Методическая статья

Хирургический метод установления мышиной модели остеоартрита колена с использованием модифицированной процедуры Халта

146 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70379

⸱

15 мая 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает усовершенствованные хирургические этапы модифицированной модели Халта, обеспечивая стандартизированный, воспроизводимый метод для индуцирования экспериментального остеоартрита.

Аннотация

Остеоартрит колена (КОА) — это хроническое дегенеративное заболевание суставов, характеризующееся дегенерацией суставного хряща, ремоделированием субхондральных костей, образованием остеофитов и синовитом, который является самым распространённым типом остеоартрита.

Этот протокол представляет собой хирургический метод установления мышиной модели остеоартрита колена с использованием модифицированной процедуры Халта. По сравнению с инъекционными или традиционными хирургическими моделями, такими как дестабилизация медиального мениска (DMM) и пересечение передней крестообразной связки (ACLT), модифицированная модель Хулта вызывает более раннее начало заболевания и более тяжёлое воспаление суставов. Путём пересечения медиальной коллатеральной связки, медиального мениска и передней крестообразной связки, этот метод нарушает механическое выравнивание коленного сустава, тем самым способствуя прогрессированию ОА. Эта модель особенно подходит для изучения острой патологии ОА и оценки возможных терапевтических вмешательств. Для оценки тяжести артрита мы использовали ультразвук мелких животных в сочетании с трёхмерной (3D) реконструкцией полости сустава, чтобы количественно определить её объём и оценить накопление синовиальной жидкости. Кроме того, для оценки разрушения хряща Международного общества остеоартрита (OARSI) было проведено сафранин-О/быстрое зелёное окрашивание гистологических срезов.

Введение

Остеоартрит колена (ОА) — это распространённое хроническое дегенеративное заболевание суставов, клинически характеризующееся болью, скованностью, ограниченной подвижностью и мышечной слабостью вокруг колена. Его распространённость выше у женщин, чем у мужчин. При недостаточном контроле ОА может привести к прогрессирующей потере физической способности, нарушениям сна, хронической усталости и в конечном итоге инвалидности. По мере старения населения мира частота ОА колена продолжает расти, создавая серьёзную проблему для систем здравоохранения и экономик по всему миру 1,2.

С патофизиологической точки зрения потеря хряща является центральной чертой ОА, сопровождаемой структурным и функциональным нарушением всего сустава и перисуставных тканей. Для разъяснения механизмов заболеваний и оценки терапевтических вмешательств были разработаны различные модели на животных, которые обобщают ключевые аспекты человеческого остеоартрита. Среди них чаще всего применяются хирургически индуцированные модели. Например, дестабилизация медиального мениска (DMM)3 и пересечения передней крестообразной связки (ACLT)4 нарушают нормальную структуру суставов, что приводит к дегенерации хряща и изменениям, подобным ОА. В качестве альтернативы химические модели основаны на внутрисуставном введении агентов, разрушающих внеклеточный матрикс (например, коллагеназу или мононатрий йодоацетат), что приводит к быстрой гибели хондроцитов и эрозиихряща 5,6. В то время как инъекционные модели обычно достигают конечной патологии в течение нескольких недель, хирургические модели обычно требуют более длительного курса.

Среди доступных хирургических техник мы выбрали и дополнительно усовершенствовали модель Хулта из-за ускоренного появленияOA 7. Комбинируя пересечение передней крестообразной и задней крестообразных связок с резекцией медиальной коллатеральной связки и тотальной медиальной менисектомией, эта модель надёжно вызывает серьёзные, быстро прогрессирующие повреждения хряща и субхондральные изменения костей. Короткий срок до структурного разрушения суставов делает модифицированную модель Хулта особенно подходящей для исследований острых или субакутных ОА, и мы предлагаем, что наш оптимизированный протокол предоставляет практическую, воспроизводимую платформу для будущих доклинических исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по этике животных Шанхайского университета традиционной китайской медицины. Самцы мышей C57BL/6 возрастом от 6 до 8 недель и весом примерно 20 г были приобретены у коммерческих поставщиков (см. Таблицу материалов) (номер одобрения по этике: PZSHUTCM2312210005).

1. Предоперационный уход

  1. Дайте мышам акклиматизироваться не менее чем на неделю до операции.
  2. Стерилизуйте все хирургические инструменты перед операцией и продезинфицируйте рабочее пространство.
  3. Включите аппарат газовой анестезии и поместите мышь в индукционную камеру на 5 минут с использованием 2-3% изофлурана для начала общей анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что расход кислорода поддерживается в диапазоне от 0,5 NL/мин до 1 NL/мин.
  4. После анестезии перенесите мышь на хирургическую платформу и поддерживайте анестезию с помощью 1-1,5% изофлурана через анестезиологическую маску до завершения операции (1-1,5% изофлуран).
  5. Положите мышь в положение на спине так, чтобы коленные суставы были обращены вверх, обеспечивая стабильность и правильный доступ к месту операции.
  6. Проверьте глубину анестезии, проверив отсутствие рефлексов, затем нанесите депиляционный крем, чтобы полностью удалить волосы вокруг коленной сустава.
  7. Аккуратно удалите остаточный крем марлей или ватными палочками, затем сначала продезинфицируйте открытую кожу этанолом 75%, затем настойку йода для обеспечения асептических условий.

2. Хирургическая процедура (рисунок 1)

  1. Вытяните заднюю конечность мыши и приложите тягу, чтобы подтянуть кожу. Сделайте продольный разрез 0,5–1 см вдоль медиальной стороны правого коленного сустава с помощью стерильного хирургического лезвия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все описанные ниже хирургические процедуры проводились под хирургическим микроскопом.
  2. Втяните кожу и проведите тупую диссекцию подлежащей фасции, чтобы полностью обнажить капсулу сустава, и визуализировать надколенную связку.
  3. Прощупьте и разрезайте фасцию, лежащую над медиальной коллатеральной связкой (MCL), с помощью тонкой инъекционной иглы.
  4. Перерезать MCL с помощью микроножниц при увеличении.
  5. Сместите надколенную связку с помощью иглы, чтобы обнажить внутрисуставное пространство и определить медиальный мениск.
  6. После разреза перерезайте медиальную менискотитибиальную связку (MMTL) с помощью микроножниц и аккуратно прощупьте ткань иглой, чтобы подтвердить полное отслоение и подвижность мениска.
  7. Определите и перерезайте переднюю крестообразную связку (ACL), стараясь избежать повреждения задней крестообразной связки (PCL) или латерального мениска. Обычно после операции это приводит к положительному признаку переднего ящика, подтверждающего нестабильность сустава.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тест с ящиком: Перед закрытием раны бедренная кость стабилизировалась одной рукой, а лодыжка — другой, сохраняя большеберцовую и бедренную кости в перпендикулярном положении. Относительное переднезаднее смещение между большеберцовой и бедренной костью применялось вручную; Наблюдаемое трансляционное движение указывало на положительный признак ящика, подтверждающий нарушение крестообразных связок.
  8. Для индуцирования более тяжёлого остеоартрита, альтернативно, проводите одновременное пересечение передней крестообразной связки (ACL) и задней крестообразной связки (PCL) в сочетании с медиальной менискэктомией (MMT) (как в классической модели Хулта).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным и может выполняться по мере необходимости; если выбрано, это образует подход к моделированию классической модели Хулта.

3. Послеоперационный уход

  1. Закройте разрез 4-0 нейлоновыми швами и продезинфицируйте место операции настойкой йода.
  2. Положите мышь на грелку с контролируемой температурой, пока она не придёт в себя и не проявит нормальное дыхание и моторную активность. Когда вы полностью восстановитесь и не появляйте признаков беспокойства, верните его в домашнюю клетку.
  3. Следите за целостностью шва непрерывно в течение 3-5 дней после операции. Если наблюдается разрыв шва, повторно анестезируйте мышь и проведите повторное наложение шва
  4. Вводите внутримышечные антибиотики в течение 3 дней после операции для предотвращения послеоперационной инфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Введение антибиотиков применяется для профилактики послеоперационной инфекции. Послеоперационная анальгезия определяется экспериментальными целями; В исследованиях остеоартрита анальгетики обычно придерживаются в острой фазе, чтобы не запутать оценку терапевтической эффективности.
  5. Ежедневно следите за хирургическим местом на наличие признаков отёка, выделений или локального воспаления.
  6. Усыпить мышь в конце исследования, следуя утверждённым протоколам, и вскрыть коленный сустав для гистологического или визуализированного анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе мы приняли протокол эвтаназии экспериментальных животных с помощью анестезии при передозировке. Это было достигнуто путём внутрибрюшнической инъекции раствора пентобарбита натрия в дозировке >100 мг/кг у мышей.

4. Оценка развития OA

  1. Перед эвтаназией оцените отёк суставов и проведите УЗИ для оценки структурных изменений в коленной суставе. Оцените моторную работу мыши с помощью ротародного теста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для ультразвукового исследования у мышей требуется анестезия с изофлураном.
  2. После эвтаназии вскрытие коленного сустава и аккуратно удалите окружающую мышцу и фасцию, сохраняя при этом большеберцовую кость, малоберцовую и бедренную кости.
    Закрепите соединения и декальцифицируйте их раствором 10% этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) не менее 30 дней, заменяя раствор два раза в неделю для полной декальцификации.
  3. Внедрить декальцифицированные коленные суставы в парафин и подготовить сагиттальные срезы толщиной 4мкм8.
  4. Начинайте собирать срезы, когда мениск будет хорошо виден. Покрасьте срезы сафранином O и fast green, чтобы визуализировать морфологию хряща и субхондральной кости. Оценить деградацию хряща с помощью системы оценкиOARSI 9 .
  5. Процедура окрашивания Safranin O-Fast Green (используется коммерческий набор, см. таблицу материалов)
    1. Депарафинизация и регидратация
      1. Депарафинизируйте срезы в ксилоле в течение 3 минут, повторите 3 раза.
      2. Регидратировать с помощью серии градированного этанола (100%, 90%, 80%) для удаления остаточного ксилола по 2 минуты каждая.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Серии этанолов должны использоваться в порядке убывания концентрации.
      3. Прополосните в дистиллированной воде на 1 минуту и ненадолго слийте жидкость.
    2. Окрашивание железным гематоксилином Вайгерта
      1. Нанесите рабочий раствор Weigert на секции, помажьте морилку в течение 5 минут.
      2. Прополосните в дистиллированной воде на 1 минуту и ненадолго слийте жидкость.
    3. Кислотная дифференцировка
      1. Наносите кислотный дифференцирующий раствор на срезы в течение 15 секунд.
      2. Смойте в воде 10 минут и спустите лишнюю воду.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Время дифференцировки критически важно — длительное дифференцирование предотвращает быстрое зелёное окрашивание, тогда как недостаточная дифференциация приводит к глубокому быстрому зелёному окрашиванию с плохим усвоением сафранина
    4. Быстрое зелёное окрашивание
      1. Нанесите быстрый зелёный раствор на участки на 5 минут, затем ненадолго слийте жидкость.
      2. Нанесите слабый кислотный раствор для удаления остаточного быстрозелёного пятна на 15 секунд и ненадолго слийте жидкость.
    5. Окрашивание Safranin O
      1. Нанесите раствор сафранина O на секции в течение 4,5 минут.
      2. Быстро переведите секции на 90% этанола, чтобы удалить избыток сафранина O, 2-3 секунды.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап может быть удлинён соответствующим образом в зависимости от интенсивности окрашивания сафранина.
    6. Обезвоживание и очистка
      1. Дегидрировать секции в 100% этаноле в течение 1 минуты.
      2. Прозрачные срезы в ксилоле для полного обезвоживания, 2 минуты, повторите 3 раза.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Ксилол, используемый на этом этапе, не должен смешиваться с тем, что используется в разделе 4.5.1; Перекрёстное загрязнение может ухудшить качество сечений.
    7. Крепление с нейтральным бальзамом
      1. Поместите секции в вытяжку, чтобы избыток ксилола испарился.
      2. Удалите срезы, нанесите на образец соответствующее количество нейтрального бальзама и аккуратно накройте накладным слоем.
      3. Осмотрите участки под световым микроскопом на наличие воздушных пузырьков и аккуратно удаляйте их наличие.
      4. Храните участки в горной коробке и помещайте в духовку при температуре 60 °C на 24 часа, чтобы обеспечить полное затвердевание нейтрального бальзама.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Продольные сканирования коленного сустава проводились с помощью микрозвуковойсистемы УЗИ 8 с шагом сканирования 4 мм и осевым разрешением 0,04 мм. На седьмой день послеоперационной 3D-реконструкция выявила заметное увеличение объёма суставной полости в модельной группе по сравнению с фальшивой группой (рисунок 2A,B). Испытания усталостиRotarod 10,11 подтвердил...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В сравнении с другими методами хирургического моделирования, такими как дестабилизация медиального мениска (DMM) и пересечения передней крестообразной связки (ACLT), модифицированная модель Хулта вызывает остеоартрит через комбинированные повреждения связок и мениска. Специфическое структурное нарушение определяет изменения в биомеханике суставов на разных плоскостях. ACLT 4 снижает устойчивость вращения (внутреннюю и внешнюю ротацию) и снижает переднезадней стаби...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Это исследование было профинансировано Планом действий по инновациям в науке и технологиях в Шанхае (23YF1447900 до CJM), программой Чэнгуан Шанхайского фонда развития образования и Шанхайской муниципальной комиссией по образованию (23CGA53 до CJM), а также Национальным фондом естественных наук Китая (U24A6013–XH).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Инъекционный шприц объёмом 1 мл//Технические характеристики: 30 G и раз; 0,13 мм
3D ультразвуковая система визуализации Vevo 3100ОптикаVevo 2100Высокочастотная система ультразвуковой визуализации, интегрированная с программным обеспечением Vevo LAB для анализа данных.
Нейлоновый шов 4-0//
75% этанолШанхайская Титанская Научная Компания, Ltd.G73537O
C57BL/6J самцы мышей (6-8 недель)Шанхайская лаборатория животных Шанхай Цзесицзе Ко., Лтд./
Депиляционный кремVeetЛот: C021123001
Йодная настойка//
ИзофлуранRWD R650-IE
МикрощипцыRWD F12013-10
МикроножницыRWD S11035-08
Модифицированные наборы Safranin O и Fast Green StainSolarbioG1371
Держатель для иглыRWD F21001-12
Хирургические лезвия (10#)RWD S31010-01
Хирургический микроскопОлимпSZ61

Ссылки

  1. Sharma, L. Osteoarthritis of the Knee. N Engl J Med. 384 (1), 51-59 (2021).
  2. Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Res. 5, 16044(2017).
  3. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  4. Zhou, X., et al. Antioxidant taurine inhibits chondrocyte ferroptosis through upregulation of OGT/Gpx4 signaling in osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transection. J Adv Res. 77, 551-567 (2025).
  5. Jal Janusz, M., et al. Moderation of iodoacetate-induced experimental osteoarthritis in rats by matrix metalloproteinase inhibitors. Osteoarthritis Cartilage. 9 (8), 751-760 (2001).
  6. Meng, X., et al. An impaired healing model of osteochondral defect in papain-induced arthritis. J Orthop Translat. 26, 101-110 (2021).
  7. Rogart, J. N., Barrach, H. J., Chichester, C. O. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 7 (6), 539-547 (1999).
  8. Xu, H., et al. Utilization of longitudinal ultrasound to quantify joint soft-tissue changes in a mouse model of posttraumatic osteoarthritis. Bone Res. 5, 17012(2017).
  9. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  10. Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the Cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. Int J Mol Sci. 23 (19), 11342(2022).
  11. Piel, M. J., Kroin, J. S., van Wijnen, A. J., Kc, R., Im, H. J. Pain assessment in animal models of osteoarthritis. Gene. 537 (2), 184-188 (2014).
  12. Obeidat, A. M., et al. A standardized approach to evaluation and reporting of synovial histopathology in two surgically induced murine models of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 32 (10), 1273-1282 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи