Разработка нановезикул с мембраной мезенхимальных стволовых клеток для усиленной доставки генов

Краткое содержание

Этот протокол направлен на внедрение метода производства и очистки внеклеточных везикульных биомиметиков, полученных из мезенхимальных стволовых клеток (MSC), для генной терапии. Нановезикула ограничена липидными бислоями, полученными из MSC, и инкапсулирует рекомбинантные AAV, несут интересующий ген в просвете. Этот нанувезикул обеспечивает улучшенный вектор для доставки генов in vivo .

Аннотация

Внеклеточные везикулы (EV), полученные из мезенхимальных стволовых клеток (MSC), обладают большим потенциалом для терапевтических применений и регенеративной медицины. EV — это наномасштабные везикулы, выделяемые всеми известными типами клеток, которые несут разнообразные грузы, включая мембранно-закреплённые белки, растворимые факторы, несколько видов РНК и метаболиты, регулирующие физиологию и поведение клеток-реципиентов. В то время как EV, полученные от MSC или модифицированные EV, могут доставлять терапевтические белки и РНК, доставка ДНК с помощью EV остаётся сложной задачей из-за отсутствия эффективных механизмов сортировки последовательностей ДНК в везикулы. Предыдущие исследования нашей группы и других исследований показали, что EV, содержащие аденоассоциированные вирусы (AAV), обеспечивают таргетную доставку ядерного ядра и устойчивую экспрессию генов in vitro и in vivo. Однако их производство и изоляция были ограничены низким урожаем и трудоёмкими процедурами. Здесь мы сообщаем о разработке нанововезикул, покрытых мембраной MSC, созданных методом экструзии с определённым размером для эффективной доставки генов. Эти везикулы диаметром примерно 200 нм имитируют свойства естественных EV, одновременно инкапсулируя рекомбинантные AAV-векторы, несущие терапевтические генные последовательности. По сравнению с обычными AAV, инженерные везикулы MSC повысили эффективность доставки генов и достигли значительно более высоких результатов при сокращении времени и затрат по сравнению с естественно выделяемыми EV-AAV. В итоге мы представляем новую платформу мембранных нановезикул на базе MSC, которая сочетает преимущества структур, имитирующих EV, с переносом генов через AAV. Такой подход повышает эффективность доставки и масштабируемость производства, предлагая перспективную стратегию для продвижения генной терапии к клиническому переводу.

Введение

Генная терапия представляет собой трансформационный подход к лечению генетических и приобретённых заболеваний путём внедрения, замены или заглушания определённых генов для восстановления нормальной функции клеток. За последние два десятилетия достижения в области векторной инженерии и стратегий доставки значительно расширили терапевтический ландшафт генной терапии. Среди различных разработанных векторных систем аденоассоциированный вирус (AAV) стал одной из самых успешных и широко принятых платформ благодаря своему благоприятному профилю безопасности, эффективной трансдукции и долгосрочной экспрессии генов как в делящихся, так и в неделящихся^{клетках 1,2}. На сегодняшний день несколько терапевтических средств на основе AAV получили регуляторное одобрение для клинического применения, включая лечение атрофии спинномозговой мышцы, дистрофий сетчатки и гемофилии, что стало важными вехами в трансляционной^{медицине 3}. Широкий тропизм и низкая иммуногенность AAV-векторов также позволили им применяться в различных тканях, включая печень, мышцы, центральную нервную систему и глаз^. В результате AAV стал ведущей платформой для доставки генов in vivo, поддерживая текущие доклинические и клинические исследования, направленные на метаболические, неврологические и сердечно-сосудистые заболевания.

Несмотря на выдающийся клинический успех, генная терапия на основе AAV сталкивается с рядом внутренних проблем, которые продолжают ограничивать её широкое применение. Одним из основных ограничений является ограниченная упаковочная ёмкость генома капсида AAV (~4,7 кб), что ограничивает его использование для доставки крупных или нескольких терапевтических^{генов 5,6}. Кроме того, биораспределение и клеточный тропизм векторов AAV во многом определяются их серотипами, каждый из которых проявляет свои особенности к конкретным тканям. Хотя для повышения эффективности таргетирования и трансдукции тканей применялись обширные стратегии капсидного отображения и дисплея пептидов, достижение точного и предсказуемого тропизма в различных биологических контекстах остаётся значимым^{препятствием 7}. Ещё одним важным ограничением является распространённость уже существующих нейтрализующих антител (NAbs) против естественных серотипов AAV в человеческой популяции. Даже низкие титры NAbs могут существенно снизить эффективность трансдукции векторов, ограничивая подход к пациентам и усложняя повторное^{дозирование 8,9}. Были изучены различные стратегии, такие как рациональная переработка капсида, иммуносупрессивные схемы и временный обмен плазмой, чтобы смягчить нейтрализацию, опосредованную^{антителами 10,11}, однако эти методы обеспечивают лишь частичное или временное облегчение. В совокупности эти ограничения снижают общую терапевтическую эффективность и воспроизводимость доставки генов, опосредованных AAV, в клинических условиях.

В последние годы экстраклеточно-везикулозный AAV (EV-AAV) был исследуем как альтернативный вектор, способный преодолеть ряд ключевых ограничений традиционных^AAV 12,13,14,15. При упаковке векторов часть частиц AAV может выделяться через пути везикулярного движения и заключаться в внеклеточные везикулы. Считается, что этот процесс включает AAV-кодируемый мембранно-ассоциированный акцессорный белок (MAAP), который способствует вирусному выходу и способствует мембранной^{ассоциации 16,17}. Полученные частицы EV-AAV демонстрируют повышенную эффективность трансдукции и повышенную устойчивость к нейтрализующим антителам по сравнению с обычным AAV, главным образом благодаря везикулярной мембране, которая способствует клеточному захвату и обеспечивает частичную защиту от распознавания^{антител 18}. Однако, несмотря на эти преимущества, производство электромобилей и AAV остаётся неэффективным. Обычно только небольшая часть векторных геномов (примерно 0,5%-12%) выделяется в культурную среду как AAV, связанные с EV, в то время как большинство остаются внутриклеточными или существуют в виде свободных^{AAV 12,13}. Следовательно, для получения достаточного векторного выхода требуется крупномасштабное производство. Кроме того, генерация EV-AAV в основном демонстрировалась с помощью HEK293T продуцирующих клеток, чьи EV могут проявлять быстрый печеночный клиренс, короткий период полураспада и потенциальные проблемы с биобезопасностью. Эти ограничения подчёркивают необходимость более эффективной и настраиваемой стратегии мембранной оболочки, что стимулирует разработку платформы AAV (CME-AAV), представленной в данном исследовании.

Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) и их EV были широко изучены на предмет их регенеративного потенциала и иммунных уклоняющихся свойств. Помимо терапии, основанных на клетках или естественно секретируемых EV, недавние исследования показали альтернативный подход к усиленной доставке лекарств с использованием наночастиц, скрытых мембранами^MSC 19,20,21. Мембранное покрытие MSC обеспечивает активную способность нацеливаться, снижает иммунный клиренс и продлевает время кровообращения, эффекты чего, вероятно, связывают с внутренним молекулярным составом мембран, полученных из^{MSC 22,23}. Опираясь на эту концепцию, мы использовали мембранный материал, полученный из MSC, для создания нановезикулы AAV, CME-AAV, покрытой клеточной мембраной, для доставки генов. Для этого очищенные фрагменты мембраны MSC смешивались с рекомбинантными частицами AAV и подвергались контролируемому процессу экструзии — технике, изначально разработанной для изготовления^{липосом 24,25}. С помощью размерно-определённой экструзии мембранные компоненты спонтанно собираются в наномасштабные везикулы, инкапсулирующие частицы AAV. Полученные CME-AAV дополнительно очищались из свободных, неинкапсулированных AAV с помощью центрифугации на основе градиента плотности. Эта стратегия обеспечивает эффективную и воспроизводимую подготовку мембранных AAV-векторов, которые демонстрируют значительно повышенную эффективность трансдукции по сравнению с традиционными AAV и сохраняют сопоставимую устойчивость к нейтрализующим антителам, как и EV-AAV. Заменяя различные трансгены, платформа CME-AAV обладает широким потенциалом для лечения различных генетических и приобретенных заболеваний.

Протокол

Все процедуры с животными были одобрены институциональным комитетом по уходу и использованию животных Пекинского педагогического университета в Чжухае, Китай. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка и формирование CME-AAV посредством экструзии, определяемой размером пор,

1. Производство рекомбинантных AAV-векторов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол производства AAV следует ранее опубликованным и широко используемым процедурам. Подробные шаги оптимизации и вариации были описаны в предыдущих^{исследованиях 12,26}.
   1. Культура HEK293T клетки в полной среде роста и поддержание их слияния 70%-80% в день трансфекции.
   2. Подготовьте три плазмиды, кодирующие (i) вектор переноса AAV, несущий интересующий трансген, (ii) гены AAV rep/cap, соответствующие желаемому серотипу, и (iii) функции аденовирусного помощника.
   3. Ко-трансфект HEK293T клеток с тремя плазмидами с использованием проверенного метода трансфекции (например, кальциев-фосфат или полимерная трансфекция), следуя стандартной лабораторной практике.
   4. Инкубировать трансфектированные клетки в течение 48–72 часа, чтобы обеспечить сборку и накопление AAV.
   5. Собирайте клетки и культурную среду, а также выпускайте частицы AAV с помощью повторных циклов замораживания и оттаивания или аналогичного метода лизисирования клеток.
   6. Центрифугуйте лизат на низкой скорости, чтобы удалить клеточный мусор и собрать супернатант, содержащий частицы AAV.
   7. Очищайте частицы AAV с помощью ультрацентрифугации с градиентом плотности или другого устоявшегося метода очистки.
   8. Обменять очищенные AAV-векторы на стерильный фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) и хранить аликвоты при −80 °C до использования.
2. Подготовка мембранной фракции MSC
   ПРИМЕЧАНИЕ: Человеческие мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были выделены в соответствии с институциональными рекомендациями. Клетки культивировались и расширялись в установленных условиях или в лабораторно изменённых протоколах. Идентичность MSC может быть подтверждена путём оценки экспрессии фенотипических маркеров, таких как CD73, CD90 и CD105, с помощью потоковой цитометрии. Мультипотентность МСК подтверждается их способностью дифференцироваться на остеобласти, хондроциты и адипоциты in vitro. Клетки готовы к сбору, когда достигают 70%-90% слияния. Следующие процедуры не обязательно должны выполняться в стерильных условиях.
   1. Удалите посевную среду и отсоедините MSC от посевной чашки с помощью клеточного скребка.
   2. Соберите отделённые клетки в коническую трубку с PBS и центрифугуйте при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C для гранулирования клеток.
   3. Промывайте клетки дважды PBS, каждый раз центрифугая при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
   4. Суспензировать последнюю клеточную гранулу в PBS с добавлением коктейля с ингибиторами протеазы.
   5. Подвергайте суспензию клетки трём циклам заморозки-оттаивания, чтобы разрушить плазматическую мембрану и получить грубый клеточный лизат.
   6. Тщательно зафиксируйте лизат для гомогенизации, затем центрифугуйте при 1000 × г в течение 20 минут при 4 °C для удаления клеточного мусора.
   7. Перенесите супернатант в новую трубку и центрифугу при 18 000 × г в течение 1 часа при 4 °C, чтобы гранулировать мембранную фракцию.
   8. Отбросьте супернатант и снова суспензуйте полученную мембранную гранулу в PBS. Эта суспензия представляет собой примитивную фракцию мембраны MSC и будет использоваться для инкапсуляции AAV.
   9. Гомогенизуйте мембранную суспензию, последовательно пропуская её через шприцы с иглами от 20 G до 27 G.
   10. Определите концентрацию белка в гомогенизированной мембранной суспензии с помощью анализа BCA. Аликвойте и храните подвеску при −80 °C, либо сразу переходите к следующим шагам. После каждого цикла оттаивания мембрану повторно гомогенизируйте мембранную суспензию, используя шприц на 27 G.
3. Образование CME-AAV посредством экструзии
   1. Смешайте подготовленную мембранную суспензию с AAV в определённом соотношении 150 мкг мембранного белка на 1 × 10^копий генома (г.к.) AAV. Инкубировать смесь при 37 °C в течение 30 минут с аккуратным встряхиванием.
   2. Загрузите смесь мембраны и AAV на мини-экструдер, оснащённый мембраной из поликарбоната (PC) диаметром 400 нм. Пропустите образец через экструдер 20 раз, чтобы способствовать инкапсуляции мембраны-AAV.
   3. Замените мембрану PC диаметром 400 нм на мембрану 200 нм и повторите процесс экструзии 20 раз, чтобы ещё больше снизить гетерогенность размеров везикул.
   4. Соберите обработанную смесь. Если требуется большее количество, объединяйте несколько экструзионных партий. В результате получается суспензия CME-AAV, а также неинкапсулированные AAV и пустые мембранные пузырьки. Немедленно приступайте к очистке CME-AAV.

2. Очистка CME-AAV с помощью центрифугации градиента плотности

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описывается разделение чистого CME-AAV от неинкапсулированных AAV, белковых агрегатов и остаточных нуклеиновых кислот с помощью ультрацентрифугирования с градиентом плотности на основе йодиксанола. Очищенный CME-AAV, полученный на этом этапе, подходит как для исследований in vitro , так и in vivo . Все процедуры рекомендуется проводить под стерильным капюшоном для культуры тканей.

1. Подготовка градиента йодиксанола
   1. Приготовьте растворы йодиксанолов на 40% и 25%, разбавляя настоящий раствор 10× PBS и стерильной деионизированной водой для достижения конечной концентрации в 1× PBS.
   2. В тонкостенной ультрапрозрачной трубке объемом 13,2 мл аккуратно установите прерывистый градиент плотности, уложив под 1 мл 40% йодиксанола и 3 мл 25% йодиксанола снизу.
   3. Аккуратно наложите 7 мл суспензии, содержащей CME-AAV, полученной с шага 1.14, на верх градиента. Сбалансируйте трубы и загрузите их в сверхцентрифугный ротор.
2. Ультрацентрифугирование и сбор фракций CME-AAV
   1. Центрифугировать градиент при 150 000 × г в течение 3 часов при 4 °C с использованием быстрого ускорения и медленного замедления (уровень 9 и уровень 1 соответственно).
   2. Аккуратно снимайте трубки с ротора, не нарушая градиент. Соберите фракции 1 мл от верхней до нижней части пробирки в маркированные микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 мл (F1-F11). Держите все дроби на льду.
   3. Определить и объединить фракции F7 и F8, содержащие очищенные CME-AAV, в новую открытую ультрацентрифугную трубку. Добавьте PBS к общему объёму 11 мл и аккуратно перемешайте с пипеткой на 1 мл.
3. Промывка и восстановление CME-AAV
   1. Центрифугуйте объединённые фракции снова при 150 000 × г в течение 3 часов при 4 °C с использованием быстрого ускорения и быстрого замедления (уровень 9 для обоих параметров).
   2. Аккуратно сбросьте супернатант и снова суспензируйте гранулу CME-AAV в 50-200 мкл стерильного PBS, в зависимости от желаемой концентрации.
   3. По необходимости наносить аликвоты и хранить при −80 °C до дальнейшего использования.

3. Характеристика CME-AAV с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (TEM)

ПРИМЕЧАНИЕ: Трансмиссионная электронная микроскопия (TEM) используется для визуализации морфологии, размера и структуры мембраны частиц CME-AAV. Процедура следует стандартному протоколу отрицательного окрашивания, аналогичному тому, что применяется для внеклеточных везикул. Все этапы выполняются при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Подготовка образца и фиксация
   1. Разбавить очищенную суспензию CME-AAV, полученную на этапе 2, до концентрации примерно 1 ×^{10 9-1} × 10¹⁰ частиц/мл в PBS.
   2. Фиксируйте образец, добавив равный объём свежеприготовленного параформальдегида 4% (конечная концентрация 2%) и инкубировав 30 минут при комнатной температуре.
   3. Положите медную сетку с углеродным покрытием Formvar/200-сетку на лист парафиновой пленки, углеродной стороной вверх.
   4. Пипетка 10 мкл фиксированной подвески CME-AAV на сетку позволяет адсорбцию в течение 30 минут при комнатной температуре. Избегайте сушки во время адсорбции.
   5. Аккуратно удалите лишнюю жидкость с края сетки фильтрующей бумагой, не касаясь центра.
2. Мойка и постфиксация
   1. Поставьте сетку, пробной стороной вниз, на 50 мкл PBS на 2 минуты для мытья. Повторите дважды.
   2. Перенесите сетку на 50 мкл капли 1% глутаральдегида на 5 минут, чтобы стабилизировать структуру мембраны.
   3. Последовательно промывайте сетку 5 раз каплями деионизированной воды (по 30 секунд каждая), чтобы удалить буферные соли. Аккуратно промокните после финальной стирки.
3. Отрицательное окрашивание
   1. Поставьте сетку на 50 мкл капли 2% водного уранилацетата на 1 минуту, чтобы получить отрицательное окрашивание.
   2. Удалите лишнюю морилку, аккуратно коснувшись края сетки фильтрующей бумагой и дайте ей полностью высохнуть на воздухе при комнатной температуре.
4. Визуализация
   1. Осмотрите окрашенные сетки с помощью пропускного электронного микроскопа с напряжением 200 кВ.
   2. Сделать репрезентативные изображения с увеличением от 30 000× до 120 000× чтобы оценить морфологию CME-AAV и целостность мембран.
   3. Опционально измеряйте диаметры частиц с помощью программного обеспечения для анализа изображений TEM, чтобы подтвердить согласованность размеров везикул с результатами NTA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация образца — Скорректируйте концентрацию CME-AAV для получения умеренной плотности частиц; Чрезмерно концентрированные образцы приводят к перекрытию частиц, тогда как чрезмерно разбавленные образцы дают мало обнаруживаемых везикул. Избегание артефактов — неполная промывка может оставить кристаллы соли, которые мешают визуализации частиц. Убедитесь, что решётки остаются увлажнёнными во время окрашивания, чтобы предотвратить разрушение слома. Альтернативные окраски — фосфорно-восторгстическая кислота (PTA, 1%-2%, pH 7,0) может использоваться в качестве альтернативы уранилацетату, если применяются ограничения на радиоактивное обращение. Хранение — подготовленные решётки можно хранить в контейнере без пыли при комнатной температуре несколько дней перед визуализацией, хотя для лучшего контраста рекомендуется немедленное наблюдение.

4. Количественная оценка CME-AAV с помощью qPCR

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг описывает метод количественной оценки копий генома CME-AAV на основе qPCR (g.c./μL). Протокол делает акцент на подготовке образцов, специфичных для CME-AAV, и отчетности данных. Все остальные аспекты настройки и циклирования qPCR должны соответствовать стандартной лабораторной практике и инструкциям производителя для выбранного комплекта qPCR.

1. Образец и стандартная подготовка
   1. Разморозьте аликвоты очищенного CME-AAV на льду и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования. Избегайте вихря.
   2. Подготовьте стандартное разбавление AAV с 1 × 10⁶ до 1 × 10³ г.к./мкл последовательно 10-кратным разбавлянием с использованием безнуклеазной деионизированной воды или буфера TE. Готовьте стандартные свежие или аликвотные и храните при −20 °C для краткосрочного использования.
   3. Подготовьте следующие контрольные параметры: контроль без шаблона (NTC; вода), отрицательный контроль (PBS или пустая матрица) и положительный контроль (образец AAV известной концентрации), если он есть.
   4. Приготовьте мастер-смесь qPCR на льду согласно инструкциям производителя для выбранного химического состава (на основе красителя или зонда).
2. qPCR-циклирование и анализ данных
   1. Запускайте qPCR с использованием параметров циклирования, рекомендованных производителем мастер-микса qPCR.
   2. Побудите стандартную кривую, построив график C_t (ось y) против логарифма₁₀ (стандартная концентрация в g.c./μL) (ось x). Подгонить линейную регрессию для получения наклона (m) и y-пересечения (b).
   3. Вычислите концентрацию генома CME-AAV для каждого образца репликации с помощью регрессионного уравнения:
      или
      
      где C — копии генома на μL.
   4. Средние технические реплицировки и сообщают итоговую концентрацию CME-AAV как g.c./μL.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку тепловая денатурация во время подготовки qPCR нарушает как оболачивающую мембрану, так и AAV капсиды, отдельная экстракция ДНК не требуется. Не проводите обработку ДНКазой образцов перед тепловым лизисом; DNase может получать доступ и разрушать геномы AAV после нарушения капсидов/мембран, но до того, как образец достигнет температур, инактивирующих DNase. Стандарты должны быть согласованы, где это возможно: подготовьте стандартную кривую из хорошо охарактеризованного стандарта AAV. Если ваши образцы или стандарты отличаются по конфигурации генома (одноцепочечный AAV против самокомплементарного/двухцепочечного AAV), скорректируйте соответствующие значения. Конструкция капсули/зонда: капсулы могут нацеливаться на любую консервированную последовательность AAV; В качестве примера часто используются праймеры, направленные на промотор CMV (выше трансгена).

5. Количественная оценка профилей частиц CME-AAV

1. Используйте анализ отслеживания наночастиц (NTA), регулируемое резистивное импульсное сенсорирование (TRPS) или аналогичные методы анализа частиц для определения распределения размеров и концентрации частиц препаратов CME-AAV.
2. Разтаивайте очищенные образцы CME-AAV на льду и мягко гомогенизуйте с помощью пипетирования перед анализом. Проводить измерения в соответствии со стандартной лабораторной практикой и инструкциями производителя для выбранного прибора, как описано в ранее опубликованных^{протоколах 12, 27, 28, 29}.

6. Анализ in vitro переноса генов, опосредованного CME-AAV

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описывается процедура оценки доставки генов, опосредованной CME-AAV, и экспрессии трансгенов в культивируемых клетках. Анализ продемонстрирован с помощью HEK293T клеток и CME-AAV9. EGFP, но может быть адаптирован к другим типам клеток или репортерным конструкциям. Обычный (без мембранной оболочки) AAV9. EGFP служит положительным контролем, тогда как PBS или пустые частицы AAV используются в качестве отрицательных контролей.

1. Подготовка клеток
   1. Культура HEK293T клетки в стандартных условиях (DMEM с 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицином) при 37 °C при 5% CO₂.
   2. Семенные клетки размещают в пластины с 48 или 96 колодцами, чтобы достичь примерно 70% слияния во время трансдукции (обычно через 24 часа после посева). Корректируйте плотность посева в зависимости от размера скважины (например, ~5 × 10⁴ ячеек/скважина для пластины на 48 лунок или ~1 × 10⁴ ячейки/скважина для пластины на 96 лунок).
   3. Дайте клеткам прикрепиться и уравновеситься в течение 24 часов перед добавлением векторов.
2. Векторное применение
   1. Подготовьте CME-AAV9. EGFP и AAV9. Рабочие решения EGFP в стерильных PBS. Типичная доза вируса: 5 × 10⁸ г.к. на 48-колодец (корректировка в зависимости от силы промотора, целевых генов и экспериментальных целей).
   2. Для каждой ямы добавьте равные копии генома (g.c.) CME-AAV9. EGFP или AAV9. EGFP напрямую в культурную среду.
   3. Включайте отрицательные контрольные скважины с эквивалентным объёмом PBS или пустые частицы AAV.
   4. Аккуратно покрутите пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение, и верните в инкубатор.
   5. Продолжайте инкубацию в течение 24-72 часов, в зависимости от активности промоторов и кинетики экспрессии трансгенов. При EGFP, управляемом CMV, в HEK293T клетках обычно наблюдается сильная флуоресценция в течение 48 часов.
3. Визуализация и анализ живых клеток
   1. Когда готовы к визуализации, аккуратно аспирируйте культурную среду и дважды промывайте клетки PBS, чтобы удалить несвязанные частицы. Избегайте вытеснения клеток.
   2. Окрашивание ядер клеток с Hoechst 33342 (совместимый с живыми элементами) согласно инструкциям производителя. Не используйте DAPI для живых ячеек.
   3. Проведение флуоресцентной визуализации живых клеток с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа с соответствующими фильтрами (например, возбуждение 488 нм/эмиссия 513 нм для EGFP; возбуждение 350 нм/эмиссия 460 нм для Хёхста).
   4. Используйте объективы 10× или 20× для количественной оценки эффективности трансдукции и 63× объектива для высокоразрешающей субклеточной локализации, если это необходимо.
   5. Получите не менее пяти полей обзора на каждую скважину (например, четыре угла и один центр), используя одинаковые параметры изображения (время экспозиции, усиление, диафрагма и т.д.).
   6. Сохраняйте все изображения в raw и gray форматах для количественного анализа.
4. Количественный анализ изображений
   1. Открытые изображения в ImageJ (FIJI) или аналогичном программном обеспечении.
   2. Измерьте среднюю интенсивность флуоресценции для каналов EGFP и Hoechst для каждого поля.
   3. Определите интенсивность фона, выбрав область без флуоресцентного сигнала и усредняя значения пикселей.
   4. Рассчитайте скорректированную интенсивность для каждого канала:
      _{Я исправил = То есть} —_{я предыстория}
   5. Вычислите нормализованную интенсивность для каждого поля как:
      
   6. Средняя нормализованная интенсивность по минимум пяти полям на скважину и отчёт среднего ± SD по трём независимым биологическим репликам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CME-AAV обычно демонстрирует повышенную флуоресцентную интенсивность по сравнению с обычным AAV при применении равных копий генома, что отражает улучшенное клеточное поглощение и/или защиту от нейтрализующих антител. Оптимальная эффективность трансдукции зависит от качества подготовки CME-AAV, типа клетки, силы промотора и титра вируса. Если наблюдаются слабые сигналы, увеличивайте входную копию генома, подтверждайте целостность вектора с помощью qPCR и проверяйте калибровку микроскопа. В зависимости от экспериментальных нужд могут использоваться другие флуоресцентные репортёры (например, mCherry, mNeonGreen, tdTomato) или конструкции люцифераз. При работе с первичными или неадгезентными элементами корректируйте условия посева и визуализации соответственно (например, покрытие пластин поли-L-лизином или использование камерных затворов).

7. Оценка CME-AAV — опосредованная доставка гена в модели мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описывается оценка передачи генов с помощью CME-AAV in vivo с использованием мышиной модели.

1. Приготовление животных
   1. Используйте диких мышей, такие как C57BL/6. Убедиться, что все процедуры для животных одобрены институциональным комитетом по уходу и использованию животных и выполняются в соответствии с соответствующими нормативными актами.
   2. Выбирайте мышей, выдержанных 4-6 недель для оптимальной консистенции в разных экспериментах.
   3. Содержать животных в стандартных условиях содержания с доступом к корму и воде ad libitum перед введением.
2. Подготовка и применение векторов
   1. Выберите серотип AAV согласно цели исследования и целевой ткани. В этом исследовании используются AAV9 и CME-AAV9.
   2. Подготовьте вирусные векторы, кодирующие репортерный ген люциферазы (например, CME-AAV9.luciferase), для неинвазивной визуализации.
   3. Разведите вирусные векторы в стерильном физрастворе до конечной концентрации 1 × 10¹° копий генома (г.к.) на 50 мкл для каждой мыши.
   4. Аккуратно прогрейте хвост грелкой или теплой водой для расширения вены перед инъекцией.
   5. Загрузите 50 мкл вирусной суспензии в инсулиновый шприц 31 G и медленно введите в боковую хвостовую вену, чтобы минимизировать утечку и разрыв вен.
   6. После инъекции верните мышей в клетки и наблюдайте за ними до полного выздоровления.
3. Биолюминесцентная визуализация in vivo
   1. Через две недели после применения анестезируйте мышей изофлураном (согласно утверждённым институциональными протоколами) и введите D-люциферин (150 мкг/г массы тела; Сигма) внутрибрюшнически в PBS.
   2. Поместите анестезированных мышей в систему биолюминесценции.
   3. Получайте изображения люминесценции каждые 2 минуты после инъекции до достижения плато.
   4. Количественно измеряйте биолюминесценцию с помощью соответствующего программного обеспечения. Определите области интереса (ROI) вокруг люминесцентных областей и вычислите общий поток фотонов (фотоны/с) для каждого животного.
   5. Для сравнения включите группы, обработанные AAV9.luc, и PBS, получавшие инъекцию PBS, как положительные и отрицательные контрольные группы соответственно.
4. Ex vivo визуализация
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необязательный.
   1. Сразу после in vivo визуализации усыпьте мышей и соберите основные органы (печень, сердце, селезёнку, почки и мозг).
   2. Сфотографируйте изолированные органы с идентичными параметрами визуализации с помощью той же системы IVIS для определения экспрессии люциферазы в тканях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целей, экспериментальных целей могут быть выбраны альтернативные методы введения (например, внутримышечная, внутримозговая или внутрибрюшническая инъекция). Интенсивность биолюминесценции отражает как эффективность доставки генов, так и биораспределение тканей. Экспрессия люциферазы, опосредованная CME-AAV, обычно демонстрирует более раннее начало и повышенную пиковую экспрессию по сравнению с свободным AAV из-за мембранно-опосредованного эндоцитоза с восходящими клетками. Обеспечьте стабильную дозу, время и настройки визуализации люциферина на разных образцах для точного сравнения. Описанная вирусная доза (1 × 10¹° г.к. на мышь) обычно обеспечивает обнаруживаемый сигнал через 2–4 недели после инъекции, но для других векторов или животных моделей может потребоваться оптимизация.

Результаты

MSC, использованные в этом исследовании, были выделены из ткани пуповины человека в соответствии с протоколами в соответствии с соответствующими этическими нормами. Мембранные фракции MSC были подготовлены согласно описанному протоколу. AAV9. EGFP производился внутри компании с использованием системы транфекции с двумя плазмидами в HEK293T клетках, как ранее^{сообщалось 12,26}. Для изготовления CME-AAV, мембранных препаратов и AAV9....

Обсуждение

Ключевые шаги протокола CME-AAV

Этот протокол описывает метод создания AAV, покрытых мембраной MSC, и несколько этапов критически важны для успешного формирования CME-AAV. Во-первых, необходима тщательная предварительная обработка клеточной мембраны. Цель этого этапа — получить фрагменты мембраны, подходящие для экструзии, минимизируя загрязнение ядерной ДНК, цитозольными белками и субклеточные органеллы. Кроме того, размер фрагментов мембраны...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Bioluminescence imaging system	PerkinElmer	Оптическая система изображения IVIS Spectrum (Lumina III)
D-Люциферин калия соль	Yeasen Biotechnology	40902ES03
Фетальный бычий сыворотка	Yeasen Biotechnology	40130ES76
Флуоресцентный микроскоп	Zeiss	Axio Observer 7
Форвар/углеродистое покрытое медное сито 200 ячеек	Millipore-Sigma	TEM-FCF400CU
Глутаральдегид	Millipore-Sigma	354400
HBSS	Gibco	C14175500BT
Hieff Unicon qPCR TaqMan Probe Master Mix	Yeasen Biotechnology	11205ES08
High-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium	Hyclone	SH30243
Высокоскоростная центрифуга	Beckman Coulter	Avanti J-E
Hoechst 33342	Beyotime	C1022
NTA инструмент	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
Прозрачная тонкостенная трубка для ультрацентрифуги	Beckman Coulter	344059
OptiPrep иодиксанол	Millipore-Sigma	D1556
Параформальдегид 4%	Beyotime	P0099
PBS	Biosharp	BL302A
Пенicillin-стрептомицин	Millipore-Sigma	V900929
qPCR инструмент	Applied Biosystems	QS6 real-time PCR system
Ротор для высокоскоростной центрифуги	Beckman Coulter	JA-25.50
SW 41 Ti Swing-bucket ротор для ультрацентрифуги	Beckman Coulter	331362
Электронный микроскоп передачи	JEOL	JEM-2100F
Ультрацентрифуга	Beckman Coulter	Optima XE-100
Ацетат урана	Electron Microscopy Sciences	NC1375332
Фильтры из поликарбоната Whatman Nuclepore (200 нм)	Cytiva	10417004
Фильтры из поликарбоната Whatman Nuclepore (400 нм)	Cytiva	10417104