Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиная модель некротизирующей кожной инфекции Streptococcus pyogenes

325 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70159

⸱

6 марта 2026 г.

 , 
1Department of Biomedical Sciences, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University, 2Department of Molecular Microbiology, Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает модель подкожной инфекции Streptococcus pyogenes у мышей, которая позволяет независимо количественно оценивать бактериальную нагрузку и прогрессирование поражения. Метод предоставляет стандартизированную и воспроизводимую платформу для оценки роли бактериальных факторов вирулентности, иммунных ответов хозяина или терапевтических вмешательств, направленных на снижение повреждения тканей.

Аннотация

Streptococcus pyogenes — это патоген человека, вызывающий тяжёлые некротизирующие инфекции мягких тканей, характеризующиеся быстрым и обширным разрушением тканей. Ключевой проблемой при изучении этих инфекций является отсутствие экспериментальных моделей, позволяющих самостоятельно оценивать размножение бактерий и повреждение тканей, опосредованное хозяином. В этой статье представлена стандартизированная и воспроизводимая подкожная модель некротизирующей кожной инфекции S. pyogenes , предназначенная для преодоления этого ограничения. Протокол описывает подготовку логарифмической фазы бактериального инокуля, подкожную инфекцию мышей и продольный мониторинг развития поражения. Ключевые этапы включают соникацию бактериальных культур для стандартизации длины цепи, цифровую визуализацию поражений для количественного анализа язвенной области и определение бактериальной нагрузки посредством гомогенизации тканей и покрытия. Эта универсальная модель легко адаптируется для оценки влияния специфических бактериальных генов, факторов хозяина или терапевтических вмешательств на прогрессирование инфекции и патологию тканей. Позволяя воспроизводимую и количественную оценку как бактериальных, так и хозяевских параметров, этот метод предоставляет надёжную платформу для изучения патогенеза и тестирования стратегий ограничения повреждения тканей во время инвазивной стрептококковой инфекции.

Введение

Streptococcus pyogenes (Streptococcus группы A, GAS) — значимый патоген человека, вызывающий некротизирующие инфекции мягких тканей (NSTIs)1, приводящий к быстрому разрушению кожи и подлежащихтканей 2,3,4. Изучение патогенеза этих инфекций требует животных моделей, которые воспроизводят локализованные повреждения тканей при одновременной независимой оценке бактериальной репликации и патологии, опосредованнойхозяином. Многие традиционные модели инфекций, такие как системная инокуляция или системы культивирования клеток in vitro, ограничены в способности отделять бактериальное бремя от повреждения тканей, что затрудняет оценку конкретного вклада факторов вирулентности или реакциихозяина 6.

Общая цель этого метода — предоставить стандартизированную и воспроизводимую подкожную модель некротизирующей кожной инфекции S. pyogenes. Смысл этого метода заключается в создании управляемой in vivo системы, которая отделяет репликацию патогена от повреждения тканей, опосредованных хозяином. Эта модель высоко адаптируется к распространённым штаммам лабораторных мышей. Хотя штамм SKH1 (безволосый) часто используется для облегчения мониторингапоражений 7,8, протокол эффективно работает для волосистых штаммов (например, C57BL/6J) после депиляции. В опубликованных отчетах обычно используется либо пол, либо один пол (часто самки) и часто встречается схожая область поражения/бактериальное давление при конкретных экспериментальных условиях; однако генетический фон и пол хозяина могут влиять на тяжесть заболевания ГАС в некоторых условиях и должны учитываться при разработке экспериментов и анализерезультатов 9. Ключевым преимуществом этой модели по сравнению с альтернативами является её способность проводить продольный мониторинг локализованного поражения, что позволяет точное, независимо количественно оценивать площадь язвы и бактериальную нагрузку от одного и того же животного со временем. При правильно подобранном инокулуме и штамме подкожные инфекции часто локализованы и позволяют изучать прогрессирование и его устранение. Тем не менее, остаётся ли инфекция локализованной, зависит от штамма, инокулума и хозяина: некоторые клинические изоляты (или штаммы, приобретающие мутации CovRS) и достаточно крупные инокулы могут распространяться и вызывать бактериемию или летальные заболевания у иммунокомпетентныхмышей 10. Авторы должны сообщать о штаме, инокулюме, маршруте и любых модификациях хозяина, а также титрировать инокулу при адаптации модели к новому изоляту. Этот подход отличается высокой степенью воспроизводимости, доступен и совместим с различными последующим анализами, включая гистологию и иммунное профилирование.

Протокол применялся к нескольким штаммам GAS (включая изоляты типа M1, такие как HSC511 и другие M1T1 10,12), а также к клиническим изолятам NSTI. Поскольку фенотипы вирулентности различаются между типами ЭММ и отдельнымиизолятами 13, исследователям следует эмпирически оптимизировать инокулюм и отслеживать системное распространение при переводе протокола на новые штаммы.

Этот протокол подходит для исследователей микробного патогенеза, иммунологии и трансляционных исследований, желающих изучать бактериальную вирулентность, иммунные ответы хозяина или новые терапевтические стратегии, направленные на сохранение тканей во время инвазивной инфекции. Её стандартизированная количественная конструкция позволяет тщательно оценивать вмешательства и предоставляет универсальную платформу для изучения взаимодействия между репликацией патогена и повреждением тканей, опосредованными хозяином.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с требованиями Институционального комитета по уходу и использованию животных Медицинской школы Маршалла (IACUC) и Центра по животным ресурсам. Все процедуры, связанные со Streptococcus pyogenes, проводились в специализированном центре для животных, аккредитованном PHS, аккредитованном AAALAC, в рамках содержания уровня биобезопасности уровня 2 (BSL-2) в соответствии с институциональными протоколами биобезопасности. Экспериментальный рабочий процесс иллюстрирован на рисунке 1.

ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные данные о реагентах, материалах и оборудовании приведены в Таблице материалов.

1. Подготовка бактерий для инокулума

  1. Подготовьте ночную культуру, инокуляцируя Streptococcus pyogenes HSC5 из замороженного бульона в 10,5 мл среды C (0,5% пептона, 1,5% дрожжевого экстракта, 10 мМ K2HPO 4, 0,4 мМMgSO 4 и 17 мМ NaCl). Инкубировать статически при 37 °C в течение 16-20 часов.
  2. Измерьте оптическую плотность при 600 нм (OD600) ночных культур. Центрифугу 10 мл культуры при 6 000 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
  3. Суспензируйте бактериальные гранулы в 0,5 мл свежего, предварительно подогретого бульона Тодда Хьюитта, дополненного 1% экстрактом дрожжей.
  4. Инокулировать 50 мл предварительно подогреного бульона Тодда Хьюитта, дополненного экстрактом 1% дрожжей в конической трубке с восстановленными суспендированными бактериями до начального OD600 0,05.
  5. Инкубировать трубку при 37 °C без встряхивания. Следите за OD600 каждые 30 минут.
  6. Собирайте бактерии, когда культура достигнет OD600 ~0.200, центрифугировав при 6 000 x g в течение 5 минут при 4 °C.
  7. Сбросьте супернатант и снова суспензируйте гранулу в 10 мл ледяного раствора стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
  8. Снова центрифугуйте подвеску при давлении 6 000 x g в течение 5 минут при 4 °C. Последнюю гранулу подвесьте в 1 мл ледяного стерильного раствора PBS. Держите подвеску на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эту концентрированную бактериальную суспензию можно удерживать на льду до 30 минут перед переходом к соникации.

2. Стандартизация концентрации бактерий

  1. Перенесите бактериальную суспензию объёмом 1 мл в микроцентрифугную трубку. Соникизуйте подвеску на льду с помощью соникатора с чашечным рогом, чтобы разорвать длинные цепи S. pyogenes.
    ВНИМАНИЕ: Во время звуковой диагностики носите соответствующую защиту слуха. Процедура создаёт высокочастотный шум, который может привести к повреждению слуха.
  2. Установите соникатор на 5 циклов импульсов по 1 минуте (в зависимости от соникатора). Чтобы подтвердить эффективное нарушение цепи, поместите каплю 10 мкл звуковой подвески на стекло микроскопа, закройте с помощью защитного механизма и визуализуйте ниже 40X.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель соникации — сократить длинные цепи до преимущественно коротких (желательно 1-4 клетки на цепочку) и одиночных кокков. Если длинные цепи (>10 клеток) всё ещё присутствуют, повторите цикл соникации.
  3. Приготовьте разбавление сониковых бактерий в стерильном растворе PBS в соотношении 1:100.
  4. Загрузите 10 мкл разбавленных бактерий в камеру для счёта/бактериальный гемоцитометр.
  5. Посчитайте количество бактериальных цепочек в 10 больших квадратах камеры под микроскопом.
  6. Вычислите концентрацию бактерий в колониообразующих единицах на мл (CFU/mL) по формуле: Концентрация = (общее количество / 10) × коэффициент разбавления × 1,25 × 106.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая цепочка бактериальных клеток считается как один CFU.
  7. Разведите соникированный бактериальный запас ледяным PBS до конечной рабочей концентрации 1 × 108 CFU/mL.

3. Подкожная инфекция мышей

  1. За день до заражения побрить левый задний бок каждой мыши. Используйте электрическую машинку для стрижки, чтобы полностью удалить все волосы с площади примерно 2 см x 2 см.
  2. Анестезия мыши в индукционной камере (4% индукции, 1,5% поддерживающего изофлурана). Для поддержания синхронизации инфекции обрабатывайте мышей небольшими, управляемыми партиями (например, по 5–10 мышей в партии).
  3. Используя шприц объёмом 1 мл с иглой 27G, заберите 100 мкл бактериального инокулума.
  4. Вынимите мышь из камеры изофлурана и немедленно введите иглу подкожно в выбритый задний бок обезболезненной мыши с скошенным лицом вверх.
  5. Медленно вводите весь объём в 100 мкл, чтобы получить локализованный блеб. Убери иглу.
  6. Вернуть мышь в клетку и следить за её полным восстановлением после наркоза.
  7. Повторите шаги 3.2–3.5 для всех мышей экспериментальной когорты.
  8. Подготовьте серийное 10-кратное разбавление оставшегося бактериального инокулума в PBS.
  9. Точечная пластинка по 5 мкл каждого разбавления на агарные пластины. Инкубировать пластины анаэробно при 37 °C ночью для подтверждения доставленной дозы.

4. Продольный мониторинг прогрессирования инфекции

  1. Следите за всеми инфицированными мышами хотя бы раз в день на наличие признаков дискомфорта. Придерживайтесь установленных гуманных конечных показателей, что особенно важно при использовании гипервирулентных штаммов или ослабленных хозяев.
  2. Каждую мышь анестезируйте, следуя процедуре, описанной в шаге 3.2.
  3. Вынимите мышь из камеры изофлурана и положите её на бок рядом с идентификаторной меткой. Чтобы обеспечить продольное отслеживание отдельных мышей, отметьте (например, ухальный ух, бирку) каждое животное перед началом эксперимента.
  4. Сделайте цифровую фотографию области поражения с помощью камеры, установленной непосредственно над мышью.
  5. Откройте цифровое изображение в программном обеспечении для анализа изображений (ImageJ/Fiji). Выберите инструмент Freehand Selections из панели инструментов.
  6. Вручную обведите периметр видимой язвы на изображении.
  7. Откройте меню «Анализ » и выберите «Измерить », чтобы вычислить площадь внутри обведённого периметра.
  8. Запишите измеренную площадь в квадратных миллиметрах для каждой мыши в каждой точке времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент можно приостановить на этом этапе. Мышей возвращают в клетки для продолжения наблюдения до следующей точки наблюдения.

5. Сбор тканей и количественная оценка нагрузки бактерий

  1. Эвтаназия мышей в экспериментальной конечной точке с помощью вдыхания углекислого газа с последующим вывихом шейки матки — методом, одобренным Маршалловским университетом IACUC.
  2. Используя стерильные хирургические ножницы и щипцы, асептически удаляйте весь поражение и минимальное количество окружающей ткани. Убедитесь, что удаление включает полную толщину кожи и подкожную ткань, обычно простирающуюся до, но не включая мышечный слой, если инфекция не проникла в мышечную фасцию.
  3. Переместите ткань в заранее взвешенную стерильную микроцентрифугную трубку объёмом 2 мл с винтовой крышкой, содержащую 1 мл стерильного PBS и две стерильные шарики из нержавеющей стали диаметром 2,8 мм.
  4. Запишите вес ткани.
  5. Гомогенизуйте ткань с помощью механического гомогенизатора, установленного на 6,5 м/с в течение 60 секунд.
  6. Поставьте трубку на лёд на 5 минут, чтобы избежать перегрева.
  7. Гомогенизировать ткань для второго цикла в 60 секунд при скорости 6,5 м/с.
  8. Подготовьте последовательные 10-кратные разбавления гомогената ткани в пластине с 96 лунками с использованием стерильного PBS в качестве разбавителя. Точечная пластинка по 5 мкл каждого разбавления на агарные пластины.
  9. Инкубировать пластины анаэробно при 37 °C в течение 24-48 часов. Например, поместите тарелки внутрь герметичной банки с пакетиком анаэробного газогенератора и анаэробным индикатором.
  10. Посчитайте колонии на пластинах с 30-300 колониями. Вычислите единицы формирования колоний на мл (CFU/mL) гомогената ткани.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Подкожная инфекция у мышей для S. pyogenes последовательно приводит к локализованной, прогрессирующей некротической язве, что позволяет одновременно количественно оценивать бактериальную нагрузку и патологию тканей. Репрезентативные результаты этого стандартизированного протокола следующие.

Экспериментальные группы обычно состоят из 6-10 мышей для обеспечения достаточной статистической мощности (например, 80-90%) для выявления значимых различий в размере поражения и бактериальной нагр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Модель некротизирующей кожной инфекции S. pyogenes у мышей, описанная здесь, обеспечивает надёжную и воспроизводимую систему для вскрытия механизмов, лежащих в основе тяжелой инфекции мягких тканей. Её основная ценность заключается в способности отделять бактериальную нагрузку от патологии тканей, что позволяет механистически изучать, как факторы хозяина и патогена независимо влияют на прогрессирование заболевания. Это различие особенно важно при инфекции S. pyogenes , ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом стартапов Университета Маршалла и грантом WV Clinical and Translational Science Institute Bench-to-Bedside (U54GM104942) для WX. Гранты от Национальных институтов здравоохранения в размере R21 AI163825 (для MGC). Мы благодарим доктора Джилл Хан (MA, DVM, MPH, DACLAM), директора Центра по управлению животными Университета Маршалла, и доктора Монику Валентинович (PhD), председателя IACUC, за их критический обзор этой рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприц объёмом 1 млBD309628Для подкожной инъекции
Игла 28-GBD305109Для подкожной инъекции
Бактериальный гемоцитометр / Камера счётаHausser Scientific02-671-6Для подсчёта бактерий до вакцинации
Анаэробная система контейнеров BD BBL GasPak EZБектон, Дикинсон и Компания (BD)260001Для анаэробной инкубации
Мыши C57BL/6JЛаборатория Джексона6648-12 недель
Резервуар с углекислым газом (CO2)Местный поставщикН/ДДля эвтаназии
Cup-Horn Sonicator  (например, Q700)Qsonica431C2Для стандартизации длины цепи бактерий
Цифровая камераН/ДН/ДДля визуализации поражения
Электрические клипперыВальнапример, 8655-200Для бритья мыши с фланга
Гомогенизатор FastPrep-24MP Biomedicals116005500Для гомогенизации ткани
ImageJ SoftwareНациональные институты здравоохранения (NIH)Н/Дhttps://imagej.nih.gov/ij/
ИзофлуранБакстер1001936060Для анестезии
Система анестезии изофлурана  (Chamber & Вапорайзер)VetEquip или аналогичныеН/ДДля анестезии у мышей
ПептонБектон, Дикинсон и Компания (BD)211677Для приготовления среды C
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Gibco10010023Стерильный, pH 7,4
Штамм S. pyogenes HSC5Лаборатория КапаронКлинический изолят M1T1
Мыши SKH1Лаборатории Чарльз-Ривер4778-12 недель, без шерсти
Бусины из нержавеющей стали, 2,8 ммUniversal MedicalD1133-28Стерильный
Стерильные хирургические ножницы и щипцыТонкие научные инструменты или подобныеН/ДДля сбора асептической ткани
Тодд Хьюитт БульонБектон, Дикинсон и Компания (BD)249240Для бактериальной субкультуры
Дрожжевый экстракт   (для C medium)Бектон, Дикинсон и Компания (BD)212750Для приготовления среды C (то же самое, что и для добавки бульона)

Ссылки

  1. Hakkarainen, T. W., Kopari, N. M., Pham, T. N., Evans, H. L. Necrotizing soft tissue infections: review and current concepts in treatment, systems of care, and outcomes. Curr Probl Surg. 51 (8), 344-362 (2014).
  2. Brouwer, S., et al. Pathogenesis, epidemiology and control of Group A Streptococcus infection. Nat Rev Microbiol. 21 (7), 431-447 (2023).
  3. Cunningham, M. W. Pathogenesis of group A streptococcal infections and their sequelae. Adv Exp Med Biol. 609, 29-42 (2008).
  4. Henningham, A., Barnett, T. C., Maamary, P. G., Walker, M. J. Pathogenesis of group A streptococcal infections. Discov Med. 13 (72), 329-342 (2012).
  5. Pancholi, V., Caparon, M. Streptococcus pyogenes Metabolism. Streptococcus pyogenes: Basic Biology to Clinical Manifestations. , University of Oklahoma Health Sciences Center. Oklahoma City. (2022).
  6. Ravins, M., et al. Murine soft tissue infection model to study Group A Streptococcus (GAS) pathogenesis in necrotizing fasciitis. Methods Mol Biol. 2427, 185-200 (2022).
  7. Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. The hairless mouse in skin research. J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).
  8. Cusumano, Z. T., Watson, M. E. Jr, Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes arginine and citrulline catabolism promotes infection and modulates innate immunity. Infect Immun. 82 (1), 233-242 (2014).
  9. Chella Krishnan, K., et al. Genetic architecture of Group A streptococcal necrotizing soft tissue infections in the mouse. PLoS Pathog. 12 (10), e1005732(2016).
  10. Pato, C., Melo-Cristino, J., Ramirez, M., Friaes, A. Portuguese Group for the Study of Streptococcal, I. Streptococcus pyogenes causing skin and soft tissue infections are enriched in the recently emerged emm89 clade 3 and are not associated with abrogation of CovRS. Front Microbiol. 9, 2372(2018).
  11. Port, G. C., Paluscio, E., Caparon, M. G. Complete genome sequence of emm type 14 Streptococcus pyogenes strain HSC5. Genome Announc. 1 (6), e00612-e00613 (2013).
  12. Le Breton, Y., et al. Genome-wide discovery of novel M1T1 group A streptococcal determinants important for fitness and virulence during soft-tissue infection. PLoS Pathog. 13 (8), e1006584(2017).
  13. Bergsten, H., Nizet, V. The intricate pathogenicity of Group A Streptococcus: a comprehensive update. Virulence. 15 (1), 2412745(2024).
  14. Watson, M. E. Jr, Neely, M. N., Caparon, M. G. Animal Models of Streptococcus pyogenes Infection. Streptococcus pyogenes: Basic Biology to Clinical Manifestations. , University of Oklahoma Health Sciences Center. Oklahoma City. (2022).
  15. Xu, W., et al. Reprogramming aerobic metabolism mitigates Streptococcus pyogenes tissue damage in a mouse necrotizing skin infection model. Nat Commun. 16, 2559(2025).
  16. Merriman, J. A., Xu, W., Caparon, M. G. Central carbon flux controls growth/damage balance for Streptococcus pyogenes. PLoS Pathog. 19 (5), e1011481(2023).
  17. Zou, Z., et al. Dihydrothiazolo ring-fused 2-pyridone antimicrobial compounds treat Streptococcus pyogenes skin and soft tissue infection. Sci Adv. 10 (13), eadn7979(2024).
  18. Stevens, D. L., Bryant, A. E. Impetigo, Erysipelas and Cellulitis. Streptococcus pyogenes: Basic Biology to Clinical Manifestations. , University of Oklahoma Health Sciences Center. Oklahoma City. (2022).
  19. Mania, A., et al. Invasive group A streptococcal infections as a consequence of coexisting or previous viral infection in the post-COVID-19 pandemic period. J Infect Public Health. 18, 102622(2025).
  20. Stevens, D. L., Bryant, A. E. Severe Group A Streptococcal Infections. Streptococcus pyogenes: Basic Biology to Clinical Manifestations. , University of Oklahoma Health Sciences Center. Oklahoma City. (2016).
  21. Thacharodi, A., et al. The burden of group A Streptococcus (GAS) infections: the challenge continues in the twenty-first century. iScience. 28, 111677(2025).
  22. Qu, G., et al. Comparing mouse and human tissue-resident γδ T cells. Front Immunol. 13, 891687(2022).
  23. Proft, T., Fraser, J. D. Streptococcal Superantigens: Biological Properties and Potential Role in Disease. treptococcus pyogenes: Basic Biology to Clinical Manifestations. , University of Oklahoma Health Sciences Center. Oklahoma City. (2022).
  24. McArthur, J. D., Cook, S. M., Venturini, C., Walker, M. J. The role of streptokinase as a virulence determinant of Streptococcus pyogenes-potential for therapeutic targeting. Curr Drug Targets. 13 (3), 297-307 (2012).
  25. Barnett, T. C., et al. Streptococcal toxins: role in pathogenesis and disease. Cell Microbiol. 17 (12), 1721-1741 (2015).
  26. Ghosh, J., Anderson, P. J., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Characterization of Streptococcus pyogenes beta-NAD+ glycohydrolase: re-evaluation of enzymatic properties associated with pathogenesis. J Biol Chem. 285 (8), 5683-5694 (2010).
  27. Ghosh, J., Caparon, M. G. Specificity of Streptococcus pyogenes NAD(+) glycohydrolase in cytolysin-mediated translocation. Mol Microbiol. 62 (5), 1203-1214 (2006).
  28. Vega, L. A., Caparon, M. G. Cationic antimicrobial peptides disrupt the Streptococcus pyogenes ExPortal. Mol Microbiol. 85 (6), 1119-1132 (2012).
  29. Mozola, C. C., Magassa, N., Caparon, M. G. A novel cholesterol-insensitive mode of membrane binding promotes cytolysin-mediated translocation by Streptolysin O. Mol Microbiol. 94 (3), 675-687 (2014).
  30. Meehl, M. A., Caparon, M. G. Specificity of streptolysin O in cytolysin-mediated translocation. Mol Microbiol. 52 (6), 1665-1676 (2004).
  31. Hollands, A., et al. Genetic switch to hypervirulence reduces colonization phenotypes of the globally disseminated Group A Streptococcus M1T1 clone. J Infect Dis. 202 (1), 11-19 (2010).
  32. Xu, W., et al. Host cysteine proteases promote the severity of catheter-associated urinary tract infection and kidney fibrosis. mBio. 16 (11), e0216125(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.