Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Новая безсывороточная 2D и 3D система культуры, состоящая из двух малых молекул для культивирования эпителиальных клеток слёзных желез мышей

257 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70438

⸱

10 февраля 2026 г.

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Optometry Center, China-Japan Union Hospital of Jilin University, 2Eye Institute & Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University, 3Huaxia Eye Hospital of Quanzhou, 4Shen Zhen Research Institute of Xiamen University

В этой статье

Краткое содержание

Внедряется новая система культуры без сыворотки с использованием комбинации малых молекул 2C (Y27632 и SB431542) для эффективного расширения эпителиальных клеток слёзных желез (LGEC) как в 2D, так и в 3D культурах, что позволяет точно контролировать их пролиферацию и дифференциацию.

Аннотация

Дисфункция слёзных желез (LG) является основной причиной водно-дефицитной сухости глаз, и клеточные и тканевые инженерные терапии демонстрируют значительный потенциал для этого состояния. Однако ограниченная доступность достаточного количества семенных клеток, культивируемых в условиях без сыворотки, затрудняет их широкое применение. В этом исследовании мы разработали новую систему культуры без сыворотки с использованием двух малых молекул — Y27632 и SB431542 (2C) — для эффективного расширения эпителиальных клеток LG (LGEC). Для 2D первичной культуры LGEC LG были выделены из мышей возрастом 6-8 недель и ферментативно переварены с помощью Dispase II и коллагеназы A. Полученная клетка суспензия была засеяна в культивные чаши с плотностью 7 500 клеток/см² и культивировалась с 2C в течение 12–14 дней. Когда слияние клеток достигало 80-90%, субкультура начиналась в соотношении 1:2. Для 3D-культуры 10 000 ЛГЭК P1 были ресуспендированы в 10 мкл 2C и 10 мкл матричного геля, затем засеяны в центре пластины с 24 лунками. После 30-минутного периода затвердевания при 37 °C было добавлено 600 мкл 2C для продолжения культуры. Для дифференцировки трёхмерные сфероиды культивировали с 2C в течение 7 дней, после чего 2C удаляли и продолжали культуру ещё 7 дней. LGEC, культивируемые с 2C, демонстрировали высокую пролиферацию, повышенную экспрессию маркеров ствола и пролиферации (Ki67, K14, P63, K5, K15 [P = 0.0011, 0.0002, 0.0012, 0.0003, 0.0014 соответственно]), а также сохраняли морфологию и пролиферационную способность даже после десяти проходов. Кроме того, в трёхмерных условиях LGEC формировали сфероиды со стволовыми характеристиками и предками, которые далее дифференцировались в микрожелезистые структуры, содержащие несколько типов клеток LG (AQP5, K19, α-SMA-положительные) и зрелые секреторные функции после удаления 2C. Ожидается, что этот подход обеспечит стабильный источник семенных клеток для тканевой инженерии и предлагает новую in vitro модель для изучения физиологии LG.

Введение

Слезная железа (ЛГ) необходима для образования водного слоя слёзной плёнки, что имеет решающее значение для поддержания гомеостаза глазнойповерхности 1. Дисфункция LG, вызванная травмой или воспалением, приводит к заболеванию сухости глаз с дефицитом воды (ADDE). Это состояние может привести к сильному воспалению поверхности глаза, хроническому заболеванию роговицы и, в тяжёлых случаях, к постоянной потерезрения 2. Современные методы лечения АДДЕ в основном направлены на лечение симптомов, не учитывая основную железистую дисфункцию, которая ограничивает их долгосрочнуюэффективность 1. Разработка таргетных терапий для дисфункции LG представляет ряд вызовов, включая отсутствие долгосрочных простых in vitro моделей, которые ограничивают понимание патофизиологии LG и препятствуют разработке эффективных методов терапии. Хотя трансплантация клеток показала потенциал для стимулирования регенерации LG, ограниченная способность клеток in vitro и сложность существующих систем культуры создают значительные препятствия для клиническогоприменения 1,3. Поэтому создание простой, долгосрочной системы культурирования взрослых мышей LG крайне важно для продвижения понимания физиологии и патологии LG, а также для обеспечения надёжного источника стволовых и предшественников LG для восстановления и регенерации травм LG.

Существующие системы культуры in vitro для LG добились значительного прогресса, но всё ещё сталкиваются с заметными ограничениями. Многие из этих методов основаны на среде, добавленном сывороткой, что вводит ряд проблем, таких как вариабельность от партии к партии, неопределённые компоненты и риск загрязнения фибробластами или мезенхимальныхклеток 4,5,6,7,8. Кроме того, системы на основе сыворотки неподходят для изучения патогенных механизмов заболеваний ЛГ и создают трудности для терапии трансплантацией клеток из-за потенциального риска отторженияиммунной системы 9. В ответ на эти ограничения были разработаны несколько методов без сыворотки для культивирования эпителиальных клеток LG (LGEC) как у мышей, так и у человека. Например, Уэда и соавторы успешно применили метод без сыворотки для культивирования LGEC из новорождённыхмышей 10. Однако этот метод был ограничен неспособностью пропускать клетки через субкультуры и необходимостью большого количества неонатальных желез для получения достаточного количества LGEC. Аналогично, Кобаяши и др. разработали систему культуры без сыворотки с холерным токсином, но столкнулись с трудностями в поддержании клеточной морфологии в11-м отрывке. Недавние достижения включают разработку 3D-системы культивирования стволовых клеток LG мышей и системы органоидных культур LG Баннье-Элауэт и др. 12,13,14,15. Однако эти системы опираются на сложные формулы среды с множеством мелких молекул, факторов роста и добавок, что усложняет процесс культивирования и ограничивает масштабируемость. Эти проблемы подчёркивают необходимость упрощённой, эффективной системы культуры без сыворотки, которая способствует эффективному расширению LGEC, сохраняя при этом их пролиферативные и ствол/предшественники характеристики для дальнейших терапевтических применений и исследований.

В последние годы быстрое развитие химического перепрограммирования, опосредованного малыми молекулами, ввело новые стратегии поддержания и расширения первичных взрослых клеток in vitro16. Регулируя внутриклеточные сигнальные пути, взаимодействия между клеточными матрицами и клеточную адгезию, малые молекулы значительно усиливают пролиферацию и пластичность клеток, повышая эффективность расширения клетки и контрольсудьбы 17. Благодаря контролируемому производству, низкой иммуногенности и негеномной интеграции, малые молекулы идеально подходят для создания in vitro систем расширения эпителиальных клетоквзрослой взрослой 16. Комбинации различных малых молекул доказали эффективное поддержание экспансии in vitro различных типов первичных клеток, включая кожные, роговицы и конъюнктивальные эпителиальныестволовые клетки 18,19,20. Таким образом, разработка стратегии расширения LGEC на основе малых молекул показывает потенциал для будущих применений как в научных, так и в терапевтических условиях.

В этом протоколе была разработана простая и эффективная система культуры без сыворотки с использованием двух малых молекул — Y27632 и SB431542 (2C) — для поддержки расширения LGEC. Объединив преимущества этих двух молекул, была создана система, свободная от сыворотки, как для 2D, так и для 3D-культур. LGEC, культивируемые с использованием 2C, демонстрировали высокую пролиферативную способность и характеристики ствол/прогениторных клеток, сохраняя типичную морфологию эпителиальных клеток как минимум после 10 проходов in vitro. В 3D-культуре LGEC не только сохраняли характеристики стволовых и прогениторных клеток, но и проявляли способность дальнейшей дифференцировки в секреторные структуры после удаления 2C, формируя микрожелезистые структуры с секреторной функцией. Эта система без сыворотки подходит для in vitro моделей физиологии и патологии LG, а также обеспечивает значительный источник клеток для тканевой инженерии LG и регенеративных приложений. Однако настоящий протокол предоставляет лишь предварительное исследование 3D-культуры. Долгосрочная 3D-культура на данном этапе выходит за рамки этих исследований. Важно отметить, что этот метод разработан специально для взрослых мышей-LGEC и может быть неприменим к другим видам без дополнительной оптимизации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с правилами Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) и Комитета по этике экспериментальных животных Университета Цзилинь и Сямэньского университета.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры по культивированию клеток проводились в биобезопасном шкафе с ультрафиолетом в операционной комнате клеток.

1. Первичная культура LGEC

  1. Выделение ткани LG
    1. Усыпить анестезированных мышей C57BL/6J (6-8 недель) путем вывиха шейки матки и продезинфицировать область уха (вокруг LG) 75% этанолом, чтобы избежать загрязнения.
    2. Сделайте разрез от внешнего кантуса к коже под ухом, чтобы обнажить LG. Используя стерильные гладкие щипцы и ножницы, аккуратно отделите LG от окружающей ткани (околоушных желез и соединительной ткани) под диссекционным микроскопом, чтобы получить LG.
    3. Поместите LG в предварительно охлаждённую тканевую среду (DMEM с 10% пенициллина-стрептомицина-амфотерицина) в микроцентрифугной трубке объемом 1,5 мл, сохраняя ткань на льду для минимизации разрушения.
  2. Подготовка тканей
    1. Переместите LG в новую холодную тканевую среду в чашке диаметром 3,5 см.
    2. Удалите остатки мышиной шерсти, затем отлепите соединительную капсулу, окружающую LGs. Изолируйте железистую ткань, используя гладкие щипцы, чтобы удалить соединительную ткань между дольками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что капсула на поверхности LG и соединительная ткань между дольками тщательно удалены, чтобы открыть протоки между долями, что облегчит проникновение раствора для пищеварения во время последующей процесса пищеварения.
    3. Перенесите ткань в новую среду для сбора и промывайте 5-10 минут, чтобы предотвратить загрязнение.
  3. Ферментативное пищеварение
    1. Поместите LG в микроцентрифуговую трубку объемом 1,5 мл с раствором для пищеварения (среда без сыворотки, дополненная 2 мг/мл Dispase II и 2 мг/мл Collagenasa A). (Дополнительная таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: для 4 LG требуется 1 мл раствора для пищеварения.
    2. Тонко расчленить ткань LG с помощью микроножниц на небольшие куски (примерно 0,5–1 мм³) внутри трубки.
    3. Инкубировать микроцентрифугную трубку при 37 °C с 5%CO2 в течение 2,5–3 часа. Каждые 30-60 минут аккуратно перемешивайте ткани в растворе для пищеварения, чтобы обеспечить тщательное ферментное пищеварение.
  4. Изоляция и сбор урожая LGEC
    1. После завершения пищеварения несколько раз встряхните микроцентрифугную трубку. Несколько раз пипетируйте раствор для пищеварения, чтобы разбить ткань на отдельные клетки или мелкиклеточные сгустки. Наблюдайте под микроскопом, чтобы подтвердить ход пищеварения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда в растворе пищения не остаётся видимых частиц и под микроскопом наблюдается большое количество отдельных клеток, а также агрегатов, похожих на протоковые клетки, процесс переваривания останавливается.
    2. Центрифугуйте трубку при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, затем сбросьте дивариальную среду.
    3. Суспензировать клеточную гранулу в 1 мл стерильного DPBS и снова центрифугировать при 1000 x g на 3 минуты при комнатной температуре, чтобы удалить оставшиеся пищеварительные ферменты.
    4. Повторите шаг 1.4.3: удалите супернатант и снова суспензуйте клеточную гранулу в 500 мкл среды без сыворотки.
  5. Посева LGEC и первичная культура
    1. Подготовьте культурную среду LGEC, дополнив безсывороточную среду 1% пенициллин-стрептомицином и 2C (10 мкм Y27632 и 10 мкм SB431542). (Дополнительная таблица 1)
    2. Засеять клетки в стандартные, необработанные 24-колодцевые культивированные пластины плотностью 7,5 x 10³ клеток/см² с использованием безсывороточной среды 2C.
    3. После посева аккуратно постукуйте по краям посевной пластины, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Поставьте пластину в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2.
    4. Впервые меняйте посевную среду через 72 часа после посева. После этого меняйте среду каждые 2-3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не нарушайте культуру в первые 72 часа. При первой замене среды не промывайте клетки DPBS. Просто уберите старый медиум и добавьте свежий.

2. Субкультурирование LGEC

ПРИМЕЧАНИЕ: Субкультура, когда слияние клеток достигает 80-90%, что обычно происходит примерно через 14 дней после первичной культуры.

  1. Снимите культурную среду и аккуратно промыйте клетки дважды стерильным DPBS.
  2. Добавьте 250 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубуйте при 37 °C с 5%CO2 в течение 10-15 минут. Когда узкие соединения диссоциируют и клетки округляются, добавьте равный объём определённого раствора ингибитора трипсина, чтобы прекратить пищеварение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если при первичной культуре наблюдаются плоские и крупные клеточные клетки, обрабатывайте культуру трипсинов-ЭДТА 0,25% в течение 5 минут для удаления этих гетерогенных клеток. Затем снова обработайте культуру с 0,25% трипсина-ЭДТА в течение дополнительного 5 минут для дальнейшего переваривания и получения более чистой популяции LGEC для последующего прохождения.
  3. Перемешайте суспензию ячейки с помощью пипетки объёмом 1 мл, затем переведите в центрифугу на 1,5 мл и центрифугуйте при 1000 x g в течение 3 минут при комнатной температуре. Отбросьте супернатант.
  4. Промыйте клетки стерильными DPBS и снова центрифугуйте для сбора LGEC.
  5. Ресуспензировать LGEC в культурной среде 2C и семя в соотношении 1:2 для субкультуры. Аккуратно перемешайте клетки, встряхивая посевную пластину, и инкубуйте при 37 °C с 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Субкультурирование в соотношении 1:2 означает, что когда слияние клеток достигает 80-90%, LGEC расщепляются из одной пластины скважины и равномерно распределяются по двум новым пластинам.
  6. Меняйте среду на третий день после посева, а затем меняйте её каждые 2-3 дня, в зависимости от состояния клетки.
  7. Ежедневно наблюдайте морфологию клеток под инвертированным фазовым микроскопом и документируйте с помощью фотографий.

3. Трёхмерная (3D) культура LGEC

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент с 3D-культурой использует PGEC P1. Когда P1 LGEC достигают слияния 80-90% после 7 дней культуры с 2C, их используют для 3D-культуры.

  1. Этапы подготовки
    1. Перенесите матричный гель (дополнительная таблица 1) из морозильника при температуре -20 °C в холодильник при 4 °C для ночного размораживания.
    2. Поместите необходимые наконечники пипетки в морозильник при температуре -20 °C для правильного предварительного охлаждения.
    3. Предварительно разогрейте 24-колодную культурную пластину, поместив её в инкубатор с 37 °C и 5%CO2 за 2 часа перед началом 3D-культуры.
    4. Подготовьте ледник и поставьте в него несколько микроцентрифугных трубок объемом 1,5 мл для предварительного охлаждения. Перед использованием простерилизуйте холодильник в шкафу с биобезопасностью.
  2. 3D-культура LGEC
    1. Получите P1 LGEC, как описано в шагах 2.1–2.4.
    2. Суспензировать клеточную гранулу в культурной среде 2C и отрегулировать плотность клеток до 1 × 10⁴ клеток на 10 мкл.
    3. Возьмите размороженный матричный гель из холодильника при температуре 4 °C и предварительно охлаждённые наконечники пипетки из морозильника при -20 °C и положите их в холодильник внутри биобезопасности.
    4. Снимите предварительно нагретую 24-колодную культивационную пластину из инкубатора и поставьте её в шкаф с биобезопасностью.
    5. Добавьте соответствующий объём суспензии ячейки, смешанную с матричным гелем в соотношении 1:1, используя предварительно охлаждённые наконечники пипетки. Аккуратно перемешивайте, чтобы равномерно распределяться.
    6. Пипетте 20 мкл смеси с шага 3.2.5 аккуратно в центр каждой ямы предварительно нагретой пластины на 24 лунки.
    7. Инвертируйте пластину и инкубуйте её в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 в течение 30 минут, чтобы матричный гель затвердел.
    8. После затвердевания матричного геля добавьте в каждую скважину 600 мкл культурной среды 2C.
    9. Инкубировать посевную тарелку в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 в течение 14 дней. Меняйте среду на третий день после посева и каждые 2-3 дня после этого, в зависимости от состояния клетки.
    10. Ежедневно наблюдайте формирование 3D-сфероидов под микроскопом с инвертированным фазовым контрастом и делайте снимки для документирования.
  3. Дифференцировка 3D-сфероидов LGEC
    1. Культура 3D сфероидов LGEC, как описано в шаге 3.2.
    2. После 7 дней посева удалите посевную среду 2C и аккуратно промывайте клетки дважды DPBS, чтобы удалить остатки 2C. Будьте осторожны, чтобы не потревожить матричный гель.
    3. Добавьте среду без сыворотки без 2C (Null) и продолжайте культуру ещё 7 дней для стимуляции дифференцировки.
    4. Меняйте среду каждые 2-3 дня в период культуры.
    5. Ежедневно наблюдайте морфологические изменения индуцированных 3D-сфероидов под микроскопом с инвертированным фазовым контрастом и делайте снимки для документирования.

4. Вложение и замороженное сечение дифференцированных 3D сфероидов LGEC

ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференцировка трёхмерных сфероидов индуцируется как описано в разделе 3.3. После 7 дней дифференцировки следуйте следующим шагам для оптимальной температуры резки (OCT) и замороженной секции дифференцированных трёхмерных сфероидов.

  1. Аспирируйте культурную среду по краям колодца. Аккуратно промой дифференцированные сфероиды три раза стерильным DPBS.
  2. Добавьте 1 мл 4% параформальдегида (PFA) в скважину в биобезопасный шкаф или вытяжку и закрепите сфероиды при комнатной температуре на 10 минут.
  3. Аккуратно промыйте сфероиды три раза стерильным DPBS, каждое промывка длится 10 минут, чтобы снять фиксатор.
  4. Используйте лопатку, чтобы аккуратно соскрести 3D-сфероидно-матричную гелевую структуру и перенесите её в микроцентрифугную трубку объемом 5 мл с раствором сахарозы 20%.
  5. Инкубировать трубку на ночь при 4 °C, пока купольная конструкция не оседает на дне трубки.
  6. Удалите куполообразную структуру из раствора сахарозы, аккуратно удалите остатки сахарозы и внедрите их в состав OCT. Заморозьте в жидком азоте и храните при -80 °C.
  7. Перед окрашиванием подготовьте участки толщиной 10 мкм с помощью замораживающего микротома.

5. Обнаружение секреционных функций дифференцированных 3D сфероидов LGEC

  1. Сбор образцов
    1. Индуцировать дифференцировку трёхмерных сфероидов, как описано в разделе 3.3.
    2. После 7 дней дифференцировки удалите посевную среду и трижды промывайте 3D-сфероиды DPBS.
    3. Добавьте 500 мкл безсывороточной среды без 2C и инкубировать при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 часа.
    4. Соберите посевную среду и переместите её в микроцентрифугную пробирку объёмом 1,5 мл в качестве исходного образца для измерения концентрации лактоферрина (LTF) перед стимуляцией пилокарпина.
    5. Аккуратно промой 3D-сфероиды три раза стерильными DPBS.
    6. Добавьте 500 мкл безсывороточной среды, содержащей 1 мкг/мл пилокарпина, и инкубируйте 3D сфероиды при 37 °C с 5% CO2 в течение 24 часов.
    7. После инкубации соберите культурную среду в микроцентрифужную трубку объёмом 1,5 мл (для измерения концентрации LTF после стимуляции пилокарпина).
    8. Центрифугуйте образцы собранной культурной среды при 4 °C при 1000 × г в течение 20 минут. Соберите супернатант и храните его при -80 °C для дальнейшего использования.
  2. Разбавление образца
    1. Возьмите образцы из морозильника при температуре -80 °C и дайте им полностью разтаять при комнатной температуре.
    2. Возьмите 5 мкл образца и разведите его 495 мкл буфера разбавления образца из набора для ферментно-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA), чтобы получить 100-кратное разбавление.
  3. Подготовка реагентов
    1. Все реагенты из комплекта ELISA доведите до комнатной температуры за 20 минут до использования.
    2. Подготовьте промывочный буфер: рассчитайте необходимое количество образцов на основе количества образцов и разведите концентрированный буфер для промывания дистиллированной водой (1:24).
    3. Подготовьте стандартное рабочее решение:
      1. Центрифугуйте лиофилизированный стандарт при 10 000 × г в течение 1 минуты. Добавьте 1 мл стандартного и образцового разбавителя, дайте постоять 10 минут и несколько раз аккуратно инвертируйте.
      2. После полного растворения тщательно перемешайте пипеткой. Это восстановление даёт рабочее решение на уровне 2000 пг/мл.
    4. Проводите последовательные разведения в соответствии с инструкциями комплекта, чтобы получить следующий стандартный градиент концентрации: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 0 пг/мл.
    5. Приготовьте рабочий раствор для биотинилированного обнаружения антител:
      1. Рассчитайте необходимый объём для анализа (50 мкл/скважину). Центрифугуйте концентрированное биотинилированное детекционное антитело в 800 × г в течение 1 минуты, затем разведите концентрированное 50× биотинилированное детекционное антитело до рабочего раствора 1× с помощью разбавления биотинилированных детекционных антител.
      2. Приготовьте раствор непосредственно перед использованием, делая немного больше рассчитанного количества, обычно добавляя на 100–200 мкл больше, чем нужно.
    6. Приготовьте рабочее раствор с пероксидазой хрена (HRP):
      1. Рассчитайте необходимый объём для эксперимента (50 мкл/скважину). Центрифугуйте концентрированный HRP-конъюгат при 800 × г в течение 1 минуты, затем разведите до рабочей концентрации 1x с помощью сопряжённого разбавления HRP.
      2. Приготовьте раствор непосредственно перед использованием, делая немного больше рассчитанного количества, обычно добавляя на 100–200 мкл больше, чем нужно.
  4. Процедура анализа ИФП
    1. Определите скважины для разбавлённого стандарта, бланка и образцов, с 3 репликами для каждой. Добавьте 25 мкл стандартного рабочего раствора, пустого или разбавлённого образца в соответствующие скважины. Накройте пластину герметиком из комплекта и инкубуйте при 37 °C в течение 90 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы следует добавлять на дно микро-пластины ELISA. Избегайте касаться внутренней стенки и не вызывать пену как можно больше.
    2. Выведите жидкость из колодцев без промывки. Немедленно добавьте в каждую скважину 50 мкл рабочего раствора биотинилированного обнаружения антител. Накройте пластину новым герметиком и инкубуйте при 37 °C в течение 60 минут.
    3. Спустите жидкость из скважин и добавьте в каждую скважину 350 мкл подготовленного буфера для промывки. Замочите на 1 минуту, затем аспирируйте или декантуйте жидкость из каждой колодцы и вытирайте чистой впитывающей бумагой. Повторите этот этап стирки три раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте колодцам высыхать во время промывки.
    4. Добавьте в каждую скважину 50 мкл подготовленного сопряжённого рабочего раствора HRP. Накройте тарелку новым герметиком и инкубуйте при 37 °C в течение 30 минут.
    5. Декантировать жидкость из скважин и повторить процесс промывания пять раз с буфером для промывания, как описано в шаге 5.4.3.
    6. Добавьте в каждую скважину 50 мкл субстратного реагента. Накройте тарелку новым герметиком и инкубуйте при 37 °C в темноте 15 минут.
    7. Добавьте 25 мкл стоп-раствора в каждую яму, чтобы завершить реакцию. Убедитесь, что стоп-раствор добавлен в том же порядке, что и раствор с подложкой.
    8. Определите оптическую плотность (значение OD) каждой ямы непосредственно на 450 нм с помощью считывателя микропластин.

6. Изоляция РНК

  1. Сбор образцов
    1. Для ткани LG
      1. Изолировать экстраорбитальную ткань LG у взрослых мышей, как описано в разделах 1.1.2-1.1.2.
      2. Погрузите только что изолированную ткань LG в PBS, чтобы смыть всю кровь.
      3. Промокните поверхностную влагу LG фильтрующей бумагой и поместите ткань в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл с 1 мл реагента для экстракции РНК (дополнительная таблица 1), сохраняя пробирку в состоянии льда.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Перед экстракцией РНК выполните этапы помолота, чтобы обеспечить полный лиз ткани.
      4. Добавьте две чистые стальные шлифовальные шарики в трубку микроцентрифуги, затем поместите трубку в предварительно охлаждённую высокоскоростную низкотемпературную шлифовальную машину.
      5. Задайте параметры кофемолки: частоту 70 Гц, время помола 45 с, время паузы 15 с и повторяйте 10 циклов. Затяните ручку крышки кофемолки и начинайте шлифовать.
      6. Поместите трубку на лёд или храните при -80 °C для последующего извлечения РНК после завершения процесса помола.
    2. Для LGEC
      1. Удалите культурную среду и трижды промывайте клетки стерильным DPBS, когда LGEC достигнут слияния 80-90%.
      2. Добавьте 600 мкл реагента для экстракции РНК в каждую скважину (для пластины с 24 лунками) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5–10 минут.
      3. Используйте пипетку объемом 1 мл для многократного пипетирования раствора реагента для экстракции РНК в каждой яме, чтобы обеспечить полный лизис клетки.
      4. Переложите раствор в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
      5. Поместите трубку на лёд или храните при -80 °C для последующего извлечения РНК.
    3. Для 3D сфероидов LGEC
      1. Собирайте недифференцированные и дифференцированные 3D сфероиды LGEC, культивируемые в течение 14 дней, как описано в шагах 3.2-3.3. Добавьте по 1 мл раствора для расщепления (среда без сыворотки с 1 мг/мл Dispase II) в каждую яму, обеспечивая полное покрытие 3D сфероидно-матричной гелеобразной структуры. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 в течение 30 минут.
      2. Переместить раствор для расщепления с 3D-сфероидами в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл с помощью пипетки объемом 1 мл. Центрифуга при 1000 × г в течение 3 минут для сбора сфероидной гранулы.
      3. Промой гранулу 1 мл DPBS и центрифугой при 1000 × г в течение 3 минут, чтобы снова собрать гранулу.
      4. Добавьте 600 мкл реагента для экстракции РНК (на 20 мкл матричного геля) и инкубировать при комнатной температуре в течение 5-10 минут.
      5. Тщательно перемешайте с помощью пипетки объёмом 1 мл, чтобы обеспечить полный лизис 3D-сфероидов.
      6. Поместите трубку на лёд или храните при -80 °C для последующего извлечения РНК.
  2. Экстракция РНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Носите соответствующие средства индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки, маску) и выполняйте все процедуры, связанные с хлороформом и изопропанолом, в вытяжке. Утилизировать потоки химических отходов в специально отведённые контейнеры с маркировкой для генерации опасных отходов, соблюдая институциональные протоколы утилизации отходов.
    1. Добавьте хлороформ (1/5 объёма реагента для экстракции РНК) в пробирку центрифуга, содержащую образец РНК в реагенте для экстракции РНК (начиная с шага 6.1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите процедуру в вытяжке с дымом.
    2. Тщательно перемешайте с помощью вихря и инкубуйте при комнатной температуре 10 минут до фазового разделения.
    3. Центрифуга при 14 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования жидкость разделяется на три слоя, при этом РНК находится в верхней прозрачной водной фазе.
    4. Подготовьте новую центрифугную трубку без РНазы объемом 1,5 мл и добавьте изопропанол (половину объёма реагента для экстракции РНК) в выхлопчик.
    5. Осторожно вставляйте верхнюю прозрачную водную фазу (половину объёма реагента для экстракции РНК) в новую пробирку без РНаз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не загрязнить средний слой при пипетировании.
    6. Переверните трубку несколько раз, чтобы перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем снова центрифугировать при 14 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
    7. Сбросьте супернатант и добавьте 500 мкл этанола 75% для промывки гранулы путём инвертирования трубки. Снова центрифугуйте при 14 000 x g в течение 5 минут при 4 °C.
    8. Повторите шаг 6.2.7. Сбросьте супернатант и проведите быструю центрифугировку, чтобы удалить остатки жидкости.
    9. Положите трубку на лёд в вытяжку, откройте крышку и дайте ей высохнуть на воздухе 10-20 минут, пока белая гранула не станет полупрозрачной.
    10. Добавьте 20 мкл воды без РНазы для растворения гранулы. Измеряйте концентрацию и чистоту РНК с помощью спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрация РНК слишком высока, разведите соответствующее количество воды без РНаз.
    11. Поместите раствор РНК на лёд или храните при -80 °C для последующей обратной транскрипции.

7. Количественное RT-PCR (qRT-PCR)

  1. Обратная транскрипция
    1. Добавьте следующие компоненты последовательно в реактивную трубку ПЦР согласно инструкции производителя: 800 нг общего РНК (рассчитывать объём на основе концентрации), 4 мкл 5x All-in-One SuperMix для q-PCR, 1 мкл удаления gDNA и воду, свободную от РНаз, чтобы увеличить общий объём до 20 мкл.
    2. Аккуратно перемешайте компоненты. Установите ПЦР-аппарат на следующие условия: 55 °C на 6 минут, 80 °C на 1 минуту, а затем 12 °C бесконечно.
    3. Храните кДНК при -20 °C или храните её на льду для процесса qRT-PCR после завершения обратной транскрипции.
  2. qRT-PCR
    1. Подготовьте раствор предварительного смешивания qRT-PCR для таргетирования различных генов следующим образом: 5 мкл 2x Green qPCR SuperMix, 0,2 мкл Forward Primer (10 мкм), 0,2 мкл обратного праймера (10 мкм) и 3,6 мкл воды без нуклеаз. Аккуратно перемешайте и положите на лёд.
    2. Добавьте 9 мкл предварительной смеси qRT-ПЦР (подготовленного на этапе 7.2.1) и 1 мкл кДНК (подготовленного на этапе 7.1) в пробирки qRT-PCR согласно экспериментальной конструкции.
    3. Центрифугуйте трубки при 1000 × г при комнатной температуре на 2 минуты.
    4. Поместите трубки в аппарат флуоресцентного количественного ПЦР для обнаружения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте трёхступенчатый метод со следующей программой согласно инструкциям производителя реагента: 94 °C на 30 с, 94 °C за 5 с, 60 °C за 15 с и 72 °C за 10 с. Начните цикл с шага 2 на 40-45 циклов.
    5. Проведите количественный анализ с использованием сравнительного метода КТ (2-ΔΔCt).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый набор данных должен повторяться не менее трёх независимых раз для обеспечения надёжности результатов.

8. Иммунофлуоресцентное окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресцентное окрашивание проводится на ЛГЭК, культивируемых в пластинах с 24 лунками с частотой слияния 70-80% или на замороженных участках дифференцированных 3D-структур ЛГЭК.

  1. Для LGEC
    1. Удалите посевную среду из колодцев и трижды промывайте клетки PBS.
    2. Добавьте 500 мкл 4% PFA в каждую скважину в шкафу для биобезопасности или вытяжке и инкубуйте при комнатной температуре в течение 15 минут для фиксации ячеек.
    3. Промывайте клетки три раза с помощью PBS, каждая промывка длится 5 минут.
    4. Добавьте 500 мкл 0,2% Triton X-100, чтобы покрыть клетки, и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут для проникновения клеточной мембраны.
    5. Промывайте клетки три раза с помощью PBS, каждая стирка длится 10 минут.
    6. Удалите PBS и используйте иммуногистохимический маркер, чтобы нарисовать круг вокруг каждой ямы пластины с 24 лунками. Добавьте 50 мкл 2% BSA в каждую скважину, чтобы покрыть клетки. Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа для блокировки.
    7. Удалите BSA и добавьте 50 мкл разбавленных первичных антител (дополнительная таблица 1), чтобы покрыть LGEC. Инкубировать при 4 °C в течение 16-18 часов.
    8. Удалите первичное антитело и повторите шаг 8.1.5.
    9. Добавьте 50 мкл флуоресцентного вторичного антитела в каждую яму, чтобы покрыть LGEC. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 1 часа.
    10. Повторите шаг 8.1.5, избегая воздействия света.
    11. Добавьте 50 мкл раствора 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), чтобы покрыть LGEC и наблюдать окрашивание под флуоресцентным микроскопом.
  2. Для 3D сфероидов LGEC
    1. Подготовьте 3D сфероидные срезы LGEC, как описано на шаге 4. Проведите иммунофлуоресцентное окрашивание, как указано в шагах 8.1.2–8.1.11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Создать систему культуры LGEC без сывороток с использованием 2C
В этом протоколе целью было создать более простую и эффективную систему культурирования для расширения первичных мышиных LGEC. После обширного скрининга была успешно разработана безсывороточная комбинация 2C, состоящая исключительно из Y27632 и SB431542, что позволило долгосрочное расширение LGEC in vitro. После смешанного фермента первичные LGEC начали прилипывать и образовывать несколько клеточ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Как описано во введении, в последние годы было разработано несколько безсывороточных систем культуры клетокLG 10, 11, 12 и 13. Однако многие из этих методов имеют ограничения, включая слабую пролиферацию клеток и невозможность достичь масштабного расширения in vitro10,11. Кроме того, недавние с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82471048, 82271045); Программа науки и технологий Шэньчжэня (JCYJ20240813145510014); специальный проект по исследованиям в области здравоохранения провинции Цзилинь (2023SCZ63, 2024SCZ53, 2025SCZ65); и проект Плана развития науки и технологий провинции Цзилинь (YDZJ202601ZYTS389).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
 -20° C Ультранизкотемпературный холодильникHaier
 -80° C Ультранизкотемпературный холодильникHaier
0,25% трипсин-ЭДТАGibco25200056
1,5 мл микроцентрифугной трубки  КиргенKG2211Без рназы
35-мм клеткавую культурную чашуLABSELECT12111
4 и °; Холодильник CHaier
4% параформальдегид (PFA)ServicebioG1101
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)Йеасен708939ES03Храните при -20 градусах; C, стандартная концентрация 1 мг/мл, 500x, разбавьте до 1x с 1x PBS
5 мл центрифугной трубки  ACMECAC17457
50 мл центрифугной трубки и bbsp;LABSELECTCT-002-50-SS
Антиальфа-гладкомышечный антитело актина к кроликамAbcamab5694Разбавьте буфером разбавления антител на 1:100 
Анти-AQP5 к кроликам антитела  ABclonalA9927Разбавьте буфером разбавления антител на 1:100 
Антицитокератин-14 к кроличьим антителамAbcamab181595Разведите буфером разбавления антител при 1:200 
Антицитокератин 19  Антитела к кроликамAbcamab52625Разбавить буфером разбавления антител при 1:400 
Анти-Ki67 к кроликам антителаAbcamab16667Разведите буфером разбавления антител при 1:200 
Кабинет биобезопасностиSterilGARD
Бычий сывороточный альбумин (BSA) Йеасен36101ES60Хранить на 4°°; C
Мыши C57BL/6JЦентр лабораторных животных Сямэньского университета
Клеточная культивирующая пластинаLABSELECT1131224-колодец
Клеточный инкубаторЭппендорф
ЦентрифугаЭппендорф
ХлороформHUSHI10006818ВНИМАНИЕ, Проведение операций в вытяжке
CO2  Инкубатор постоянной температурыЭппендорф
Коллагеназа AРош10103586001Храните при -20 градусах; C, стандартная доза 200 мг/мл, 100x
Определенный раствор ингибитора трипсина (DTI)GibcoR007100
DermaLife K Keratinocyte Medium Complete Kit (среда без сыворотки) Жизненная линияLL-0007Хранить при 4 градусах; C
Д-ХэнксBiosharpBL559A Используется для разбавления Dispase II
Диметилсульфоксид (DMSO)SigmaD4540Используется для разбавления Y27632 и SB431542
Dispase IISigmaD4693Храните при -20 градусах; C, стандартная доза 200 мг/мл, 100x
Базовый курс DMEM (1X)GibcoC11995500BT
Высокоадсорбируемое вторичное антитело против кроликов IgG (H+L), Alexa Fluor 488ИнвитрогенA-21206Разведите буфером разбавления антител на 1:300
Физраствор с фосфатным буфером Dulbecco (DPBS)ServicebioG4200
Этанол абсолютHUSHI10009218ВНИМАНИЕ: Используйте для приготовления других разбавлений этанола 
Замораживающий микротомLeica
Высокоскоростная кофемолка для низких температурServicebio
Инвертированный флуоресцентный микроскопLeica
Инвертированный микроскопОлимп
Изопропанол HUSHI80109270
Лазерно-сканирующий конфокальный микроскоп FV3000ОЛИМП
Центрифуга при низкотемпературной высокой скоростиЭппендорф
LTF-ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) kit ElabscienceE-MSEL-M0047Храните при -20 градусах; C
Матричный гель (Matrigel)82703МогенгельАликвот и хранение при -20 и градусах; C
МикропипетторЭппендорф
Считыватель микропластинТермо Фишер Сайентифик
Вода без нуклеазыBiosharpBL510B
Соединение ОКТScigen4586
PBS, 1 и раз; (pH7.4)ServicebioG4202
ПЦР-усилительBIO-RAD
Пенициллин-стрептомицинBiosharpBL505A
Пенициллин-стрептомицин-амфотерицинBiosharpBL142A
Комплект PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601-01-V2Храните при -20 градусах; C
PerfectStart Uni RT& Комплект qPCRTransGen BiotechAUQ-01Храните при -20 градусах; C
Pilocarpine АладдинP424663Храните при -20 градусах; C, 2500x
Праймер AQP5  последовательность:
Вперёд: CATGAACCCAGCCCGATC
TT
Обратная: CTTCTGCTCCCATCAT
CC		Sangon Biotech
Капсюль K14  последовательность:
Вперёд:CCCACCTTTCATCTTCC
CAATT
Обратная сторона: AAGCCTGAGCAGCATGTAGCAG		Sangon Biotech
Капсюль K15  последовательность:
Вперёд:GAGGTGGCGTCTAACACA
GA
Обратная:TCTGAGCCTCCATCTCAC
AG		Sangon Biotech
Капсюль K19  последовательность:
Вперёд:ATTACTGCCCTGAGGAGC
CA
Обратная:TTCAGCTCCTCAATCCGA
GC		Sangon Biotech
Капсюль K5  последовательность:
Вперёд: CTCAGAGCTGAGGAAACAT
GC
Обратная: AGCTCCGCATCAAAGAAC
AT		Sangon Biotech
Primer Ki67  последовательность:
Вперёд: ACCATCATTGACCGCTCC
TT
Задняя часть: TTGACCTTCCCCATCAGG
GT		Sangon Biotech
Праймер LTF  последовательность:
Вперёд:CAGGAGCCAACAAATGTG
CC
Обратная:TTGTACTGGTCCCCCTTTCG
GC		Sangon Biotech
Праймер P63  последовательность:
Вперёд: ATGTCACCGAGGTTGTG
AAA
Обратная сторона: GAATTCAGTGCCAACCTGTG		Sangon Biotech
Праймер SOX10  последовательность:
Вперёд:ATCAGCCACGAGGTAATG
TCCAAC
Обратная:ACTGCCCAGCCCGTAGCC		Sangon Biotech
Primer α-SMA  последовательность:
Вперёд: CTCCCTGGAGAGCTA
CG
Обратная: CGCTGACTCCATCCCAAT
GA		Sangon Biotech
Прибор реального времени флуоресцентного количественного ПЦР-оборудованияРош
Реагент для полной экстракции РНК-изолата РНКВазимеR401-01ВНИМАНИЕ, Проведение операций в вытяжке
SB431542 ApexbioA8249Храните при -20 градусах; C, стандартная мощность 20 мМ, 2000x
Спектрофотометр NanoDrop 1000Термо Фишер СайентификИзмеряйте концентрацию РНК
СахарозаМаклинS818046Растворить в дистиллированной воде
Triton X-100SolarbioT8200
Система очистки сверхчистой водыМиллипор
Универсальный буфер разбавления антителЭпизимPS119Хранить при 4 градусах; C
Y27632 ApexbioB1293Храните при -20 градусах; C, стандартная мощность 20 мМ, 2000x

Ссылки

  1. Veernala, I., et al. Lacrimal gland regeneration: the unmet challenges and promise for dry eye therapy. Ocul Surf. 25, 129-141 (2022).
  2. Chen, X., Li, S., Zhang, Y., Ye, L. Progress and prospects in the treatment of lacrimal gland dysfunction diseases: from traditional treatment methods to stem cell and organoid therapies. Stem Cells Int. 2025, 6334284(2025).
  3. Hirayama, M., Kawakita, T., Tsubota, K., Shimmura, S. Challenges and strategies for regenerating the lacrimal gland. Ocul Surf. 14 (2), 135-143 (2016).
  4. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  5. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 6 (1), 88-98 (2017).
  6. Millar, T. J., Herok, G., Koutavas, H., Martin, D. K., Anderton, P. J. Immunohistochemical and histochemical characterisation of epithelial cells of rabbit lacrimal glands in tissue sections and cell cultures. Tissue Cell. 28 (3), 301-312 (1996).
  7. Oliver, C. Isolation and maintenance of differentiated exocrine gland acinar cells in vitro. In Vitro. 16 (4), 297-305 (1980).
  8. Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (1), 145-158 (1989).
  9. Yoshida, K., et al. Serum-free medium enhances the immunosuppressive and antifibrotic abilities of mesenchymal stem cells utilized in experimental renal fibrosis. Stem Cells Transl Med. 7 (12), 893-905 (2018).
  10. Ueda, Y., et al. Purification and characterization of mouse lacrimal gland epithelial cells and reconstruction of an acinar-like structure in three-dimensional culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 1978-1987 (2009).
  11. Kobayashi, S., et al. Characterization of cultivated murine lacrimal gland epithelial cells. Mol Vis. 18, 1271-1277 (2012).
  12. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 20(2020).
  13. Bannier-Hélaouët, M., et al. Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232.e7 (2021).
  14. Bannier-Hélaouët, M., et al. Establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids. J Vis Exp. (192), e65040(2023).
  15. Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-dimensional, serum-free culture system for lacrimal gland stem cells. J Vis Exp. (184), e63585(2022).
  16. Wang, J., Sun, S., Deng, H. Chemical reprogramming for cell fate manipulation: methods, applications, and perspectives. Cell Stem Cell. 30 (9), 1130-1147 (2023).
  17. Rehman, A., et al. Role of small molecules as drug candidates for reprogramming somatic cells into induced pluripotent stem cells: a comprehensive review. Comput Biol Med. 177, 108661(2024).
  18. Zhang, C., et al. Long-term in vitro expansion of epithelial stem cells enabled by pharmacological inhibition of pak1-rock-myosin II and TGF-β signaling. Cell Rep. 25 (3), 598-610.e5 (2018).
  19. An, X., et al. Novel cell culture paradigm prolongs mouse corneal epithelial cell proliferative activity in vitro and in vivo. Front Cell Dev Biol. 9, 675998(2021).
  20. Xu, L., et al. A cocktail of small molecules maintains the stemness and differentiation potential of conjunctival epithelial cells. Ocul Surf. 30, 107-118 (2023).
  21. Zeng, B., et al. Distinctive small molecules blend: promotes lacrimal gland epithelial cell proliferation in vitro and accelerates lacrimal gland injury repair in vivo. Ocul Surf. 34, 283-295 (2024).
  22. Zhou, Q., et al. inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
  23. Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. Am J Respir Cell Mol Biol. 55 (3), 323-336 (2016).
  24. Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of transforming growth factor-β signaling delays cellular senescence and preserves the function of endothelial cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 6 (2), 589-600 (2017).
  25. Natarajan, E., et al. A keratinocyte hypermotility/growth-arrest response involving laminin 5 and p16INK4a activated in wound healing and senescence. Am J Pathol. 168 (6), 1821-1837 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

2D3D
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.