Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
В этом исследовании использовалось секвенирование 16S рРНК для сравнения микробиоты кишечника у здоровых контрольных групп, нелеченных пациентов с БП и пациентов с БП, лечённых пирибедилом, а также выявления различий в микробном составе, связанном с лечением пирибедилом.
Целью этого исследования было определить, изменяет ли терапия пирибедилом кишечную микробиоту пациентов с болезнью Паркинсона (БП), предоставляя теоретическую ориентироспособность для понимания изменений кишечной микробиоты, вызванных пирибедилом, и их потенциальных клинических последствий. Фекальные образцы анализировались с помощью секвенирования гена 16S рибосомальной РНК (16S рРНК). Были проведены сравнения между пациентами с БП, принимающими пирибедил (группа пирибедила), пациентами с ХП, не принимающими пирибедил (группа ПД), и здоровыми контролями (пустая группа). По сравнению с пустой группой, относительная численность Staphylococcus, Rhodococcus и других родов была выше в группе с PD, тогда как относительная численность Achromobacter и Delftia была ниже. Кроме того, относительная численность Achromobacter, Delftia и Stenotrophomonas была выше в группе пирибедила по сравнению с группой PD, тогда как относительная численность Staphylococcus, Rhodococcus и других видов была ниже. По сравнению со здоровыми людьми, микробиота кишечника у пациентов с БП проявила значительные изменения. Микробиота кишечника у пациентов, принимающих пирибедил, значительно отличается от микробиоты нелеченых. Эти результаты указывают на связь между пирибедилом и изменённой микробиотой кишечника у пациентов с БП.
Заболеваемость болезнью Паркинсона (БП) постепенно увеличивается; однако его этиология и патогенез пока не полностью прояснены. Больше исследований показали, что микробиота кишечника тесно связана с началом и развитием БП. Он и др.1задокументировали, что состав микробиоты кишечника у пациентов с БП отличается от состава здоровых людей, и что увеличение числа кишечных патогенов может быть связано с началом БП. Шеперанс и др. 2подтвердили, что относительная численность Prevotella и Bacteroides в кишечнике у пациентов с БП снижена, и что эти бактериальные роды тесно связаны с функцией кишечного барьера.
Несколько исследований изучали связь между микробиотой кишечника и БП. Исследования показывают, что дисбиоз может играть ключевую роль в патофизиологии БП, влияя на моторные и немоторные симптомы через различные механизмы, включая воспаление и метаболическиенарушения 3. Кроме того, показано, что лекарственные методы лечения БП изменяют состав микробиомакишечника 4,5, что подчёркивает сложное взаимодействие между лекарствами и микробиомом кишечника.
Как неселективный агонист дофаминовых рецепторов, пирибедил играет ключевую роль в управлении БП; Он может улучшать моторные симптомы у пациентов, стимулируя дофаминовыерецепторы 6. Однако клиническое применение часто ограничено побочными реакциями, главным образом желудочно-кишечными симптомами, такими как тошнота, рвота и дискомфорт вживоте 7. Основной механизм этих побочных эффектов остаётся неясным, и связаны ли они с изменениями в микробиоте кишечника, вызванными пирибедилом, до сих пор неизвестны.
Связь между микробиотой кишечника и побочными реакциями на лекарства вызывает всё больший интерес в последние годы. Хилл-Бернс и др. проанализировалимикробиоту кишечника у пациентов с ПП и обнаружили, что разнообразие микробиоты кишечника связано с ответом на медикаментозную терапию. Кроме того, агонисты дофамина могут влиять на моторику кишечника и составмикроорганизмов 9. Считается, что механизмы этих изменений связаны с изменениями в времени транспорта кишечника, которые, в свою очередь, влияют на микробное разнообразие и численность. Кроме того, микробиота кишечника может влиять на всасывание препарата и метаболизм, тем самым влияя на эффективность и побочные эффекты этих препаратов. Однако до сих пор отсутствуют систематические исследования относительно того, влияет ли и как пирибедил, широко используемый агент при болезни Паркинсона, регулирует структуру микробиоты кишечника, а также связь между такими микробными сдвигами и его желудочно-кишечными побочными реакциями.
В настоящем исследовании мы сравнивали структуру микробиоты кишечника у здоровых контрольных групп, нелеченных пациентов с БП и пациентов с БП, получавших пирибедил. Мы выдвинули гипотезу, что лечение пирибедилом связано с выраженными изменениями состава кишечной микробиоты у пациентов с БП и что эти микробные изменения могут быть связаны с побочными эффектами желудочно-кишечного тракта, связанными с пирибедилом. Мы стремились выявить специфические микробные изменения, связанные с пирибедилом, и изучить их потенциальную связь с побочными эффектами желудочно-кишечного тракта, тем самым предоставив теоретическую основу для понимания механизма побочных реакций, связанных с пирибедилом.
Микробиота кишечника является важным направлением для исследований патогенезаПД 11. Наблюдая влияние пирибедила на микробиоту кишечника у пациентов с БП, это исследование помогает прояснить клиническую значимость изменений в микробиоте кишечника, связанных с лекарственными средствами, и предоставляет ориентир для оптимизации клинического применения и управления безопасностью пирибедила.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Это исследование было рассмотрено Комитетом по этике Первой аффилированной больницы Университета китайской медицины Аньхой (номер этического обзора: 2025AH-101, дата этического одобрения: 2025-07-02).
Предметы исследований
Пациенты с БП и здоровыми контролями в Первой аффилированной больнице Университета китайской медицины Аньхой были зачислены. Для дальнейшего анализа были собраны свежие образцы фекалий. Свежие образцы фекалий были собраны, алицитированы в стерильные пробирки EP, немедленно замораживались в жидком азоте и затем хранили при −80 °C для длительного сохранения. Критерии включения пациентов с БП были следующими: (1) клинически диагностированный БП; (2) возраст >70 лет; (3) для группы Пирибедила: начал монотерапию пирибедилом после регистрации и не имел предварительного контакта с этим препаратом; для группы с расстройством личности: не проходит лечение антипаркинсоновскими препаратами; (4) отсутствие других серьёзных системных заболеваний, таких как серьёзные болезни сердца, заболевания печени, почек или рак. Перед регистрацией от каждого участника получалось письменное информированное согласие. Критерии исключения были следующими: (1) тяжёлые осложнения БП, такие как тяжёлая моторная дисфункция; (2) недавно получил антибиотиколечение; (3) наличие других заболеваний, которые могут повлиять на результаты исследования, таких как воспалительные заболевания кишечника, синдром раздражённого кишечника и др.; (4) аллергия на пирибедил. Здоровые контрольные участники (группа Бланка) были возрастными (>70 лет) людьми без истории неврологических или тяжёлых желудочно-кишечных заболеваний.
Все участники должны были поддерживать свои обычные пищевые привычки до зачисления. Никто из них не получал пробиотики, пребиотики, добавки с пищевыми волокнами или другие пищевые добавки. Кроме того, все участники не получали антибиотики как минимум три месяца до сбора образца. В ходе исследования не проводилось стандартизированное диетическое вмешательство, но всем участникам было рекомендовано поддерживать стабильный образ жизни и питание, чтобы минимизировать возможные комбьюторские эффекты на микробиоту кишечника.
Исследовательская группа
Эта когорта была разделена на три группы: группа PD (n = 10): образцы кала, собранные у пациентов с болезнью Паркинсона, которые не принимали противопаркинсоновские препараты. Группа пирибедила (n=10): фекальные образцы, собранные у пациентов с болезнью Паркинсона после 21 дня непрерывного лечения пирибедила (50 мг, два раза в день). Пустая контрольная группа (n=5): образцы кала, собранные у здоровых людей.
Секвенирование 16S рибосомной РНК
Секвенирование проводилось на платформе секвенирования, как сообщалось в другихисследованиях 12,13. Кратко, полная микробная ДНК была выделена из фекальных образцов с помощью метода додецилсульфата натрия (SDS) 14,15,16. Целостность экстракционной ДНК проверялась с помощью электрофореза агарозного геля, а концентрация и чистота ДНК определялись спектрофотометром. Гипервариабельный регион V3-V4 гена бактериального 16S рРНК был амплифициран из геномной ДНК с помощью дегенеративных праймеров 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') и 806R (5'-GGACTACNNGGGTATTTAAT-3') с помощью термоциклера полимеразной цепной реакции (ПЦР). Амплификация гена бактериального 16S рРНК проводилась при следующих тепловых условиях: начальная стадия предварительной денатурации при 94 °C в течение 2 минут, затем 28 циклов, включающих денатурацию при 94 °C в течение 30 с, отжиг при 55 °C в течение 30 с и удлинение при 72 °C в течение 30 с. Последнее удлинение было проведено при 72 °C в течение 10 минут, после чего реакция поддерживалась при 4 °C. Смеси ПЦР содержат 2× мастер-смесь ПЦР 25 мкл, прямой праймер (10 мкМ) 2 мкл, обратный праймер (10 мкМ) 2 мкл, шаблонную ДНК 10 нг и, наконец,ddH 2O до 50 мкл. ПЦР-реакции проводились в тройном экземпляре. ПЦР-смеси содержат 2× мастер-смесь ПЦР 25 мкл, прямой праймер (10 мкМ) 2 мкл, обратный праймер (10 мкМ) 2 мкл, шаблонную ДНК 10 нг и, наконец,ddH 2O до 50 мкл. ПЦР-реакции проводились в тройном экземпляре. ПЦР-продукт был извлечен из 2% агарозного геля и очищен с помощью набора для экстракции геля. Для создания библиотеки использовался набор подготовки Universal Plus DNA Library для MGI V2: (1) Splinter link; (2) Использовать магнитное экранирование для удаления суставных самосмежных сегментов; (3) Обогащение шаблонов библиотек за счёт усиления ПЦР; (4) Магнитные шарики для извлечения продуктов ПЦР; (5) Циклизация продуктов ПЦР. После валидации библиотеки проводилась секвенирование.
Контрольные точки качества: Контрольный пункт 1 (сбор образцов): Образцы сразу после сбора замораживались и хранились при температуре −80°C. Любой образец с видимыми признаками оттаивания или загрязнения был отброшен. Контрольный пункт 2 (экстракция ДНК): приемлемая чистота: A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 ≥1,8; Целостность подтверждена одним полосой с высокой молекулярной массой на 1% агарозном геле. Контрольная точка 3 (ПЦР-усиление): Одна полоса при ~460bp на 2% агарозном геле означает успешное усиление (праймеры 341F/806R, область V3-V4); Если отсутствует или это не специфично, регулируйте температуру отжига или концентрацию шаблона. Для подготовки к библиотеке требовалась концентрация восстановления ≥0,5 нг/мкл. Контрольная точка 4 (подготовка и секвенирование библиотеки): выполняется секвенирующим центром по стандартным валидированным протоколам; никаких дополнительных внутренних контрольных пунктов (например, размера биоанализатора) не применялось.
Безопасность и утилизация отходов: Во время всей обработки образцов носили перчатки и лабораторные халаты. Рабочие поверхности очищались с использованием 70% этанола. Все загрязнённые расходники (наконечники, трубки, гели) были автоклавированы (121°C, 20 минут) перед утилизацией как биологически опасные отходы.
Биоинформатика
Исходные секвенирующие считывания гена 16S рРНК сначала были демультиплексированы, подвергнуты фильтрации качества с помощью fastp (версия 0.20.0) и собраны с помощью FLASH (версия 1.2.11) по стандартизированным критериям скрининга. Кратко: (i) Последовательности на 300 бп были сокращены, когда средний балл качества опускался ниже 20 в течение 50 бп скользящего окна. Считывания с усечённой длиной короче 50 bp или с неоднозначными основаниями были удалены; (ii) Сборка последовательностей проводилась только при перекрытиях свыше 10 б.п., при максимальном несоответствии перекрывающейся области на уровне 0,2. Непарные чтения, которые не удалось собрать, были исключены; (iii) Отдельные образцы были разделены на основе последовательностей штрихкодов и праймеров для последующего корректирования ориентации. Сопоставление штрихкодов выполнялось с точным выравниванием, тогда как сопоставление праймера позволяло достичь максимум двух несоответствий нуклеотид. Чтения рРНК 16S анализировались с помощью конвейера Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) (версия 1.8.0)17. Последовательности тегов добавлялись к парным концам чтений с использованием FLASH (версия 1.2.11)18. Обрезка проводилась с использованием UPARSE (версия 7.0.1090) с минимальной длиной 200 bp и средним качеством 25, после чего кластеризировала с порогом 97% для генерации операционных таксономических единиц (OTU)19. Репрезентативные чтения OTU были таксономически классифицированы с помощью классификатора RDP 2.2 с пределом доверия ≥0.6. Количество тегов и чтений определялось сравнением с помощью USEARCH global20. Идентификация химерных последовательностей была основана на сравнениях с базой данных Gold с использованием UCHIME (v4.2.40)21. Анализ главных координат (PCoA) был впоследствии проведён на разрежённом наборе данных на основе различий Брэя–Кёртиса, при этом порог сходства последовательностей был установлен на уровне 97% для кластеризации. Представительные OTU и соответствующие таксономические профили дополнительно анализировались с помощью программного обеспечения R (версия 3.1.1). Алгоритм линейного дискриминантного анализа размера эффекта (LEfSe), основанный на размере эффекта линейного дискриминантного анализа (LDA), применялся к биомаркерам скрининга с значительным разным количеством на уровне OTU. Этот метод подчёркивает как статистическую значимость, так и биологическую значимость, сначала выявляя признаки с согласованными различиями между группами (используя тест Крускаля-Уоллиса для многогруппового сравнения), а затем оценивая размер эффекта каждого дифференциально многочисленного признака с помощью LDA. Балл LDA >2.0 определяется как значительно увеличенноеизобилие 22.
Статистические методы
Статистический анализ проводился с использованием SPSS. Обычно распределённые данные анализировались с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA). Данные, не соответствующие нормальному распределению, анализировались с помощью теста ранговой суммы Уилкоксона. Все количественные данные выражались как среднее ± стандартной ошибке (SE) для параметров, соответствующих нормальному распределению, тогда как ненормально распределенные данные представлялись как медиана с межквартильным диапазоном. p-значение < 0,05 считалось статистически значимым.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Различия в микробном разнообразии, связанные с лечением пирибедилом
Результаты контроля качества экстракции ДНК (диапазон концентрации, чистота) приведены в дополнительной таблице 1. Контроль качества амплификации ПЦР (размер полосы, концентрации восстановления) показан в дополнительной таблице 2. Метрики контроля качества секвенирования (количество чтений, глубина, покрытие) подробно описаны в Дополнительной таблице 3...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Болезнь Паркинсона занимает второе место по распространённости нейродегенеративным заболеванием в мире, уступая только болезниАльцгеймера 23. С 1970 года пирибедил, как агонист дофаминовых рецепторов, широко используется при леченииХП 24. Однако в клинической практике пирибедил может вызывать некоторые побочные реакции, такие как тошнота, рвота и дискомфорт в желудочно-кишечном тракте. Растущие исследования показывают, что развитие болезни ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы утверждают, что конкурирующих интересов нет.
Это исследование было поддержано Проектом финансирования резервных кандидатов для академических лидеров провинции Аньхой (No 2022H287), Проектом выдающихся талантов в области гигиены и здоровья провинции Аньхой (No ahsjhmypygc20230074), Научно-исследовательским проектом провинции Аньхой по наследованию и инновациям традиционной китайской медицины (2025CCCX017) и Специальным проектом по базово-клинической интеграции Университета китайской медицины Аньхой (JCLCA2025009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2× reaction buffer (Taq MasterMix) | Kangweii | CW0690 | |
| Agarose | (общий) | не применимо | молекулярно-биологического класса |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Axygen Biosciences | (не предоставлено) | |
| Настольная высокоскоростная центрифуга для заморозки | Hunan Kosei | GTR116C | |
| Реагенты для извлечения ДНК (СДС, фенол, хлороформ, этанол) | (общий) | не применимо | |
| Платформа секвенирования DNBSEQ-G99 PE300 | MGI Tech Co., Ltd | DNBSEQ-G99 | |
| Аппарат для гель-электрофореза | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Система имэджинга гелей | Shanghai Jiapeng | JP-2880 | |
| Программное обеспечение LEfSe | (открытый исходный код) | онлайн версия | |
| Спектрофотометр NanoDrop | Hangzhou Haipe | Aurora-900 | |
| ПЦР-аппарат | Hangzhou Langji | A200 | |
| Пирибедил | Servier | 6094078 | |
| Праймеры: 341F и 806R (синтезированы) | (пользовательский синтез) | не применимо | |
| Программное обеспечение QIIME | (открытый исходный код) | http://qiime.org | версия 1.8.0 |
| Флуорометр Quantus | Promega | E6150 | |
| Флуорометр Qubit 4.0 | Invitrogen | Q33226 | |
| СДС (натриевая соль додецилсульфата) | (общий) | не применимо | |
| Программное обеспечение UPARSE | (открытый исходный код) | http://drive5.com/uparse | версия 7.0.1090 |
| Комплект для подготовки библиотеки ДНК VAHTS Universal Plus для MGI V2 | Vazyme | NDM627-01 |