Исследовательская статья

Создание первичных культур, обогащённых зонами, из коры надпочечников мышей

352 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70403

⸱

8 мая 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Endocrinology, Boston Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 3Harvard Stem Cell Institute, 4Institute of Biomedical Science, University of São Paulo, 5Broad Institute of MIT and Harvard

В этой статье

Краткое содержание

Для надпочечниковой коры мышей был разработан надежный и воспроизводимый подход к созданию двумерных первичных культур клеток, обогащённых гломерулозой и фасцикулатами. Эта система сохраняет ключевые молекулярные и функциональные особенности каждой зоны, позволяя целенаправленно изучать сигнальные пути, выработку гормонов и поведение клеток коры надпочечников ex vivo.

Аннотация

Надпочечник мыши инкапсулирован мезенхимальным клеточным слоем (капсулой) и содержит подлежащую кору, организованную в отдельные концентрические зоны с специализированными эндокринными функциями: зона гломерулёзы (zG), которая вырабатывает альдостерон, и зона пучков (zF), вырабатывающая кортикостерон. Надпочечник, расположенный в центре железы, вырабатывает катехоламины. Механистические исследования клеток из каждой адренокортикальной зоны были ограничены отсутствием моделей in vitro , которые сохраняли бы специфические по зонам молекулярные, клеточные и функциональные характеристики. Для преодоления этого ограничения был разработан метод фракционирования с использованием микродиссекции надпочечников взрослых мышей. Этот метод разделяет надпочечники у самцов мышей на zG-обогащённую внешнюю фракцию (OF), содержащую капсульные и zG-клетки, и внутреннюю фракцию, обогащённую zF, содержащую zF и медуллярные клетки. Эти дроби использовались для получения двумерных (2D) первичных культур, обогащённых для zG-или zF-клеток. Анализ экспрессии генов подтвердил, что культуры, обогащённые zG, экспрессируют высокие уровни маркеров zG (Cyp11b2, Dab2 и Shh), а также повышенные маркеры путей Wnt/β-катенина (Wnt4, Lef1). В отличие от этого, культуры, обогащённые zF, демонстрировали более высокую экспрессию маркеров zF (Cyp11b1 и Akr1b7) и более низкий уровень маркеров пути Wnt/β-катенина, что соответствует транскрипционной подписи zF. Экспрессия стероидогенных маркеров (Nr5a1, Star) подтвердила адренокортикальное происхождение обеих клеточных фракций. Тирозингидроксилаза указывает на наличие медуллярных клеток надпочечников в культурах, обогащённых zF. Функционально культуры, обогащённые zG, вырабатывали альдостерон при базальных условиях и демонстрировали повышенную выработку в ответ на ангиотензин II, калий и адренокортикотропный гормон (АКТГ). В то же время культуры, обогащённые zF, вырабатывали кортикостерон на начальном уровне и демонстрировали повышенную выработку в ответ на стимуляцию АКТГ. В целом, этот протокол представляет собой надёжную, воспроизводимую и биологически значимую in vitro модель для изучения биологии коры надпочечников. Эта система позволяет зонально исследовать сигнальные пути, молекулярные механизмы и физиологические реакции.

Введение

Тонкая мезенхимальная капсула охватывает надпочечниковую железу мыши, которая состоит из двух основных отделов: внешней коры и внутренней мозговой мозговой клетки. Надпочечниковая кора взрослого самца мыши дополнительно делится на отдельные зоны — зону гломерулозы (zG) и зону пучков (zF), каждая из которых обладает уникальными морфологическими и функциональнымихарактеристиками 1,2,3,4. Основная функция коры надпочечников — выработка стероидных гормонов, включая минералокортикоиды (альдостерон) и глюкокортикоиды (кортикостерон у мышей)5. zG — самая внешняя и компактная область, состоящая из яйцевидных клеток, организованных в розеточные структуры, экспрессирующие альдостеронсинтазу (CYP11B2), что позволяет вырабатыватьальдостерон 2,3,5,6,7. Секреция альдостерона в основном регулируется системой ренин-ангиотензин-альдостерон (RAAS), калием и, в меньшей степени,ACTH 5,8. zF состоит из крупных клеток, расположенных в радиальных пучках/пучках, составляет большую часть (~85%) коры и регулируется преимущественно ACTH 2,3,5,9. Множество сигнальных путей координируют развитие, поддержание и функцию надпочечников, регулируя динамику клеток предшественников, зонирование и стероидогенную активность. Среди них SF-1 (стероидогенный фактор-1, Nr5a1) является главным регулятором, необходимым для адренокортикальной спецификации, пролиферации и выработкигормонов 10. Звуковая сигнализация ежа (Shh), активная в zG, способствует расширению клеток-предшественников и поддерживает обновление коры вzG 11,12,13.

Сигнализация Wnt, особенно через канонический β-катенин, имеет решающее значение для зонирования надпочечников и целостности коры. У мыши нормальный размер и зонирование адренокортика регулируются градиентом сигнальной активности WNT, простирающимся от капсулы к zF. Этот градиент подтверждается локализованной экспрессией WNT-лигандов и потенциаторов, главным образом WNT4 в zG, а также WNT2B и R-спондинов (RSPO1 и/или RSPO3) вкапсуле 7,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . Надпочечниковая кора поддерживается центростремительным потоком клеток из пролиферативных прогениторных клеток, расположенных в субкапсулярной/внешней области zG, которые дают начало дифференцированным zG-клеткам, мигрирующих внутрь к zF. При переходе от zG к zF клетки претерпевают изменения экспрессии и функции генов, называемые трансдифференцировкой. Эта модель была сильно поддержана исследованиями по трассе родословной с использованием трансгенной линии мышей ASCre/+, которая специально нацелена на клетки, продуцирующие альдостерон вzG 23,24,25.

Для изучения надпочечниковой биологии были использованы несколько подходов in vitro на основе диссоциации всей надпочечнойжелезы 26,27,28. Например, одно исследование описывало диссоциацию коры надпочечников для электрофизиологических и патч-кламповыханализов 27, а другое исследование использовало диссоциированные клетки коры надпочечников для изучения сигнальных механизмов, связанных с физиологией надпочечников и регуляцией артериальногодавления 26. Хотя эти методологии дали важные функциональные выводы, они опираются на клетки из целых надпочечниковых препаратов, а не на разделение корковых зон перед культивированием.

Учитывая сложность и гистологическое разнообразие надпочечников, понимание различных ролей её клеточных компартментов крайне важно для разъяснения механизмов, лежащих в основе функции надпочечников. В этом исследовании были установлены первичные адренокортикальные клеточные культуры мышей, обогащённые для zG или zF-клеток. Одним из главных преимуществ этого метода является получение клеточных культур, обогащённых zG, что позволяет экспериментально модулировать сигнальные пути и факторы окружающей среды для лучшего изучения его специфической роли в биологии коры надпочечников. Это включает изучение поддержания предшественников-клеток, механизмов, лежащих в основе зональной пластичности и трансдифференцировки к zF, а также моделирование состава внеклеточного матрикса. Параллельно этот метод генерирует высокообогащённые zF-клеточные культуры, предоставляя дополнительную платформу для зоноспецифических функциональных и сигнальных исследований. Вместе эти особенности обеспечивают надёжную, экспериментально контролируемую систему для продвижения понимания надпочечниковой биологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утверждёнными Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Бостонской детской больницы (IACUC) под номером одобрения 00002611. Полный список всех материалов, используемых в данном протоколе, включая реагенты, расходные материалы и оборудование, приведён в Таблице материалов, а также соответствующие производители и каталожные номера для обеспечения воспроизводимости.

Первичные культуры клеток зоны гломерулозы надпочечников и фасцикулаты у мышей
Методы установления первичных культур взрослых самцов мыши дикого типа (Mus musculus, C57BL/6) адренокортикальных клеток в этом исследовании были адаптированы из процедуры, изначально разработанной для крыс Спраг-Доули28. Для подтверждения сегрегации и идентичности популяций клеток zona glomerulosa и zona fasciculata была использована модель отслеживания линии с использованием мышей Cyp11b2tm1.1(cre)Brlt/+ (также известных как Cre)мышей 1,2,3,4 и мышей Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP) Luo/J (также известной как ROSAmT/mG) 29.

Подготовка перед процедурой
Материалы
Два комплекта пинцетов и ножниц для поверхностных разрезов и ещё один набор для разреза брюшной полости (дополнительный рисунок 1A). Прогрели культурную среду и PBS (37 °C). Приготовил 2 блюда (P60) с DMEM/F-12. Приготовили 3 блюда (P60) с подогретым PBS для последовательного промывки желез (ванна 1, 2 и 3) (дополнительные рисунки 1B, 1–3) и одну тарелку для поддержания надпочечников в растворе (дополнительные рисунки 1B, 4). Приготовили 2 тарелки (P60) с стерильной фильтрующей бумагой на поверхности (дополнительные рисунки 1C, 1–2). Приготовили 2 порции P60 с 500 мкл раствора для пищеварения и маркировали их для клубочков (zG) или пучока (zF) (дополнительные рисунки 1D, zG, zF). Подготовили 2 пробирки, маркированные как zG и zF, и добавили 4,5 мл раствора для пищеварения.

Решения
Для получения раствора для расщепления коллагеназу типа I (конечная концентрация 4 мг/мл) и DNазу I (конечная концентрация 0,04 мг/мл) растворяли в 5 мл чистой среды DMEM/F-12. Раствор фильтровал в трубку на 50 мл с помощью шприца и фильтра 0,22 мкм. Раствор для пищеварения должен готовиться свежим каждый раз.

Животные
Для получения первичных культур, обогащённых для клеток надпочечниковой зоны гломерулозы и фасцикулата у мышей используют 10–15 молодых взрослых самцов примерно 6–7 недель. У самок надпочечники немного больше, чем у самцов, и по этому протоколу можно использовать оба пола. Однако в этом исследовании использовались только самцы, чтобы избежать возможных помех со стороны X-зоны, присутствующей у молодых самок, обеспечивая точное зональное разделение. Мышей эвтаназировали вдыханием CO₂ в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу за животными. Смерть была подтверждена отсутствием дыхания и рефлекторной реакцией. Надпочечники были немедленно вскрыты в течение 3–5 минут после подтверждения смерти для сохранения жизнеспособности тканей.

Положение и обнажение брюшной полости
Мышь была размещена в положении спинного декубита на стерильной плоской поверхности (рисунок 1A). Шерсть животного была дезинфицирована 70% спиртом. Для кожных разрезов использовались щипцы и ножницы, а второй комплект — для разреза брюшной полости. Был сделан первоначальный разрез в паховой области брюшка, который простирался латерально к груди с обеих сторон, обнажая брюшину (рисунок 1B). Кожа была аккуратно убрана, затем мышцовая часть брюшной полости, чтобы открыть брюшную полость (рисунок 1C). Начальный разрез должен быть поверхностным, чтобы избежать повреждения внутренних органов. Продвигайтесь к мышечному слою с осторожным разрезом, затем обнажите брюшную полость. Избегайте разрыва кровеносных сосудов, так как кровотечение может затруднить поиск надпочечников и задержать их сбор. Замените хирургические инструменты, чтобы минимизировать микробное загрязнение.

Идентификация и сбор левой надпочечницы
Левая надпочечниковая железа расположена медиально и выше левой почки в ретробрюгионеуме, имеет овальную форму и розовую окраску, окружённую белой жировой тканью (рисунки 1D–G). При аккуратном смещении соседних органов тупыми щипцами для улучшения визуализации с помощью ножниц удаляйте большую часть жировой ткани короткими, контролируемыми разрезами, изолируя надпочечник. Избегайте прямого захвата надпочечников, чтобы предотвратить повреждение её капсулы. После изоляции железу сразу же помещали в посевную чашу P60 с 10 мл предварительно нагретого DMEM/F-12 при 37 °C (см. рисунок 1F).

Идентификация и сбор правой надпочечниковой железы
Правая надпочечница расположена латерально и расположена выше правой почки в ретробрюшинеуме, имеет овальную форму и розовую окраску (рисунки 1E–H). Идентификация этой надпочечниковой железы может быть сложнее из-за её близости к другим органам, таким как печень и восходящая кишка, а также к близлежащим кровеносным сосудам. Аккуратно вымещая соседние органы тупыми щипцами для улучшения визуализации, с помощью ножниц удаляйте большую часть жировой ткани короткими, контролируемыми разрезами, изолируя надпочечник, при этом стараясь не повредить капсулу. После изоляции железа была помещена сразу после изоляции в культурную чашу P60 с 10 мл предварительно подогреного DMEM/F-12 при 37 °C. Надпочечники объединяются в одной и той же чаше (рисунок 1F). Во время процедуры важно аккуратно обращаться с крупными кровеносными сосудами в этой области, чтобы избежать случайных порезов, которые могут вызвать кровотечение и усложнить процесс сбора. Основные сосуды, на которые следует обращать осторожность, — это почечные и почечные артерии. Собрал надпочечниковую железу с некоторой приклеенной жировой тканью. Это облегчает работу с железой и защищает от повреждения и загрязнения капсул (рисунок 1I).

Работа в стерильной ламинарной вытяжке
Перед перемещением желез в ламинарную вытяжку тарелку протирали 70% спиртом. Надпочечники были промыты PBS три раза при комнатной температуре (25 °C) (в чашах 1, 2 и 3 и собраны в чашу 4) (Дополнительный рисунок 1B). Фильтрующая бумага помогает с адгезией жира и обеспечивает лучшие результаты. Во время подготовки нескольких желез отдельные ткани должны сохраняться в предварительно нагретой DMEM для сохранения жизнеспособности. Надпочечник захватывался прилипшей жировой тканью (рисунки 1I–J), а жир аккуратно рассекали на фильтрующей бумаге (дополнительный рисунок 1C, тарелка 1), используя тонкие щипцы и контролируемые движения, чтобы избежать повреждения капсулы. Ожидаемый результат — гладкая, целая железа, свободная от избытка жира и соединительной ткани, как показано на рисунке 1K. Надпочечники аккуратно переносились на свежую фильтрующую бумагу (дополнительный рисунок 1C, тарелка 2) для обеспечения точной микродиссекции. Капсулу аккуратно защемили тонким щипцем, и с помощью лезвия скальпеля сделали радиальный разрез в железе без полного пересечения ткани.

Внутреннее содержимое коры аккуратно обнажалось, выталкивая их наружу через разрез с помощью лёгкого механического давления щипцами. Капсула и zG оставались соединены с кончиком щипца, в то время как внутренний выделенный железистый материал соответствовал zF и продолговатому мозгу. Ферментативное пищеварение следует начинать только после обработки всех желез (рисунок 1L), из-за механического разделения внешней и внутренней зон.

Пищеварение
Две трубки были маркированы как OF (Внешняя фракция: капсула и zG) или IF (Внутренняя фракция: zF и медулла) (рисунок 1M). Всего было добавлено 4,5 мл предварительно нагретого раствора для пищеварения (37 °C), и OF и IF были переведены в соответствующие трубки. Образцы инкубировали при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂ в течение 30 минут, а пробирки аккуратно прокручивались каждые 10 минут, ручной переворачивая их 2–3 раза для обеспечения равномерного воздействия ферментного раствора. Время, необходимое для пищеварения, может варьироваться в зависимости от качества, активности и условий хранения коллагеназы. Через 30 минут ткань диссоциировались, 40-кратно поднимая и опускаясь медленными, контролируемыми мазками, используя 5 мл серологической пипетки для получения одной клеточной суспензии. После диссоциации ткани, в идеале, не должно оставаться видимых фрагментов, а среда должна выглядеть мутной. Если фрагменты всё ещё присутствуют, можно рассмотреть дополнительное 15-минутное переваривание.

Стирка и покрытие
После переваривания клетки промывали с добавлением 45 мл DMEM/F-12 для удаления остаточного фермента (рисунок 1 M). Образцы центрифугировали при 150 × г в течение 12 минут при комнатной температуре (25 °C). После центрифугирования ожидается небольшая и компактная гранулка с слегка розоватым или бледно-жёлтым оттенком, а надстройка должна оставаться прозрачной и свободной от видимых частиц. Супернатант был аккуратно снят и выброшен, стараясь не потревожить шарик. Пеллет был повторно суспендирован в предварительно нагретой (37 °C) культурной среде в соответствии с окончательным объёмом, необходимым для покрытия (см. ниже). Оптимальная плотность пластины поддерживалась примерно 70% для обеспечения жизнеспособности и силы посева. Количество ячеек оценивалось с помощью камеры для подсчёта Нойбауэра перед нанесением пластины, а количество засеянных ячеек корректировалось в зависимости от площади культивирующей чаши для достижения желаемого слияния. Обогащённые zG-наружными фракционными клетками (OF) плотностью примерно одного животного на скважину (обычно получает ~1,5–2,5 × 104 клеток), а zF-обогащённые внутренние клетки (IF) — по ~0,63 животных на скважину (обычно получая ~2,5–4,0 × 104 клеток) в пластине с 48 колодцами.

Поддержание клеточной культуры
Клетки культивировались в описанной выше культурной среде и содержались в стандартных условиях в увлажнённом инкубаторе при 37 °C с 5% CO₂. После 24 часов посева среду заменяли для удаления мусора и остатков кровяных клеток. Этот этап способствует оптимальному росту. Тарелка была аккуратно аспирирована, добавлена свежая предварительно подогретая (37 °C) среда. Подождите не менее 48 часов, прежде чем оценивать клетки в функциональных экспериментах. Рекомендуется подождать три дня перед проведением функциональных экспериментов, чтобы убедиться, что культуры хорошо закреплены. Расширенная культура после этого периода может потребовать трипсинизации и пассажи, что может привести к отбору клеток и потере первичных характеристик культуры.

Анализ данных и вспомогательные процедуры
Подготовка первичных клеточных культур надпочечников
Первичные культуры целых надпочечников были установлены по тем же процедурам для сбора тканей, пищеварения, промывания и покрытия и использовались в качестве стандартных контролей для молекулярных и функциональных анализов.

Анализ экспрессии генов
Для очистки общей РНК из ОФ- и ИФ-клеток культивированные клетки были гомогенизированы в TRIReagent с помощью РНК-набора согласно протоколу производителя. Целостность и концентрация РНК оценивались с помощью спектрометрии. Дальнейшая обработка полной РНК включала обратную транскрипцию в кДНК с использованием набора для обратной транскрипции с высокой ёмкостью. Анализ экспрессии генов проводился с помощью количественного ПЦР в реальном времени (qPCR) с использованием термоциклера. Технические дубликаты использовались для контроля вариативности. Использовались праймеры TaqMan Universal PCR Master Mix и мыши TaqMan (таблица 1). Значение порога цикла (CT) выбиралось в диапазоне линейного усиления для каждого пробежки в дублирате. Он был нормализован эндогенными контрольными генами β-актином и рибосомным белком 18S (Rps18). Относительные уровни экспрессии рассчитывались с использованием метода 2–ΔΔCt 30. Данные трёх различных экспериментов представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Мы провели три независимых эксперимента.

Стимуляция секреции альдостерона и кортикостерона в первичных культурах ZG и ZF
Первичные культуры клеток zona glomerulosa (ZG) и zona fasciculata (ZF) были установлены и поддержаны при 37 °C в увлажнённой атмосфере с содержанием 5% CO₂. Примерно 5 × 104 ячеек на каждую скважину в пластине на 48 лунок использовали полный ростовой среду. После четырёх дней непрерывной культуры измерения базальной секреции отражали кумулятивное производство гормонов за этот период. Для стимуляционных анализов среду аспирировали, а клетки промывали один раз фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для удаления остаточных факторов. Впоследствии в каждую скважину добавлялось по 200 мкл свежей среды, и следующие анализы показывают острое стимулированное выделение в течение определённого временного окна. Для анализов стимуляции альдостерона культурная среда дополнялась ангиотензином II (Ang II, 10 нМ), калием (K+) в виде хлорида калия (KCl, 10 мМ) и АКТГ (10 нМ). В качестве управления использовался хлорид натрия (NaCl, 10 мм). Для анализов стимуляции кортикостерона применялись те же процедуры, но среда дополнялась ACTH (10 нМ), форсколином (10 мкм) или NaCl (10 мМ) в качестве контроля транспортного средства. После 6 часов инкубации при 37 °C и 5% CO₂ культурные супернатанты собирались и хранили при −80 °C для последующего количественного анализа гормонов, как описаноранее 31. Оставшиеся адгерентные клетки были лизированы для экстракции белка, а уровень гормонов нормализирован до общего содержания белка соответствующего лизата.

Экстракция белка и нормализация измерений альдостерона и кортикостерона
Экстракция белка проводилась с использованием лизиса RIPA и экстракционного буфера, дополненного 1-кратным коктейлем с ингибиторами протеазы стоп-протеаз. Ячейки подвешивались путем 15-кратного подъёма и опускания с помощью наконечника пипетки P200, а затем озвучивались с помощью зондового соникатора. Концентрация белка была определена с помощью белкового теста BCA согласно инструкциям производителя.

Измерение альдостерона с помощью радиоиммунного анализа (RIA)
Концентрация альдостерона в супернатантах клеточной культуры определялась с соблюдением протокола производителя. Вкратце, в пробирки с альдостероновым антителом были добавлены 50 мкл супернатанта и 150 мкл 1% BSA в PBS, а также 500 мкл радиоактивного индикатора альдостерона. После смешивания трубки инкубировали при комнатной температуре (25 °C) в течение 18 часов. Затем инкубационная смесь декантировалась, а радиоактивность в трубках подсчитывалась с помощью автогамма-счётчика CobraII 31. Уровень альдостерона был нормализован до общего белка, как было описано ранее.

Измерение кортикостерона
Концентрации кортикостерона в клеточных культурных супернатантах измерялись с помощью конкурентного ферментно-связанного иммуноанализационного теста (ELISA), специфичного для кортикостерона у мышей и крыс, согласно протоколу производителя. Уровни кортикостерона были нормализованы до общего белка, как описаноранее 32.

Иммунокраска
Иммунофлуоресценция проводилась как на парафиновых надпочечниках, так и на культивированных клетках, выращиваемых на предварительно обработанных стеклянных покрытиях, покрытых поли-L-лизином. Для всех образцов блокировка проводилась 5% нормальной козьей сывороткой (NGS) в PBS, а ядра были контрокрашены DAPI (4′, 6-диамидино-2-фенилиндол, 1:1000). Слайды и накладки были промыты три раза по 5 минут каждая, при этом между этапами инкубации содержали 0,1% Tween-20 в PBS. После окрашивания образцы монтировались с помощью Antifade Mountant и хранили в темноте до проведения визуализации. Срезы ткани: Парафиновые срезы надпочечников были депарафинированы в ксилоле, затем промывались через серию градуированного этанола (100%, 95%, 70%) и, наконец, промывались в PBS. Извлечение антигена проводилось в буфере Tris-EDTA (основание 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, 0,05% Твин-20, pH 9,0) при нагреве при 95 °C в течение 20 минут. После охлаждения до комнатной температуры секции были промыты в PBS и заблокированы 5% NGS в PBS на 1 час. Секции инкубировали ночью при 4 °C с такими первичными антителами, разбавлёнными 1:100 при 5% NGS в PBS: мышиный анти-Dab2, куриный анти-GFP и кролик против RFP. Были использованы следующие вторичные антитела (1:300): Alexa Fluor 594 — против мышей — IgG, Alexa Fluor 594 — против курицы — IgY, и Alexa Fluor 647 — козья IgG.

Культивируемые клетки: иммунофлуоресценция на покрытиях проводилась через четыре дня после нанесения пластин. Клетки фиксировались предварительно нагретым 4% параформальдегидом (PFA) при 37 °C в течение 15 минут и три раза промывались в PBS. Блокировка проводилась с использованием 5% NGS в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Коверслипы инкубировали ночью при 4 °C с помощью анти-Dab2 для мышей (1:100 при 5% NGS/PBS), затем Alexa Fluor 488 козьего противомышиного препарата (1:500).

Получение изображений: Яркие и флуоресцентные изображения (mGFP и mTomato) культивированных клеток были получены с помощью микроскопической системы. Флуоресценция mGFP фиксировалась с помощью фильтра для зелёной флуоресценции (возбуждение: 470 нМ, излучение: 525 нМ), а mTomato флуоресценция — с помощью фильтра, установленного для красной флуоресценции (возбуждение: 585 нМ, излучение: 624 нМ).

Программное обеспечение и статистический анализ
Визуальные сводки, схемы и рисунки были созданы с помощью Adobe Illustrator 2023 (Adobe Inc., https://www.adobe.com/products/illustrator.html) и BioRender (https://www.biorender.com), доступ которого был доступен в мае 2025 года. Данные анализировались с помощью GraphPad Prism версии 10.0. Доступно по адресу: https://www.graphpad.com. Все эксперименты проводились как минимум в трёх экземплярах и независимо повторялись для обеспечения воспроизводимости результатов. Для сравнения между двумя группами использовался t-тест Стьюдента (парный или непарный, по мере необходимости). Для сравнений с участием трёх и более групп проводился анализ дисперсии (ANOVA), а затем соответствующий пост-хок тест для выявления значимых различий между группами. Результаты представлены как среднее ± SD. p-значение менее 0,05 считалось статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Создание и характеристика зонально-обогатённых культур первичных надпочечниковых клеток
Первичные культуры надпочечников были успешно установлены из OF, обогащённых для zG-клеток, и IF, обогащённого для zF-клеток. Репрезентативные изображения культивированных клеток показаны на рисунках 2A (OF–zG) и рисунке 2B (IF–zF). Для оценки обогащения zG-клеток и не-zG-клеток в этих культурах была использована мышиная ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании был представлен усовершенствованный протокол, который генерирует первичные культуры надпочечников мышей, обогащённые для клеток zG (OF) и zF (IF), которые точно передают зональную идентичность и стероидогенную функцию каждой зоны. Этот протокол должен позволить детально изучать клеточную и молекулярную биологию коры надпочечников в зоноспецифическом контексте, поддерживая изучение белков, сигнальных путей и механизмов, участвующих в развитии, дифференцировке, функции ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов, связанных с этим исследованием.

Благодарности

Эта работа была поддержана FAPESP (Научно-исследовательский фонд Сан-Паулу, Бразилия), проект номер 2024/14165–6 (BEPE – JLK), FAPESP: 2020/02988–7 (C.F.P.L), а также поддержкой 2R01DK123694 (для DTB) и средствами отделения эндокринологии Детской больницы Бостона (DTB).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Цилиндрическая пробирка (50 мл )Corning (Corning, NY, США)352070Стерильная
0.22 &микрон Септический фильтрMilliporeSigma (Burlington, MA, США)SLGV033RSФильтрация раствора для расщепления
10 мл одноразовая шприцаBD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, США)300912Стерильная
5 мл серологическая пипеточкаCorning (Corning, NY, США)4487Стерильная
10 мл серологическая пипеточкаCorning (Corning, NY, США)4488Стерильная
Фильтрованные насадки для пипеточек (P200)Axygen (Union City, CA, США)TF-200-R-SСтерильная
Фильтрованные насадки для пипеточек (P1000)Axygen (Union City, CA, США)TF-1000-R-SСтерильная
P60 Культуральный сосудCorning (Corning, NY, США)430166Обработка тканевой культуры
48-лунковый блокCorning (Corning, NY, США)3527Обработка тканевой культуры
Стерильная фильтрующая бумагаN/AN/AУдаление жира и поддержка секционирования
Среда DMEM/F-12Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, США)11320033Формула 1:1
Фетальный бычий сыворотка (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, США)10082147Теплоинактивированный
Дополнение ITSGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, США)41400045100X
Дополнение GlutaMAXGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, США)35050061100X
Пениллин-стрептомицин (100X)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, США)15140122Антибиотик
PBS 1XGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, США)10010023pH 7.4
Коллагеназа типа IGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, США)17100-017Расщепление тканей
DNase ISigma-Aldrich (St. Louis, MO, США)DN25-1Расщепление тканей
Ангиотензин II (Ang II)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, США)A9525Гормональная стимуляция
Адренокортикотропный гормон (ACTH)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, США)A0298Гормональная стимуляция
ФорсколинSigma-Aldrich (St. Louis, MO, США)F6886Стимуляция аденозинмонофосфата
Хлорид калия (KCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, США)P9541Стимуляция альдостерона
Хлорид натрия (NaCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, США)S7653Контроль носителей
Малые хирургические ножницыFine Science Tools (Foster City, CA, США)14060-09Секционирование
Скальпель с одноразовым лезвиемFine Science Tools (Foster City, CA, США)10003-12Микродиссекция
Тонкие щипцыFine Science Tools (Foster City, CA, США)11252-00Секционирование
Изогнутые щипцыFine Science Tools (Foster City, CA, США)11251-10Секционирование
Ламинарный обтекательный капотThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, США)N/AСтерильная обработка тканей
ИнкубаторThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, США)N/AКультура клеток
ЦентрифугаEppendorf (Гамбург, Германия)N/AОсаждение клеток
Счетная камера НойбауэраHausser Scientific (Horsham, PA, США)1490Подсчет клеток
Буфер RIPA для лизиса и экстракцииThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, США)89901Экстракция белков
Коктейль ингибиторов протеаз HaltThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, США)87786Экстракция белков
Ультразвуковой дезинтегратор Fisherbrand Model 120Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, США)FB120Ультразвуковая обработка
Система RIATecan (Männedorf, Швейцария)MG13051Количественное определение гормонов
Автоматический гамма-счетчик Cobra IIBerthold Technologies (Bad Wildbad, Германия)N/AИзмерение радиоактивности
Набор для ЭЛИСА кортизол (96-лунковый)Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, США)55-CORMS-E01Измерение гормонов
Монтажное средство ProLong Gold AntifadeThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, США)P36930Монтажное средство
Мышье анти-Dab2BD Biosciences (San Jose, CA, США)610464Первичное антитело
Куриное анти-GFPAves Labs (Tigard, OR, США)GFP-1020Первичное антитело
Кроличное анти-RFPRockland Immunochemicals (Lim

Ссылки

  1. Zelander, T. The ultrastructure of the adrenal cortex of the mouse. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 46 (6), 710-716 (1957).
  2. Nishimoto, K., et al. Adrenocortical zonation in humans under normal and pathological conditions. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95 (5), 2296-2305 (2010).
  3. Freedman, B. D., et al. Adrenocortical zonation results from lineage conversion of differentiated zona glomerulosa cells. Dev. Cell. 26 (6), 666-673 (2013).
  4. Leng, S., Carlone, D. L., Guagliardo, N. A., Barrett, P. Q., Breault, D. T. Rosette morphology in zona glomerulosa formation and function. Mol. Cell. Endocrinol. 530, 111287(2021).
  5. Gwynne, J. T., Strauss, J. F. The role of lipoproteins in steroidogenesis and cholesterol metabolism in steroidogenic glands. Endocr. Rev. 3 (3), 299-329 (1982).
  6. Zhu, Y., Zhang, X., Hu, C. Structure of rosettes in the zona glomerulosa of human adrenal cortex. J. Anat. 243 (4), 684-689 (2023).
  7. Leng, S., et al. β-Catenin and FGFR2 regulate postnatal rosette-based adrenocortical morphogenesis. Nat. Commun. 11 (1), 1680(2020).
  8. Rainey, W. E. Adrenal zonation: clues from 11β-hydroxylase and aldosterone synthase. Mol. Cell. Endocrinol. 151 (1-2), 151-160 (1999).
  9. Rebuffé-Scrive, M., Krotkiewski, M., Elfversson, J., Björntorp, P. Muscle and adipose tissue morphology and metabolism in Cushing’s syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 67 (6), 1122-1128 (1988).
  10. Luo, X., Ikeda, Y., Parker, K. L. A cell-specific nuclear receptor is essential for adrenal and gonadal development and sexual differentiation. Cel. l. 77 (4), 481-490 (1994).
  11. Huang, C. C. J., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. C. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by Sonic Hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
  12. King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 106 (50), 21185-21190 (2009).
  13. Ching, S., Vilain, E. Targeted disruption of Sonic Hedgehog in the mouse adrenal leads to adrenocortical hypoplasia. Genesis. 47 (9), 628-637 (2009).
  14. Kim, A. C., et al. Targeted disruption of β-catenin in Sf1-expressing cells impairs development and maintenance of the adrenal cortex. Development. 135 (15), 2593-2602 (2008).
  15. Berthon, A., et al. Constitutive β-catenin activation induces adrenal hyperplasia and promotes adrenal cancer development. Hum. Mol. Genet. 19 (8), 1561-1576 (2010).
  16. Basham, K. J., et al. A ZNRF3-dependent Wnt/β-catenin signaling gradient is required for adrenal homeostasis. Genes Dev. 33 (3-4), 209-220 (2019).
  17. Finco, I., Lerario, A. M., Hammer, G. D. Sonic Hedgehog and WNT signaling promote adrenal gland regeneration in male mice. Endocrinology. 159 (2), 579-596 (2018).
  18. Heikkilä, M., et al. Wnt-4 deficiency alters mouse adrenal cortex function, reducing aldosterone production. Endocrinology. 143 (11), 4358-4365 (2002).
  19. Drelon, C., et al. PKA inhibits WNT signalling in adrenal cortex zonation and prevents malignant tumour development. Nat. Commun. 7 (1), 12751(2016).
  20. Heaton, J. H., et al. Progression to adrenocortical tumorigenesis in mice and humans through insulin-like growth factor 2 and β-catenin. Am. J. Pathol. 181 (3), 1017-1033 (2012).
  21. Borges, K. S., et al. Wnt/β-catenin activation cooperates with loss of p53 to cause adrenocortical carcinoma in mice. Oncogene. 39 (30), 5282-5291 (2020).
  22. Borges, K. S., et al. Non-canonical Wnt signaling triggered by WNT2B drives adrenal aldosterone production. bioRxiv. , (2024).
  23. Sasano, H. Cell proliferation and apoptosis in normal and pathologic human adrenal. Mod. Pathol. 8 (1), 11-17 (1995).
  24. Chang, S. P., Morrison, H. D., Nilsson, F., Kenyon, C. J., West, J. D., et al. Cell proliferation, movement, and differentiation during maintenance of the adult mouse adrenal cortex. PLoS One. 8 (12), e81865(2013).
  25. Mitani, F. Functional zonation of the rat adrenal cortex: the development and maintenance. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, 90 (5), 163-183 (2014).
  26. Dinh, H. A., Volkert, M., Secener, A. K., Scholl, U. I., Stölting, G. T- and L-type calcium channels maintain calcium oscillations in the murine zona glomerulosa. Hypertension. 81 (4), 811-822 (2024).
  27. Penton, D., et al. Task3 potassium channel gene invalidation causes low renin and salt-sensitive arterial hypertension. Endocrinology. 153 (10), 4740-4748 (2012).
  28. Mattos, G. E., Lotfi, C. F. P. Differences between the growth regulatory pathways in primary rat adrenal cells and mouse tumor cell line. Mol. Cell. Endocrinol. 245 (1-2), 31-42 (2005).
  29. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  30. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  31. Berber, M., et al. Rho/ROCK signaling and α-catenin mediate β-catenin-driven hyperplasia in the adrenal cortex via adherens junctions. J. Clin. Invest. , (2026).
  32. Smith, T. T. G., et al. Forced treadmill running reduces systemic inflammation yet worsens upper limb discomfort in a rat model of work-related musculoskeletal disorders. BMC Musculoskelet. Disord. 21 (1), 57(2020).
  33. Kremer, J. L., et al. Extracellular matrix protein signatures of the outer and inner zones of the rat adrenal cortex. J. Proteome Res. 23 (8), 3418-3432 (2024).
  34. Pignatti, E., Leng, S., Carlone, D. L., Breault, D. T. Regulation of zonation and homeostasis in the adrenal cortex. Mol. Cell. Endocrinol. 441, 146-155 (2017).
  35. Pignatti, E., et al. Beta-catenin causes adrenal hyperplasia by blocking zonal transdifferentiation. Cell Rep. 31 (3), 107524(2020).
  36. Romero, D. G., et al. Disabled-2 is expressed in the adrenal zona glomerulosa and is involved in aldosterone secretion. Endocrinology. 148 (6), 2644-2652 (2007).
  37. Sahut-Barnola, I., Lefrancois-Martinez, A. M., Jean, C., Veyssiere, G., Martinez, A. Adrenal tumorigenesis targeted by the corticotropin-regulated promoter of the aldo-keto reductase AKR1B7 gene in transgenic mice. Endocr. Res. 26 (4), 885-898 (2000).
  38. Vidal, V., et al. The adrenal capsule is a signaling center controlling cell renewal and zonation through Rspo3. Genes Dev. 30 (12), 1389-1394 (2016).
  39. Dörner, J., et al. GLI1+ progenitor cells in the adrenal capsule of the adult mouse give rise to heterotopic gonadal-like tissue. Mol. Cell. Endocrinol. 441, 164-175 (2017).
  40. Guo, Y., et al. 3D culture system for human adrenal glands that uses a sequential processing medium to facilitate cortical-medullary cell development. Clin. Lab. 70 (12), (2024).
  41. Friedrich, L., Schuster, M., Rubin de Celis, M. F., Berger, I., Bornstein, S. R., et al. Isolation and in vitro cultivation of adrenal cells from mice. STAR Protoc. 2 (4), 100999(2021).
  42. Mattos, G. E., Jacysyn, J. F., Amarante-Mendes, G. P., Lotfi, C. F. P. Comparative effect of FGF2, synthetic peptides 1–28 N-POMC and ACTH on proliferation in rat adrenal cell primary cultures. Cell Tissue Res. 345 (3), 343-356 (2011).
  43. Gazdar, A. F., et al. Establishment and characterization of a human adrenocortical carcinoma cell line that expresses multiple pathways of steroid biosynthesis. Cancer Res. 50 (17), 5488-5496 (1990).
  44. Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Mol. Cell. Endocrinol. 351 (1), 58-65 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Wnt

Похожие статьи