Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метагеномика размера вируса ДНК для образцов кала человека

391 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70187

⸱

24 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of California, Davis

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем гибкий протокол для получения высококачественных метагеномов (виромов) по размеру вируса из образцов кала человека. Изначально разработанный для почвенной виромики, здесь этот протокол был успешно применён к образцам кала, что позволило надёжно охарактеризовать виросферу кишечника человека.

Аннотация

Понимание здоровой человеческой виросферы (вирусного компонента микробиома) требует точных измерений состава вирусных сообществ в различных типах вирусов. Опираясь на предыдущий опыт с методами экологии почвенных вирусных сообществ, здесь мы демонстрируем ряд лабораторных подходов для обогащения и извлечения ДНК из внеклеточных вирусов ДНК в образцах кала человека. Представлен рабочий первичный протокол, а также варианты отклонений на разных этапах. Общий подход включает добавление жидкого буфера (по умолчанию: протеино-усиленный фосфатный физиологический раствор, PPBS) для облегчения удаления свободных вирусных частиц из матрицы кала, центрифугирование для отделения жидкой фракции вирусных частиц, фильтрацию (по умолчанию: 0,2 мкм пор) для удаления большинства клеток, концентрацию вирусных частиц (по умолчанию: ультрацентрифугирование), удаление свободных нуклеиновых кислот с нуклеазами перед лизисом вириона, а затем экстракция ДНК для секвенирования. Также отмечены альтернативные методы, включая различные буферы, размеры фильтров и методы концентрации. В целом предлагается несколько вариантов получения высококачественной виромной ДНК для секвенирования. Вместо адаптации подхода под конкретное оборудование и ресурсы, гибкость протокола должна сделать его широко применимым в лабораториях с разным стандартным оборудованием для молекулярной биологии.

Введение

Вирома, или нецеленаправленное метагеномное секвенирование вирусной фракции смешанных сообществ, может дать представление о разнообразии, эволюции и экологии некультивированных вирусов. С тех пор как более 20 лет назад были проведены первые попытки каталогизировать вирусные сообщества кишечника, которые особенно использовали методы, разработанные для образцов окружающей среды, таких как морскаявода 1, методы виромии продолжают открывать вирусную экологию вмикробиоме человека 2. Однако не существует единого универсального протокола по виромике, и различия в методах могут влиять на результатысеквенирования 3,4, в конечном итоге влияя на интерпретацию динамики вирусного сообщества и затрудняя сравнения между исследованиями. Оптимизированные протоколы в сочетании с глубоким пониманием того, как методологический выбор формирует профили вирома, необходимы для надёжной характеристики человеческой виросферы.

Хотя универсального протокола виромики нет, основная основа методов виромики заключается в физическом разделении и концентрации внеклеточных вирусоподобных частиц (вирионов) в зависимости от их размера и/или плотности, удалении свободных нуклеиновых кислот (частично полученных из клеточного мусора или скомпрометированных вирусных капсидов) перед лизисом вириона, а также извлечении ДНК и/или РНК для секвенирования. Некоторые методы виромки выбирают для или против определённых типов вирусов, будь то намеренное решение исследователей или непреднамеренное методологическое ограничение. Для удаления микробных клеток и другого мусора часто используется шприцовая или вакуумная фильтрация, а размер фильтра по своей природе влияет на качество и состав восстанавливаемого вируса. Например, фильтрация может повысить чистотувирома до 5, но может исключать более крупные вирусныечастицы 6,7. Методы концентрации вирионов, такие как ультрацентрифугирование, осаждение полиэтиленгликолем (ПЭГ), ультрацентрифугирование с градиентом плотности и ультрафильтрация, также имеют компромиссы между чистотой, пропускной способностью и стоимостью оборудования 3,8. Известно, что многобуферные химии эффективны для виромики. Возможно, они не оказывают чрезмерного влияния на характеристику вирома9, но буферы хранения и реанимации всё равно могут влиять на восстановление вирусов и на профили вирома, полученные в результате биоинформатическогоанализа 10,11. Наконец, поскольку концентрации вирусных нуклеиновых кислот в естественных образцах могут быть низкими, многие исследования предпочитают амплификация вирусной ДНК до создания библиотеки (например, путем многократной амплификации с перемещением (MDA) или амплификации с одним праймером, независимой от последовательности, (SISPA)). Тем не менее, некоторые из этих методов вводят значительнуюсмещённость 12,13. В целом, хотя многие методы вирома могут успешно генерировать виромы, оптимизированные протоколы, признающие смещения и являющиеся в некоторой степени стандартизированными, позволят точные и воспроизводимые исследования вирома.

В этой статье представлен гибкий рабочий процесс для получения вирусов из образцов человеческого кала. Адаптированный из проверенных методов почвеннойвиромки 14,15,16, этот протокол включает несколько этапов, которые облегчают модификацию и позволяют исследователям адаптировать его под собственное оборудование и исследовательские нужды. Стандартный метод почвенной виромики, описанный ниже, успешно применяемый как к почвенным, так и к замороженным образцам кала, даёт высококачественные виромы без амплификации вирусной ДНК перед созданием библиотеки. Предложения по модификации протокола были проверены в разной степени в других исследованиях, но их специфическое влияние на последовательность вирома кала у человека здесь не рассматривалось.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все участники, приглашённые для сбора образцов кала, предоставили информированное согласие. Протоколы сбора образцов были утверждены Институциональным обзорным советом Калифорнийского университета в Дэвисе, а исследования соответствуют Хельсинкской декларации. Этот протокол адаптирован из Emerson и др. (2022)17.

1. Подготовка материалов

  1. Приготовьте физиологический раствор, буферированный фосфатом с использованием белка (PPBS, 10x PBS, 1% K-цитрат, 150 mMMgSO 4, 2% бычий сывороточный альбумин (BSA))18.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другими часто используемыми буферами в протоколах виромии являются солёный магний (SM)19 и изменённый буфер с калий-цитратным (AKC')буфером 11.
    1. Добавьте 10 мл 10x PBS, 10 г K-цитрат, 18,05 г безводногоMgSO 4 в стеклянную бутылку объемом 1 л автоклавируемой и наполните до 1 л сверхчистой лабораторной водой. Отрегулируйте pH до 6,5 (обычно требуется около 50 мкл 6 м HCl или около 100 мкл 2 M HCl). Оставьте мешатель внутри бутылки для использования в шаге 1.1.2.
    2. Автоклав в бутылке с буфером и одной пустой стеклянной бутылкой объёмом 1 л автоклавируемой бутылкой. После автоклава, когда буфер остынет до комнатной температуры, поместите его на магнитную пластину для перемешивания и медленно добавьте 20 г BSA прямо в бутылку, добавляя около 5 г BSA за раз (чтобы избежать пенения, минимизуйте чрезмерное перемешивание раствора, например, начинайте с медленного перемешивания и постепенно увеличивайте дозу).
    3. Весь объём буфера фильтруйте через стерильный вакуумный фильтр 0,22 мкм в пустую автоклавную бутылку объёмом 1 л начиная с шага 1.1.2. Храните буфер при 4 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PPBS-буфер может храниться при 4 °C около 3 месяцев, но при хранении выше нуля он нестабилен в долгосрочной перспективе.
  2. Подготовьте ультрацентрифугные трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует ультрацентрифугирование для концентрации вирионов. Другие распространённые подходы включают осаждение полиэтиленгликолем (ПЭГ), ультрацентрифугирование градиента плотности (например, градиенты хлорида цезия) и ультрафильтрацию.
    1. Для очистки ультрацентрифугных трубок сначала прочистите трубки сверхчистой лабораторной водой. Затем промывайте трубки сверхчистой лабораторной водой.
    2. Заполните пробирки 1 M NaOH и дайте постоять минимум на час (можно оставить на ночь). Очистите пластиковые/резиновые крышки ультрацентрифуг и их уплотнительные кольца, погрузив их в 1 M NaOH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не погружайте металлические крышки винтов в NaOH.
    3. После замачивания промывайте три раза сверхчистой лабораторной водой, затем один раз с использованием воды без нуклеазы и молекулярной биологии. Сушите трубки, переворачивая и аккуратно постукивая, либо дайте им полностью высохнуть на ночь. Маркируйте каждую ультрацентрифугную трубку идентификатором образца.
  3. Предварительно охладите ротор ультрацентрифуги при 4 °C, оставив его в холодильнике или холодной комнате на ночь.

2. Очищение и концентрация вирионов

  1. Взвешивайте кал в стерильную ДНКазу, РНазу и ДНК-свободную коническую трубку объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество используемого кала может зависеть от количества доступного образца материала. Здесь использовали 2 г кала. Если неиспользованный образец необходимо хранить в замороженном состоянии, рассмотрите возможность алицитирования всего образца перед заморозкой, чтобы минимизировать будущие циклы заморозки-оттаивания.
  2. Добавьте 8 мл буфера PPBS непосредственно в конические трубки, содержащие кал (конический #1). Тщательно подвесьте с помощью вихря.
  3. Встряхните лампы на 300 об/мин при 4 °C в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости встряхивание можно делать при комнатной температуре, но рекомендуется 4 °C.
  4. Центрифуга берет образцы в конической форме #1 при 4000 x g при 4 °C в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, используйте поворотный ротор, чтобы облегчить вертикальное разделение плотности и облегчить выполнение следующих этапов.
  5. Аккуратно декантуйте супернатант в новую стерильную коническую форму объёмом 50 мл (коническая #2) и храните при температуре 4 °C (в надналепном здесь содержатся вирионы). Не выбрасывайте коническую трубку с гранулой (коническая #1), так как она используется снова в шаге 2.6.
  6. Повторите шаги 2.2–2.5 ещё два раза (чтобы образец в конической #1 прошёл в общей сложности 3x ресуспензии с буфером, 3x встряхиванием и 3x центрифугированием) и продолжайте объединять супернатант в коническую #2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Три патрона должны накапливать в сумме ~24 мл супернатант.
  7. Центрифугуйте коническую трубку объемом 50 мл с накопленным супернатантом (конический #2) в течение 8 минут при 10 000 x g при 4 °C.
  8. Проведите второй этап центрифуга. Сначала декантировать супернатант из конической #2 в новую коническую трубку объёмом 50 мл (коническую #3). Центрифуга коническая #3 в течение 8 минут при 10 000 x g при 4 °C.
  9. С помощью фильтрации шприца последовательно фильтруйте супернатант от конического #3, избегая попадания гранулы в/рядом с нижней частью трубки. Предварительное фильтрование с использованием стерильного 5,0 мкм полиэфирсульфона (PES) фильтра, затем стерильного фильтра PES с толщиной 0,20 мкм непосредственно в ультрацентрифугную трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель предварительной фильтрации с фильтрами 5,0 мкм — уменьшить засорение фильтров с размером 0,20 мкм. Всё равно может потребоваться сбросить и заменить фильтры шприцев, если они забиваются. Фильтрацию можно выполнить в один шаг, укладывая фильтр 5 мкм поверх фильтра с размером 0,20 мкм, подключённый к одному шприцу и непосредственно в ультрацентрифуговую трубку. Предпочитают мембраны PES, так как другие мембранные материалы могут удерживать вирионы (например, стекловолокно) или быстрее засоряться (например, поливинилиденфтор, PVDF). 0,45 мкм — ещё один распространённый размер фильтра.
  10. Проверьте массу всех ультрацентрифугных пробирок с их содержимым образцов и сопоставьте пробирки в ультрацентрифуге по массе. При необходимости добавьте PPBS в более лёгкую трубку каждой пары для уравнивания веса (при парных трубках ошибка в 0,05 г).
  11. Ультрацентрифуга при 112 000 x g при 4 °C в вакууме в течение 2 ч 25 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от используемого ротора длительность вращения будет различаться (в зависимости от коэффициента осадка (s) = 58). См. таблицу материалов для используемого здесь ротора. Перед тем как вынимать трубки из ультрацентрифуга, обратите внимание на расположение каждой трубки в роторе, чтобы облегчить обнаружение вирусной гранулы. Иногда после ультрацентрифугирования вирусная гранула не видна, поэтому при удалении супернатанта следует проявлять особую осторожность на следующем этапе.

3. Ресуспензия вирусных гранул и лечение ДНКазой

  1. Удалите супернатант либо декантированием, либо пипеткой, стараясь не навредить гранулы, которая может быть хрупкой (в грануле содержатся концентрированные вирионы).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как отмечено в шаге 2.11, гранула может быть как видима, так и нет, но часто можно увидеть «коричневую или жёлтую гранулу размером с отверстие».
  2. Обрабатывайте образцы ДНКазой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы решаете не обрабатывать образцы ДНКазой, перейдите к шагу 4 и следуйте фразе «Если обработка DNase не была проведена». Обратитесь к обсуждению для рассмотрения вопросов по проведению DNase терапии.
    1. Суспензировать гранулу в 100 мкл воды без нуклеазы молекулярной биологии в маркированную микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
    2. Создайте мастер-смесь обработки ДНКазы, добавив 10 мкл буфера реакции ДНКазы и 10 мкл ДНКазы для каждого образца, который обрабатывается. Пипетте для тщательного перемешивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте достаточное количество мастер-смеси обработки ДНКазой для дополнительных реакций, чтобы учесть возможные потери объёма во время пипетирования в шаге 3.2.3.
    3. Добавьте 20 мкл мастер-смеси обработки ДНКазы в восстановленные вирионы. Хорошо смешивайте, аккуратно пипетирайте. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут.
    4. Добавьте 10 мкл раствора ДНКазного стопа для инактивации нуклеаз. Кратковременный вихрь.

4. Экстракция вирусных нуклеиновых кислот

  1. Проведите экстракцию ДНК с помощью комплекта для экстракции ДНК, указанного в Таблице материалов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внесите две модификации в инструкции производителя. 1) После первого шага в процедуре комплекта нагрейте трубку с вирионами в буфере CD1 при 65 °C в течение 10 минут, затем приступите к извлечению в соответствии с инструкциями производителя. 2) Во время этапа элюции ДНК (шаг 16 в процедуре набора) инкубировать колонки при комнатной температуре в течение 5 минут после добавления C6.
    1. Если была проведена обработка DNase: После инактивации нуклеаз (в шаге 3.2.4), используйте весь объём как вход для экстракции ДНК (то есть на этапе 1 процедуры набора для экстракции ДНК добавляют этот объём в пробирку с 800 мкл CD1). Убедитесь, что не оставляете раствор (в этом растворе есть вирионы).
    2. Если обработка ДНКазой не проводилась: добавьте 100 мкл молекулярно-безнуклеазной воды в ультрацентрифугную трубку с гранулой из шага 3.1. Аккуратно соскребите гранулы и снова подвесите. Используйте взвешенную гранулу как вход для извлечения ДНК.

5. Квантификация ДНК

  1. Количественно определите извлеченную ДНК с помощью выбранного метода на основе флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выходы ДНК вирома редко бывают достаточно высокими для количественной оценки на основе поглощения; Однако это всё равно может быть полезно для выявления химических загрязнителей.
  2. Для краткосрочного хранения храните ДНК при -20 °C после количественной оценки. Для длительного хранения храните при -80 °C. ДНК теперь готова к подготовке и секвенированию в библиотеке. Обратитесь к таблице материалов для комплекта для подготовки библиотеки и платформы секвенирования, используемых здесь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Исследовательская работа по применению этого протокола к одному замороженному образцу кала (обработанному в техническом тройном экземпляре для виромов) вместе с двумя образцами почвы продемонстрировала его эффективность в получении высококачественных виромов из различных типов образцов. Используя данные секвенирования с качественной фильтрацией и de novo собранные контиги, созданные этим протоколом, предполагаемые вирусные последовательности были выявлены с помощью отк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол представляет собой относительно простой и адаптируемый метод генерации виромов. Доказанный впочвах 14, 15, 16, 21, он успешно применяется здесь к образцам кала человека. Этот протокол лучше всего восстанавливает внеклеточные, целостные ДНК-вирусы и не предназначен для намеренного восстановления внутриклеточных вирусов или профагов (хотя некоторые ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

Благодарим докторов Шона Адамса, Трину Ноттс и Мохамеда Р. Али (Медицинская школа Калифорнийского университета в Дэвисе) за сбор и предоставление образца кала в соответствии с протоколами IRB и этическими стандартами. Благодарим доктора Мэттью Р. Олма (Университет Колорадо, Боулдер) за сотрудничество в анализе образца кала. Это исследование было поддержано Общим фондом NIH (Human Virome), премией # U01DE034198. LSH также частично поддерживался Министерством энергетики США (DOE), Управлением науки, Офисом биологических и экологических исследований (BER), Программой геномных наук, номер награды DE-SC0023127 (грант JBE, грант PI Сидни Глассман).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Порошок из сыворотки крупного рогатого рода (BSA) без ДНКазы и протеазыБиореагенты FisherBP9706100Для рецепта PPBS (Шаг 1.1)
Комплект DNeasy PowerSoil ProQIAGEN47016Набор для экстракции ДНК (шаг 4.1)
Комплект библиотеки KAPA DNA HyperPrepРошн/дБиблиотеки, сгенерированные этим набором, секвенировались на платформе Illumina NovaSeq 6000 (2 x 150 bp).
Сульфат магния (MgSO4), безводный и GE; 99.5%Сигма-ОлдричM7506Для рецепта PPBS (Шаг 1.1)
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), 10x, pH 7,4, без РНазыИнвитрогенAM9624Для рецепта PPBS (Шаг 1.1)
Мембранные шприцовые фильтры на основе полиэфирсульфона (PES), стерильные, 28 мм, 0,2 и мю; mКорнинг431229Для фильтрации шприца (Шаг 2.9)
Полипропиленовые конические центрифугные трубки, стерильные, 50 млOlympus Plastics28-108
Моногидрат цитрат калия (кристаллический/сертифицированный)Фишер КемикалP222Для рецепта PPBS (Шаг 1.1)
Qubit  Пробирные трубкиИнвитрогенQ32856Для количественной оценки ДНК (шаг 5.1)
Флуорометр Кубит-4ИнвитрогенQ33238Для количественной оценки ДНК (шаг 5.1)
Наборы для количественного анализа кубитов dsDNAИнвитрогенQ32850Для количественной оценки ДНК (шаг 5.1)
РНаз-свободная ДНКаза RQ1PromegaPR-M6101Включает реакционный буфер, DNase и стоп-раствор
Мембранные шприцовые фильтры супорного гидрофильного полиэфирсульфона (PES), стерильные, 32 мм, 5,00 и микро; m Cytiva (ранее Pall Lab)28150-956Для фильтрации шприца (Шаг 2.9)
Ротор ультрацентрифуга: ротор типа 50.2 Ti с фиксированным углом, 50.000 об/мин, 302.000 x g, 12 x 39 мБекман Коултер337901Мы также используем титановый ротор Beckman Coulter Type 70 Ti с фиксированным углом (кат. 337922). Центрифугите 3 часа, если используете 70 Ti.
Ультрацентрифугальные трубки: 26,3 мл поликарбонатная бутылка с крышкой, 25 x 89 ммБекман Коултер355618Совместим с роторами Beckman Coulter типов 50.2 Ti (Кат. 337901) и Type 70 Ti (Кат. 337922)
Ультрацентрифуга: Beckman Instruments Optima LE-80K Floor UltracentrifugeБекман Коултер365668Мы также используем Refrigerated Ultracentrifuge Beckman Coulter L8-70M (кат. 344196)

Ссылки

  1. Breitbart, M., et al. Metagenomic Analyses of an Uncultured Viral Community from Human Feces. J Bacteriol. 185 (20), 6220-6223 (2003).
  2. Liang, G., Bushman, F. D. The human virome: assembly, composition and host interactions. Nat Rev Microbiol. 19 (8), 514-527 (2021).
  3. Callanan, J., Stockdale, S. R., Shkoporov, A., Draper, L. A., Ross, R. P., Hill, C. Biases in Viral Metagenomics-Based Detection, Cataloguing and Quantification of Bacteriophage Genomes in Human Faeces, a Review. Microorganisms. 9 (3), 524(2021).
  4. Garmaeva, S., Sinha, T., Kurilshikov, A., Fu, J., Wijmenga, C., Zhernakova, A. Studying the gut virome in the metagenomic era: challenges and perspectives. BMC Biol. 17 (1), 84(2019).
  5. Lewandowska, D. W., et al. Optimization and validation of sample preparation for metagenomic sequencing of viruses in clinical samples. Microbiome. 5 (1), 94(2017).
  6. Conceição-Neto, N., et al. Modular approach to customise sample preparation procedures for viral metagenomics: a reproducible protocol for virome analysis. Sci Rep. 5 (1), 16532(2015).
  7. Palermo, C. N., Shea, D. W., Short, S. M. Analysis of Different Size Fractions Provides a More Complete Perspective of Viral Diversity in a Freshwater Embayment. Appl Environ Microbiol. 87 (11), e00197-e00221 (2021).
  8. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16 (1), 7(2015).
  9. Fudyma, J. D., et al. Exploring viral particle, soil, and extraction buffer physicochemical characteristics and their impacts on extractable viral communities. Soil Biol Biochem. 194, 109419(2024).
  10. Zhai, X., et al. The impact of storage buffer and storage conditions on fecal samples for bacteriophage infectivity and metavirome analyses. Microbiome. 11 (1), 193(2023).
  11. Trubl, G., Solonenko, N., Chittick, L., Solonenko, S. A., Rich, V. I., Sullivan, M. B. Optimization of viral resuspension methods for carbon-rich soils along a permafrost thaw gradient. PeerJ. 4, e1999(2016).
  12. Roux, S., et al. Towards quantitative viromics for both double-stranded and single-stranded DNA viruses. PeerJ. 4, e2777(2016).
  13. Kim, K. H., Bae, J. W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7668(2011).
  14. ter Horst, A. M., et al. Minnesota peat viromes reveal terrestrial and aquatic niche partitioning for local and global viral populations (vol 9, 233, 2021). Microbiome. 9 (1), (2021).
  15. Sorensen, J., Zinke, L., ter Horst, A., Santos-Medellín, C., Schroeder, A., Emerson, J. DNase Treatment Improves Viral Enrichment in Agricultural Soil Viromes. mSystems. 6 (5), e00614-e00621 (2021).
  16. Santos-Medellín, C., Estera-Molina, K., Yuan, M., Pett-Ridge, J., Firestone, M. K., Emerson, J. B. Spatial turnover of soil viral populations and genotypes overlain by cohesive responses to moisture in grasslands. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (45), e2209132119(2022).
  17. Emerson, J. B., Geonczy, S. E., Santos-Medellín, C., ter Horst, A. M., Fudyma, J. D. Soil Viromics Protocol - Emerson Lab v1. Protocols.io. , https://protocols.io/view/soil-viromics-protocol-emerson-lab-v1-b7nyrmfw/v1 (2022).
  18. Göller, P. C., Haro-Moreno, J. M., Rodriguez-Valera, F., Loessner, M. J., Gómez-Sanz, E. Uncovering a hidden diversity: optimized protocols for the extraction of dsDNA bacteriophages from soil. Microbiome. 8 (1), 17(2020).
  19. Larsen, F. SM buffer. , Protocols.io. https://www.protocols.io/view/sm-buffer-8epv5967jg1b/v1 (2021).
  20. Camargo, A. P., et al. Identification of mobile genetic elements with geNomad. Nat Biotechnol. , (2023).
  21. Santos-Medellín, C., Blazewicz, S. J., Pett-Ridge, J., Firestone, M. K., Emerson, J. B. Viral but not bacterial community successional patterns reflect extreme turnover shortly after rewetting dry soils. Nat Ecol Evol. 7 (11), 1809-1822 (2023).
  22. Halary, S., Temmam, S., Raoult, D., Desnues, C. Viral metagenomics: are we missing the giants. Curr Opin Microbiol. 31, 34-43 (2016).
  23. Williamson, S. J., et al. Metagenomic exploration of viruses throughout the Indian Ocean. PLoS One. 7 (10), e42047(2012).
  24. Liang, G., et al. The stepwise assembly of the neonatal virome is modulated by breastfeeding. Nature. 581 (7809), 470-474 (2020).
  25. Hillary, L. S., Knotts, T. A., Adams, S. H., Ali, M. R., Olm, M. R., Emerson, J. B. DNA extraction and virome processing methods strongly influence recovered human gut viral community characteristics. bioRxiv. , (2025).
  26. Santos-Medellín, C., Zinke, L. A., ter Horst, A. M., Gelardi, D. L., Parikh, S. J., Emerson, J. B. Viromes outperform total metagenomes in revealing the spatiotemporal patterns of agricultural soil viral communities. ISME J. 15 (7), 1956-1970 (2021).
  27. Gregory, A. C., Zablocki, O., Zayed, A. A., Howell, A., Bolduc, B., Sullivan, M. B. The Gut Virome Database Reveals Age-Dependent Patterns of Virome Diversity in the Human Gut. Cell Host Microbe. 28 (5), 724-740 (2020).
  28. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Methods. 7 (12), 943-944 (2010).
  29. Kosmopoulos, J. C., Klier, K. M., Langwig, M. V., Tran, P. Q., Anantharaman, K. Viromes vs. mixed community metagenomes: choice of method dictates interpretation of viral community ecology. Microbiome. 12 (1), 195(2024).
  30. Zhai, X., Gobbi, A., Kot, W., Krych, L., Nielsen, D. S., Deng, L. A single-stranded based library preparation method for virome characterization. Microbiome. 12 (1), 219(2024).
  31. Hillary, L. S., Adriaenssens, E. M., Jones, D. L., McDonald, J. E. RNA-viromics reveals diverse communities of soil RNA viruses with the potential to affect grassland ecosystems across multiple trophic levels. ISME Commun. 2, 34(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Метагеномика размера вируса ДНК для образцов кала человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.