответствующие целевой РНК, чтобы служить отрицательными контролями, также подвергаясь 3′-биотинилированию. Контроль качества включает проектирование праймеров обратной транскрипции против целевой РНК для валидации транскрипции и праймеров, направленных на геномную ДНК, для qPCR для оценки загрязнения; Включайте праймеры, определяющие геномные сайты связывания и несвязывающие области для оценки специфичности связывания. Зонды, связанные с roX2 и 7SK , приведены в таблице 1.

1. Сбор ячеек и двойное перекрёстное сшиение

1. Культивировать клетки Drosophila S2 при 27 °C. Стремитесь собрать в общей сложности примерно 3 x 10⁹ ячеек. Снова суспензировать клетки в культурной среде напрямую, а после подсчёта Trypan-blue аликвовать 8 x 10⁸ клеток в каждую коническую центрифугную трубку объёмом 50 мл.
   1. Смешайте 2 мкл клеток с 8 мкл DPBS, добавьте 10 мкл Trypan Blue, а затем загрузите на гемоцитометр для подсчёта клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера приведены клетки Drosophila S2. Обычно 8 x 10⁸ клеток соответствуют примерно 40 мл объёму культуры, обработанному в одной конической трубке объёмом 50 мл. Пользователи могут корректировать условия культуры и собирать количество клеток в зависимости от используемого типа клетки и количества целевой РНК.
2. Добавьте формальдегид до конечной концентрации 1% (w/v) и вращайте при 27 °C в течение 20 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите фиксацию при температуре посева или при комнатной температуре (RT; 20-25°C). Если не указано, вращайте микшер (F1, 12 об/мин). Для приклеенных элементов используйте орбитальный шейкер (50 об/мин).
   ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен; Используйте вытяжку.
3. Пеллетные клетки при 845 x г в течение 5 минут при RT; Отбросьте супернатант в соответствующие химические/биологические отходы. Клеточная гранула из 8 x 10⁸ клеток S2 обычно имеет объём около 1 см³ .
4. Повторно суспензируйте гранулы в свежеприготовленной EGS объёмом 2 мМ до общего объёма 40 мл в DPBS и вращайте при 27 °C в течение 40 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Растворите EGS в DMSO и перенесите в DPBS (см. таблицу 2). EGS в DMSO опасен.
5. Закалить с добавлением 2 мл глицина 2,5 М (конечные 0,125 м); Поворачивайте при 27 °C в течение 10 минут.
6. Пеллета при 845 x г в течение 5 минут на RT; Отбросьте супернатант в соответствующие химические/биологические отходы. Промывайте гранулы дважды с 40 мл предварительно подогреного DPBS при 27 °C.
7. Пеллета при 845 x г в течение 5 минут. Суспензировать клеточную гранулу в 10 мл DPBS и подсчитать клетки. Количество клеток может уменьшаться во время этапа перекрёстной связи, обычно примерно на 30%.
8. Аликвот 1 x 10⁹ элементов в каждую трубку объемом 50 мл; пеллета при 845 x г в течение 5 минут при RT; Отбросить супернатанта. Храните гранулы при −80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги реакции предназначены для одной библиотеки RDD.

2. Лизис клеток и проницаемость ядер

1. Возьмите 1 x 10⁹ S2 с двойным перекрёстным соединением из морозильника при температуре −80 °C. Оттаяйте на ледяной воде 30 минут.
2. Суспензировать клетки в 50 мл DPBS, центрифугировать при 845 x g на 5 минут при RT и выбросить супернатант.
3. Лизис клетки: Ресуспензировать клеточную гранулу в 20 мл буфера лизиса 0,1% FA (без Triton X-100). Вращайтесь на RT 15 минут. Проверка с помощью микроскопии; Регулируйте время по типу ячейки. Успешный лизис обозначается проницаемостью плазматической мембраны и цитоплазматическим высвобождением, так что ядра становятся легко видимыми как отдельные структуры под стандартным световым микроскопом (рисунок 2A).
4. Проницаемость ядер: добавьте 1,8 мл 10% SDS (последний 1%). Вращайте при 37 °C в течение 15 минут. Центрифугите при 3 200 x g на 20 минут на RT и сбросьте супернатант. Проверка микроскопией (рисунок 2B); Регулируйте время по типу ячейки. Ядра выглядят темнее, похожи на мембранную завесу, или некоторые отделяются. Повторяйте до завершения лизис.
5. Промывка ядра: Суспензировать гранулу в буфере лизиса 20 мл с 0,1% FA (без Triton X-100), вращать на RT 10 минут, затем центрифугировать при 3 200 x g в течение 20 минут при RT, выбросить супернатант и отметить размер ядер. Храните гранулы ядра при −80 °C для последующего использования.

3. Фрагментация хроматина

1. Суспензировать гранулы ядра в 15 мл буфера лизиса 0,1% FA (с Triton X-100). Аликвот 1,5 мл ядра суспензии в каждую пробирку с круглым дном 14 мл, избегая пузырьков.
   1. Отметьте размер гранулы перед соникацией для сравнения и повторите соникацию, если шарик остаётся крупным после соникации.
2. Соник с амплитудой 38% в течение 4,5 минут, с циклами 30 секунд ВКЛ / 30 с выключения. Соберите весь соникированный хроматин в трубку на 15 мл и центрифугуйте при 3200 x g в течение 20 минут при RT, затем перенесите супернатант (~13 мл) в новую трубку на 15 мл.

4. Предварительно прозрачный хроматин с бусинами C1

1. Подготовьте шарики Streptavidin C1: Aliquot 400 мкл Streptavidin C1 в трубочку объемом 1,5 мл (100 мкл на 1 × 10⁹ S2), поместите на магнит на 30 секунд и удалите супернатант. Промывайте дважды с 200 мкл буфера лизисного буфера FA с концентрацией 0,1% (с Triton X-100), затем повторно суспензируйте в 100 мкл буфера лизиса с концентрацией 0,1% FA (с Triton X-100).
2. Предварительное использование хроматина: Добавьте 100 мкл подготовленных шариков Streptavidin C1 в трубку с ~13 мл соникированного супернатанда хроматина (с шага 3.2); ротация на 20 минут в RT; поместить на магнитную стойку на 1 минуту и перенести супернатант (предварительно очищенный хроматин) в новые трубки объемом 50 мл; взять 10 мкл и хранить при −20 °C для QC1 (рисунок 3A).

5. Гибридизировать РНК-зонд с предварительно очищенным хроматином

1. Добавьте 2 тома (26 мл) свежеприготовленного буфера для гибридизации к 1 объёму (13 мл) предварительно очищенного хроматина; Поворот на 30 минут при RT.
2. Аликвот смесь в три трубки по 15 мл; добавить 6 мкл 100 мкм биотинилированных зондов (ДНК олигонуклеотид, Таблица 1) к каждому образцу (2 мкл на 15 мл пробирки); Ночью поворачивайте при 37 °C. Запечатайте крышки трубок пленкой.

6. Иммобилизация зонд — хроматиновый комплекс на шариках C1

1. Заблокируйте бусины Streptavidin C1 с блокирующим буфером: возьмите 400 мкл свежих бусинок Streptavidin C1 и дважды промывайте 800 мкл буфера лизисного буфера с содержанием 0,1% FA (без Triton X-100); Добавьте 400 мкл блокирующего буфера и инкубуйте на миксере (F8) в течение 30 минут при RT. Поставьте на магнит на 10 минут и сбросьте супернатант; Промыть три раза с 800 мкл буфера лизиса 0,1% FA (без Triton X-100). Для каждой промывки аккуратно перемешивайте пипеткой, помещайте на магнит минимум на 30 секунд, затем сбрасываете супернатант.
2. Суспензировать шарики C1 в 400 мкл буфера гибридизации.
3. Иммобилизуйте зонд-хроматиновый комплекс на шариках Streptavidin C1: Добавьте шарики стрептавидина C1, обработанные блокирующим буфером, к соответствующему гибридизированному хроматину и вращайте 2,5 часа при RT.
4. Перенесите реакцию иммобилизации с 15-миллиметровых ламп в трубку 1,5 мл с помощью магнитной стойки. Поставьте каждую трубку объемом 15 мл на магнитную стойку на 5 минут; Удалите супернатант. Подвесьте бусины с помощью 1 мл буфера Wash и перенесите в новую трубку объёмом 1,5 мл.
5. Промыйте шарики пять раз с помощью 800 мкл буфера Wash, затем дважды буфером TE. Для мытья добавьте буфер, инкубуйте на миксере (F1, 12 об/мин) 5 минут при 37 °C, затем поставьте на магнитную стойку на 30 секунд и выбросьте супернатант.
6. Держите шарики в 1000 мкл буфера TE (1x PI) на RT.

7. Блокировка незанятых участков на шариках C1 с помощью денатурированного йодоацетил-PEG2-биотина (IPB)

1. Растворить 4,8 мг IPB в 400 мкл буфера IPB Wash; Поворачивайте на RT 15 минут.
2. Решение β-ME: Добавить 1 мкл β-ME к 312 мкл H₂O; Перемешайте и поменяйте на RT 15 минут.
3. Денатурация IPB: Добавить 44 мкл раствора β-ME к 400 мкл IPB; Перемешайте и поменяйте на RT 15 минут.
4. Блокировать шарики C1: добавьте 220 мкл денатурированного IPB к C1-шарикам, связанным с зонд-хроматиновым комплексом (в 1 000 мкл TE); Поворачивайте на RT 15 минут.
5. Промой шарики C1 с TE пять раз. Добавьте буфер, инкубирайте на миксере (F8) 5 минут при RT, затем поставьте на магнитную стойку на 30 секунд и сбросьте супернатант.

8. Ремонт концов хроматина (на бусинах)

1. Добавьте 693 мкл конечной смеси для восстановления в хроматин на бусинах C1 и хорошо перемешайте; затем добавьте 7 мкл T4 ДНК-полимеразы.
2. Инкубировать на термомиксере (800 об/мин) при 12 °C в течение 30 минут; затем на миксере (F8) при 16 °C в течение 15 минут.
3. Промой шарики три раза 800 мкл ледяного буфера ChIA-PET, затем один раз с TE. Для каждой промывки аккуратно перемешивайте пипеткой, помещайте на магнит минимум на 30 секунд, затем сбрасываете супернатант.

9. Хроматиновый A-хвост (на бусинах)

1. Добавьте 693 мкл A-хвостовой смеси в хроматин на бусинах C1 и хорошо перемешайте, затем добавьте 7 мкл фрагмента Кленоу (3'-5' экзо-).
2. Инкубировать на миксере (F1, 12 об/мин) при 37 °C в течение 50 минут. Промой шарики три раза 800 мкл ледяного буфера ChIA-PET, затем один раз с буфером элюирования.

10. Связывание по близости хроматина (на бусинах)

1. Добавьте 1 390 мкл смеси для близкого лигирования к хроматину на шариках C1. Инкубировать на миксере (F8) на RT 5 минут.
2. Затем добавьте 10 мкл T4-лигазы ДНК. Покрутите микшер (F8) на RT 5 минут, затем переключитесь на F1 (12 об/мин) на RT на 50 минут, а ночью — 16 °C.
3. Промой шарики три раза с 800 мкл ледяного буфера ChIA-PET, затем дважды с буфером TE.

11. Высвобождение ДНК хроматина, лигированной по близости из шариков C1

1. Добавьте 480 мкл буфера элюции LC ChIP в хроматин на шариках C1, хорошо перемешайте и добавьте 20 мкл 20 мг/мл протеиназы K для десклинка.
2. Инкубировать на термомиксере (950 об/мин) при 65 °C ночью.

12. Очищение ДНК с помощью близости (с помощью фенола: хлороформ: реагентов IAA)

1. Вращение высокоплотной фазовой блокировочной трубки при 13 500 x г в течение 2 минут при RT. Добавьте развязанные продукты (500 мкл) в трубку с высокой плотностью фазового замка.
2. Добавьте 500 мкл фенола:хлороформа:IAA (с использованием наконечника пипетки объёмом 5 мл) в фазовую замыкающую трубку высокой плотности. Аккуратно перемешайте вручную.
   ВНИМАНИЕ: Выступайте в вытяжке.
3. Центрифугу при 13 500 x g в течение 6 минут на RT. Во время центрифугирования подготовьте трубку объемом 1,5 мл, добавив на дно 52 мкл ацетата натрия 3 м (pH 5,5). Нанесите 1 мкл гликогена с синим красителем на крышку. В этот момент не смешивайте и не закрывайте трубку.
4. Быстро перенесите супернатант из фазовой блокировочной трубки высокой плотности в подготовленную трубку объёмом 1,5 мл.
5. Добавьте 520 мкл ледяного изопропанола в трубку объёмом 1,5 мл. Аккуратно перемешайте, затем поместите на ночь при -80 °C.
6. Снимите трубку с -80 °C и разморозите на RT (~10 мин). Центрифуга при 13 500 x г в течение ~1 часа при 4 °C для осадка ДНК. На дне трубки будет синяя гранула.
7. Промой ДНК-гранулу 75% этанола и аккуратно удаляй супернатант. Добавьте 800 мкл 75% ледяного этанола, центрифугуйте при 13 500 г на 5 минут при 4 °C и удалите супернатант. Повторите промывку этанолом один раз.
   ВНИМАНИЕ: Сразу после центрифугирования удалите супернатант: сначала наконечником на 1 мл, затем с наконечником на 100 мкл. Тёплые трубки могут вытеснить синюю гранулу.
8. После последней промывки этанолом центрифугуйте при 13 500 х г в течение 10 минут при 4 °C, чтобы собрать остатки этанола на дне, затем аккуратно удалите оставшийся этанол.
9. Сушите ДНК-гранулу в вакууме (обычно 1 минута 30–2 минуты). Ресуспензировать ДНК-гранулу в буфере элюции 10 мкл и инкубировать в RT примерно 2 часа. Измерить ДНК с помощью квантора нуклеиновых кислот и оценить качество с помощью автоматической системы капиллярного электрофореза (рисунок 3B-C).

13. Маркировка ДНК Tn5, лигированная по близости,

1. Tn5 Tagmentation Testing: Подготовьте общий объём реакции 50 мкл согласно таблице 1. В ПЦР-пробирке на льду последовательно добавляйте 50 нг QC1 ДНК, ddH₂O, и 12,5 мкл 4x буфера для тегирования. Наконец, добавьте необходимое количество фермента Tn5. Аккуратно перемешивайте, поднимая и опуская 10–20 раз после каждого добавления, избегая пузырей. Ненадолго прокрутите трубку вниз по необходимости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратное смешивание и избегание пузырьков критически важно для маркировки. Кроме того, количество Tn5 должно быть эмпирически оптимизировано для достижения желаемого распределения фрагментов (преимущественно 200 bp-1 kb), а пользователи могут регулировать диапазон размеров, настроив вход Tn5.
2. Реакция маркировки: Инкубировать реакцию при 55 °C в течение 10 минут в ПЦР-приборе с крышкой, установленной на 70 °C, затем удерживать при 4 °C.
3. Высвобождение Tn5 и очистка ДНК: добавьте 50 мкл буфера элюции ChIP и 1 мкл протеиназы K в маркированную ДНК (для конечной концентрации SDS 0,5%). Перемешайте и инкубуйте на термомиксере при 65 °C и 900 об/мин в течение 30 минут. Очистите ДНК с помощью комплекта для очистки ДНК и измерите её с помощью автоматической системы капиллярного электрофореза (рисунок 3D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе фрагменты ДНК должны преимущественно варьироваться от 200 до 1 кб. Соотношение фермента Tn5 к ДНК следует оптимизировать эмпирически.
4. Масштабирование тегментации Tn5: На основе результатов тестирования Tn5 масштабируйте реакцию для ДНК, лигируемой по близости, при тех же условиях. После маркировки удалите образец с ПЦР-прибора и поместите его на лёд. Кратко закрутитесь, инкубируем на RT в течение 2 минут, затем добавьте 5,5 мкл 10% SDS (с в/в; итоговая концентрация SDS: 1%). Смешивайте, поднимая и опуская пипелет 10–20 раз, избегая пузырьков, и ненадолго опускайте. Инкубировать образцы при 37 °C в ПЦР-приборе не менее 15 минут. Маркированная ДНК может храниться при -20 °C в течение нескольких дней.

14. Блокирующие шарики M280

1. Возьмите 20 мкл шариков M280 и помой дважды с 200 мкл 1x чёрно-белого буфера. Для мытья добавьте буфер, подвесьте бусины с помощью пипетки, ненадолго открутите вниз, поместите на магнит на 30 секунд и уберите супернатант.
2. Блокировка с помощью блокирующего буфера: подвесьте шарики M280 в 100 мкл блокирующего буфера; Покрутите микшер (F8) на RT на 45 минут.
3. Промывка бусин: Ненадолго закрутите вниз, поставьте магнит на 10 минут и уберите блокирующий буфер. Мойте шарики дважды с 200 мкл 2x чёрно-белого буфера.
4. Блокировка бусинок с помощью геномной ДНК: ресуспензировать шарики в 100 мкл 2x чёрно-белого буфера, добавить 100 мкл сдвинутой геномной ДНК (~500 нг, 300-500 б.п.), хорошо перемешать и вращать на миксере (F8) на RT в течение 30 минут.
5. Отбросьте смесь геномной ДНК и дважды промывайте шарики с 200 мкл 1x чёрно-белого буфера.

15. Иммобилизация связанной ДНК на шариках M280

1. Связывание лигированной ДНК с шариками M280: отбросить 1x черно-белый буфер. Добавьте всю фрагментированную лигированную ДНК в шарики M280, смешайте и вращайте на миксере (F8) на RT в течение 45 минут.
2. Кратко опустите вниз, положите на магнит и сбросьте супернатант. Промывайте шарики пять раз с 500 мкл предварительно подогреного буфера при 37 °C; один раз с 500 мкл 1x ч/бел; и один раз с 200 мкл 1x ч/б. Положите на магнит на 1 минуту, аккуратно перемешайте на дне трубки и сбросьте супернатант. Добавьте 30 мкл буфера элюции в шарики (не смешивайте).
   1. Для мытья добавьте буфер, инкубируйте 5 минут на миксере (F8), положите на магнит 30 секунд, затем сбросьте супернатант. Шарики с связанной ДНК можно хранить при -20 °C.

16. Амплификация связанной ДНК на шариках M280

1. Подготовьте ПЦР-реакцию (согласно набору для подготовки библиотеки ДНК). Перенесите ПЦР-лампы на ПЦР-машину и настройте программу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: циклы усиления ПЦР критически важны для качества конечной библиотеки; увеличение количества циклов снижает сложность библиотеки. Оптимизировать количество циклов эмпирически и обычно не превышать 15 циклов.
2. Очистить продукт ПЦР с помощью магнитных шариков (рисунок 3E). Выбор размера: используйте магнитные шарики (0.8-0.61) для двойного выбора размера библиотеки RDD.
   1. Итоговая библиотека ДНК должна преимущественно варьироваться от 250 до 600 п.п. (рисунок 3F). Убедитесь, что 10-30 нг библиотечной ДНК измеряется квантором нуклеиновых кислот для секвенирования.
3. Секвенирование: Объект для секвенирования Illumina с 2x 150 bp. Глубина секвенирования зависит от экспрессии РНК, плотности сайтов связывания и геномных паттернов. Здесь roX2 насыщается ~23 млн чтений, а 7SK — при ~8 млн чтений, поэтому последнему требуется меньше глубины. Начните с вида, затем оцените избыточность для дополнительной глубины: ~5M для Drosophila, ~20M для человека/мыши, корректируя по метрикам контроля качества.

Результаты

Этот протокол описывает метод RDD для обнаружения взаимодействий хроматина с ДНК, ассоциированных с РНК. Рабочий процесс начинается с биохимического обогащения РНК-хроматиновых комплексов с помощью биотинилированных зондов, затем связывания по близости для связывания пространственно соседних фрагментов ДНК. После создания библиотек секвенирования выполняется секвенирование с высокой пропускной способностью.

Биоинформатический анализ данных RDD оптимизируется платформой^{ChIA-PIPE 13}. Ключевые шаги в этом аналитическом конвейере включают: вырезку секвенирующих линкеров из исходных чтений, сопоставление парных концов чтений с эталонным геномом, фильтрацию уникально отображённых пар считывания, удаление ПЦР-дубликатов и назначение взаимодействий целевой РНК-площадке на основе координат зонда. Обычно около 50% секвенированных чтений успешно сохраняются после фильтрации по линкеру и качеству. Валидные события взаимодействия затем агрегировались для создания локусоспецифических контактных карт, предоставляющих подробные профили архитектуры хроматина, управляемой РНК. Для данных RDD мы реализовали три корректировки ChIA-PIPE: последовательность линкеров RDD ("ACGCGATATCTTATCTGACT") была использована вместо стандартного связывающего ChIA-PET ("ACGCGATGGCTACTCTGACT"); кластеризация петли выполнялась с укорочённым расширением ПЭТ на 50 бп в дополнение к стандартным 500 п.п. для повышения точности позиционирования участков взаимодействия РНК; а покрытие обогащения РНК рассчитывалось с помощью deepTools (bamCoverage v3.5.1) с использованием размера бин 1 б.п. Эти модификации — конфигурация линкера — снижение расширения PET для более тонкой кластеризации и высокоразрешающая адаптация покрытия ChIA-PIPE для библиотек RDD.

На рисунке 4 показаны репрезентативные результаты RDD для двух некодирующих РНК: roX2¹⁴ (рисунок 4A,C; зелёный), комплексная РНК компенсации дозировки, участвующая в регулировании структуры X-хромосомы и экспрессии генов у дрозофилы, и 7SK¹⁵ (рисунок 4B,D; фиолетовый) — высококонсервативной малой ядерной РНК, которая модулирует удлинение транскрипции, регулируя активность P-TEFb у метазоев. Взаимодействия связывания РНК и хроматина, обнаруженные RDD, визуализируются вместе с данными RNAPII ChIA-PET (синие дуги), что подчеркивает структурную связь между РНК-ассоциированными петлями и ключевыми регуляторными элементами, такими как промоторы (P), энхансеры (E) и точки начала или конца транскрипции (TSS/TES). Заметные пики взаимодействия в агрегированных данных поддерживают модель, в которой roX2 и 7SK опосредуют критические контакты с энхансером-промотором или хроматином на дальнем радиусе.

Многомерный анализ достигается за счёт интеграции взаимодействий, закреплённых в RDD, с картами конформации хроматина по всему геному Hi-C (нижние красные тепловые карты) и эпигеномными отметками (H3K27ac, H3K27me3), зарождающейся транскрипцией (RNA-seq) и данными RNAPII ChIA-PET (рисунок 4C,D). В этих областях топологически ассоциирующие домены (TAD) чётко визуализированы, при этом хроматиновые петли, управляемые РНК, часто расположены на границах TAD или охватывают несколько TAD. Дополнительная аннотация с данными модификации гистонов и транскрипции позволяет различать активные и неактивные области хроматина. Ключевые регуляторные центры, ориентированные на РНК, обведены на рисунке.

Для разных нРНК проявляются явные закономерности. roX2 характеризуется связыванием в областях TES и петлением к TSS, часто локализуя на границах TAD и образуя дальние контакты, способные пересекать несколько TAD. В отличие от этого, 7SK преимущественно связывается с энхансерами и образует короткие петли с соседними промоторами, обычно не проходя границы TAD.

В совокупности эти результаты подтверждают, что RDD является надёжным и высокоразрешающим методом для рассечения структуры специфических для РНК 3D-хроматина. Такой подход позволяет непосредственно исследовать пространственные роли регуляторных РНК в архитектуре генома и экспрессии генов в различных биологических условиях.

Рисунок 1: Схема рабочего процесса генерации библиотеки RDD. Основные шаги рабочего процесса генерации библиотеки RDD показаны последовательно и сопровождаются соответствующими схематическими иллюстрациями. Процедура начинается с двойного сшивания и хроматиновой маркировки, затем гибридизация с биотино-модифицированным РНК-зондом и иммобилизация стрептавидином. Последующие этапы включают A-tailing, близкое лигирование с помощью биотино-модифицированных линкеров и создание библиотек. После связывания ДНК проводятся очистка, фрагментация через Tn5, обогащение биотина и амплификация библиотек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Репрезентативные микроскопические изображения клеток Drosophila S2, демонстрирующие критерии визуального контроля качества для лизиса клеток и проницаемости ядер. (A) Успешный лизис клеток характеризуется проницаемостью плазматической мембраны и цитоплазматическим высвобождением, что делает ядра легко видимыми. (B) Успешная проницаемость ядер характеризуется отёком клеток, частичным отслоением плазматической мембраны и целостными, хорошо видимыми ядрами. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Электроферограммный анализ хроматиновых препаратов. Скриншот электроферограмм системы капиллярного электрофореза, профилирующих различные образцы хроматина. (A) Отображает фрагментированный хроматин (соникация) размером примерно от 1000 до 3000 п.п., что указывает на успешную фрагментацию. (B) Иллюстрирует хроматин, связанный с РНК (РНК-ассоциированные + несвязанные зонды), при этом меньший пик представляет несвязанные зонды, как указано стрелкой. (C) Демонстрирует хроматин, ассоциированный с РНК, также с концентрацией от 1000 до 3000 bp, отражающий РНК-белковые комплексы. (D) Изображает хроматин, помеченный Tn5, что показывает диапазон, указывающий на эффективность маркировки. (E) Отображается распределение размеров фрагментов в библиотеке секвенирования после амплификации, охватывающее примерно 180-1000 п.п. (F) Показывает распределение размеров фрагментов в библиотеке секвенирования после выбора размера, при этом фрагменты преимущественно обогащены в диапазоне ~250-600 п.п. Значения RFU (относительные флуоресцентные единицы) указываются для каждого образца, что демонстрирует эффективную количественную оценку целостности и размера хроматина. Фиолетовые вершины символизируют маркер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Репрезентативные результаты RDD для взаимодействий хроматина, ассоциированных с ncRNA. (A-B) Отображаются геномные расположения связывания ncRNA roX2 (зелёный) и 7SK (фиолетовый), а также соответствующие удалённые циклы взаимодействия хроматина. Данные RNAPII ChIA-PET (синий) показывают чёткую регуляторную связь между этими ncRNA и экспрессией генов, при этом пики указывают на силу взаимодействия. Сокращения: TSS = место начала транскрипции; TES = конечный пункт транскрипции; P = промоутер; E = усилитель. (C-D) Даёт более масштабное представление о взаимосвязи между хроматиновыми петлями и TAD, связанных с ncRNA roX2 и 7SK, а также различиями состояний активного и неактивного хроматина и уровней экспрессии генов. Круги выделяют области с значимыми взаимодействиями между TAD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Реагенты реакции RDD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Составы буфера RDD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

Критические шаги в методе
Оценка количества РНК-зондов и соответствующих уровней РНК в хроматине имеет решающее значение. Избыток зондов может привести к тому, что несвязанные зонды занимают участки стрептавидина на этапе иммобилизации, что может затруднять запланированное захватывание взаимодействий целевых РНК. Кроме того, чрезмерное добавление стрептавидина приводит к потере материалов и требует дополнительного денатурированного IBP для эффективной блокировки пустующих участков. Недостаточная блокировка может негативно сказаться на эффективности последующего близкого лигирования, особенно учитывая, что связующий связующий связь по близости также содержит модификации биотина. Если блокировка выполнена недостаточно, части линкера могут напрямую связываться со стрептавидиновыми шариками, что усложняет результат. Кроме того, соотношение линкера к хроматину необходимо тщательно оценивать — избыток линкера может привести к метке обоих концов хроматиновой ДНК, что препятствует эффективной близкой связке.

Модификации метода
В этом исследовании мы иллюстрируем метод RDD с использованием клеток Drosophila S2 с roX2 ncRNA в качестве примера. Объёмы реагентов нуждаются в корректировке в зависимости от типа клеток и уровней экспрессии ncRNA; если экспрессия ncRNA высокая, можно уменьшить количество клеток или увеличить концентрацию в зонде РНК, и наоборот. Хотя этот протокол иммобилизует хроматин на шариках, альтернативный подход предполагает проведение in situ близкого лигирования с последующим обогащением РНК-зондами.

Специфика, управление и контроль качества
Ранее мы описали и валидировали РРД и проводили параллельные РРД на нескольких РНК, демонстрируя высокую специфичность; Читатели могут ознакомиться с предыдущим^{трудом 4,16}. РДД требует обогащения, зависящего от зонда, специфичного локусу, которое воспроизводимо и, где возможно, ортогонально валидировано. Истинные взаимодействия соответствуют трём критериям: обогащение в локусах, направленных на зонд, по сравнению с близлежащими несвязывающими областями; зависимость от зонда (отсутствует или заметно снижена в отрицательных контролях); а также воспроизводимость между биологическими репликатами и независимая валидация (например, RT-qPCR). Антисенсовые зонды были разработаны с использованием Stellaris, проверены с помощью BLAST/BLAT для удаления нецелевых объектов, заказаны 3'-биотином и проверены RT и qPCR (включая проверки на загрязнение ДНК и обогащение участка и вне участка). Мы рекомендуем три контроля — беззондные, скремблные/нетаргетируемые и несвязанные РНК или несвязывающие области — и оцениваем специфичность, сравнивая покрытие qPCR или секвенирования между целевыми и контрольными образцами, сообщая о обогащении складок и фоне. Для РНК с низкой численностью увеличивайте плотность зонда (в пределах нецелевых ограничений), повышайте глубину секвенирования и проводите ортогональную валидацию.

Устранение неполадок метода
Если взаимодействия захваченных РНК и хроматина заметно низкие, эффективность близкого лигирования может потребовать оптимизации за счёт корректировки линкерных и хроматиновых величин. Кроме того, высокие пики несвязанных зондов наблюдались с помощью автоматических капиллярных электроферограмм. Результаты показывают, что было добавлено слишком много зондов, что можно исправить, уменьшив количество использованных.

Ограничения метода
Ключевым преимуществом метода RDD является его эффективность в захвате специфических взаимодействий хроматина, ассоциированных с РНК, то есть каждый эксперимент может сосредоточиться только на одной конкретной РНК одновременно. Кроме того, поскольку близкое лигирование предназначено для обнаружения парных взаимодействий, взаимодействия с несколькими сайтами оцениваться нельзя одновременно.

Значение метода
Метод RDD не только выявляет сайты связывания РНК, но и проясняет взаимоотношения между этими участками, расширяя наше понимание архитектуры хроматина.

Практическое применение и потенциал RDD в будущем
RDD подходит для различных хроматино-ассоциированных РНК, включая эндогенные РНК хозяина и экзогенные РНК вирусов или других микроорганизмов, что подчёркивает её широкую применимость в различных областях исследований.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,5 млн EDTA	Инвитроген	AM9260G
1 М магний ацетата	Сигма-Олдрич	63052-100МЛ
1 M Tris-HCl pH 7.0	Инвитроген	AM9851
1 M Tris-HCl pH 8.0	Инвитроген	AM9856
Трубки массой 1,5 мл	Эппендорф	30108051
10 мМ dATP	Инвитроген	18252015
10% SDS (вес/объем)	Инвитроген	AM9822
10 раз; Буфер A-хвоста	NEB	B7002S
10 раз; Буфер для восстановления концов	NEB	B6002S
10 раз; Буфер ДНК-лигазы T4	NEB	B0202S
10 раз; Буфер TBE	Инвитроген	AM9863
Пробирки с круглым дном объемом 14 мл	Корнинг	352057
2 раза; PCR мастер-микс	NEB	M0541
20 с лишним раз; SSC буфер	Инвитроген	AM9770
200-μ L ПЦР-лампы	Sangon Biotech	F611541-0010
Бутылки для хранения ПЭТ объемом 250 мл Квадрат	Корнинг	431531
2-меркаптоэтанол (β-ME)	Сигма-Олдрич	M6250-100mL	! ОСТОРОЖНОСТЬ и бета;-МЕ токсичны; Всегда используй его в вытяжке.
Трубки объемом 2 мл	Эппендорф	22431048
pH натрия ацетата 3 м, 5,5	Инвитроген	AM9740
5 M NaCl	Инвитроген	AM9759
5 м ацетата калия	Сигма-Олдрич	95843-100ML-F
Бутылки для хранения ПЭТ объемом 500 мл Квадрат	Корнинг	431532
Аналитический баланс	Сарториус	BP211D
Автоматический счётчик ячеек	Counterstar	IC1000
Автоматическая система капиллярного электрофореза	Биоптический	C100100
Биотинилированные зонды	GENEWIZ		См. таблица 1
Блокирующий порошок	Инвитроген	T2015
Олигосы связывающих мостов	GENEWIZ		См. таблица 1
CO2 инкубатор	Thermo Scientific	51033549
Диметилсульфоксид (DMSO)	Сигма-Олдрич	D2650-100mL
Набор для подготовки библиотеки ДНК V2 для Illumina	Вазиме	TD501
Набор для очистки ДНК	Зимо	D4013
Дульбекко Солёный раствор, буферизованный фосфатом (DPBS) (1 и раз;)	Gibco	14190250
Коктейль с ингибиторами протеазы без ЭДТА	Рош	11836170001
EGS (Этиленгликоль бис[succiniMidylsuccinate])	Thermo Scientific	21565
Буфер элюции	Цягэн	19086
Этиловый спирт, чистый	Сигма-Олдрич	E7023-500mL
Формальдегидное решение	Сигма-Олдрич	47608-250mL-F	! ОСТОРОЖНО: Формальдегид токсичен; Всегда используй его в вытяжке.
Формамид	Инвитроген	AM9342
Гелевая система визуализации	Танон	3500R
Глицин	Инвитроген	50046-1кг
Гликоген с синим красителем	Инвитроген	AM9516
Картридж с высокой чувствительностью	Биоптический	C105105
Фазовые замыкающие трубки высокой плотности (1,5 мл)	Цягэн	129046
Высокочувствительный набор для флюорометрического анализа dsDNA	Инвитроген	Q32851
Index kit V2 для Illumina	Вазиме	TD202
Йодоацетил-PEG2-биотин (IPB)	Thermo Scientific	21334
Изопропиловый спирт	Сигма-Олдрич	I9030	! ВНИМАНИЕ: Изопропиловый спирт токсичен; Всегда используй его в вытяжке.
Базовый патрон Кило	Биоптический	C105106
Фрагмент Кленова (3'→ 5' exo-)	NEB	M0212L
Магнитные бусины	Бекман	A63881
Магнитная сепарационная стойка и bbsp; для трубки объемом 15 мл	Инвитроген	12301D
Магнитная сепарационная стойка и bbsp; для трубки объемом 2 мл	Инвитроген	12321D
Магнитная сепарационная стойка для ПЦР-лампы	NEB	S1515S
Микробиологический инкубатор	Thermo Scientific	IMH180
Микроскоп	Nikon	Eclipse TS2
Миксер	ELMI	RM-2L
N,N-диметилформамид (DMF)	Сигма-Олдрич	227056-100МЛ	! ВНИМАНИЕ: ДМФ токсична; Всегда используй его в вытяжке.
Неохлаждаемая микроцентрифуга	Эппендорф	5405000204
Вода без нуклеазы (не обработана DEPC, 1000 мл)	Инвитроген	AM9932
Вода без нуклеазы (не обработана DEPC, 50 мл)	Инвитроген	AM9937
Квантор нуклеиновых кислот	Инвитроген	Q33226
Орбитальный встряхивающий	Кристалл	SYC-2102
Фенол: Хлороформ: IAA	Solarbio	P1012-100mL
Раствор протеиназы K	Инвитроген	AM2548
Рефрижераторная центрифуга	Эппендорф	22628180
Рефрижераторный инкубатор	Thermo Scientific	IMP180
Охлаждённая микроцентрифуга	Эппендорф	5404F1621754
Холодильник	Haier	DW-25L262
Ингибитор РНазы	Амбион	AM2696
РНаз-свободные трубки объемом 15 мл	Инвитроген	AM12500
Трубки без РНазы объемом 50 мл	Инвитроген	AM12502
Соникатор	Sonics & Материалы	VCX130
Магнитные шарики с покрытием стрептавидина C1	Инвитроген	65001
магнитные шарики с покрытием стрептавидина M-280	Инвитроген	11205D
T4 ДНК-лигаза	NEB	M0202S
Полимераза T4 ДНК	NEB	M0203S
pH буфера TE 8.0	Инвитроген	AM9849
Термический циклер	Био-Рад	1851148
Термомиксер	Эппендорф	5382000023
Triton X-100	Acros Organics	327371000-100 мл
Морозильник с ультранизкой температурой	Thermo Scientific	995
Вакуумный концентратор	ТОМИ	MV-100