Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация и количественный анализ активации PARP1/PARP2, индуцированной генотоксином, в клетках с помощью репортера на основе флуоресцентного синтеза белка

374 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70497

⸱

17 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Warren Alpert Medical School & Legorreta Cancer Center, Brown University, 2Department of Pharmacology & Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем метод визуализации на основе клеток, субклеточной локализации и количественного анализа обогащённых очагами поли(ADP-рибоза) (PAR) в фиксированных клетках млекопитающих. Этот анализ позволяет количественно определить сайты активации PARP, вызванного повреждением ДНК, включая репарацию удаления основания или восстановление разрыва одной цепоточки, в ядрах клеток, подвергшихся воздействию генотоксина.

Аннотация

Поли(ADP-рибоза) (PAR) — это полимер АДФ-рибозы, синтезированный четырьмя членами семейства ферментов ADP-рибозной полимеразы: PARP1, PARP2, PARP5a и PARP5b. Однако только PARP1 и PARP2 синтезируют PAR в ответ на разрывы ДНК. PAR определяется как посттрансляционная модификация белка, но также показано, что он существует как модификация ДНК или РНК. Уровни PAR дополнительно регулируются PARG — гликогидролазой PAR, которая вместе с PARP1 и PARP2 регулирует уровень клеточного PAR, вызванного повреждением ДНК. Динамический синтез и деградация PAR критически важны для его регуляторной роли в репарации ДНК и реакции на повреждение ДНК, которая, в свою очередь, влияет на реорганизацию, репликацию, транскрипцию и гибель клеток хроматина. Активация PARP1/PARP2 и накопление PAR можно рассматривать как места продолжающейся репарации эксцизии основания или одноцепочечного разрыва ДНК; однако многие активаторы PARP1/PARP2 также связаны со стрессом репликации и другими метаболическими процессами ДНК. После формирования цепи PAR способствуют привлечению факторов репарации ДНК и реакции на повреждение ДНК (DDR) к местам повреждения ДНК или геномного повреждения через домены, связывающие PAR (PBD). Десять различных PBD распознают различные области молекулы PAR, включая мотив связывания PAR, PAR-связывающий цинковый палец, домен WWE и макродомен, а также другие PBD. Для облегчения клеточного анализа динамики PAR мы использовали PBD, объединённые с усиленным зелёным флуоресцентным белком (EGFP) для оптимизации клеточных количественных очагов PAR. Мы описываем анализ, в котором используется фрагмент RNF146, кодирующего домен PBD/WWE, связанный с EGFP, для визуализации и количественной оценки накопления PAR в местах геномного повреждения и продолжающегося BER или SSBR. Мы описываем экспериментальные этапы, включая производство лентивирусных частиц, трансдукцию целевой клеточной линии, обработку клеток млекопитающих для индуцирования повреждения геномной ДНК, получение конфокальных флуоресцентных микрофотографий и полуавтоматическую количественную оценку данных.

Введение

Этот протокол описывает анализ LivePAR, который позволяет визуализировать и проводить количественный анализ поли(ADP-рибоза) (PAR) в местах геномного повреждения, главным образом связанного с восстановлением по удалению оснований (BER) или восстановлением разрыва одной цепочки (SSBR), в клетках млекопитающих 1,2,3. BER — это важный путь восстановления ДНК, который удаляет повреждённые или модифицированные основания из ДНК (для обзоров BER и PARilation см. 4,5,6,7). BER начинается с ДНК-гликозилаз, которые распознают и удаляют модифицированныеоснования 4, оставляя апуриновое/апиримидиновое (AP) место, например, метилпурингликозилаза (MPG), которая удаляет метилированныеоснования 8,9, или 8-оксогуанингликозилаза (OGG1), которая исключает 8-оксоG 9,10. AP-сайты затем расщепляются AP эндонуклеазой 1 (APE1)11,12,13, что приводит к созданию зазубреза в позвоночнике ДНК. Полимераза, а именно ДНК-полимераза β (Polβ)14,15, настраивает и заполняет промежунок, используя неповреждённую цепь в качестве шаблона, и, наконец, ДНК-лигазы герметизируют восстановленнуюцепь 16,17, например, ДНК-лигаза I или ДНК-лигаза III.

Ключевыми участниками BER и SSBR являются поли(ADP-рибозные) полимеразы 1 и 2 (PARP1/PARP2)18,19,20 — ферменты, которые быстро обнаруживают разрывы цепочек ДНК во время BER или SSBR. После обнаружения этих разрывов PARP1/PARP2 катализирует добавление АДФ-рибозных полимеров к себе и другим белкам — процесс, называемый PARilation (для обзора, см.6) — путём гидролиза NAD+. Это создаёт динамический белковый каркас (PAR), который привлекает другие факторы восстановления ДНК к месту повреждения, повышая точность восстановления ДНК. Для управления этим динамическим каркасом PAR несколько белков участвуют в гидролизе и удалении цепей PAR, включая гидролазу АДФ-рибоза-акцептора 3 (ARH3), конечную гликозилгидролазу АДФ-рибозы 1 (TARG1), моно-АДФ-рибозилгидролазу 1/2 (MacroD1/2) и поли(АДФ-рибоза) гликогидролазу (PARG)6,21,22,23,24,25,26 . Однако PARG в первую очередь отвечает за этотпроцесс 21,27 и играет ключевую роль в ответе на повреждение ДНК (DDR)28,29.

Таким образом, PARG критически связан с функциями PARP1 и PARP2. В то время как PARP1 и PARP2 создают полимеры PAR, PARG действует как фермент «очистки», гидролизуя эти полимеры и эффективно возвращаяPARилирование 30,31. Этот процесс необходим для завершения как BER, так и SSBR, а также для повторной переработки PARP1/PARP2 для реагирования на новые повреждения ДНК. В результате PARP1, PARP2, PARilation и PARG работают скоординированно, обеспечивая эффективное и обратимое восстановление ДНК с помощью BER иSSBR 4,6.

Степень парилирования может зависеть от различных факторов и играет важную роль в общей реакции на повреждениеДНК 32. К этим факторам относятся воздействие генотоксинов, добавляющих аддукты к основаниям ДНК, таких как N-метил-N'-нитро-N-нитрогуанидин (MNNG), метилметансульфонат (MMS), перекись водорода (H2O2) или трет-бутилгидропероксид (tBuOOH). Кроме того, степень ПАРилирования может зависеть от молекул, модулирующих процесс ПАРилирования, таких как дигидроникотинамид рибозид (NRH), предшественник NAD+, усиливающий активацию PARP за счёт повышения уровня NAD+, или FK866, ингибитор NAMPT, который может снижать уровень NAD+ и негативно регулировать активациюPARP 3. Наконец, генетические мутации или ингибирование мелких молекул ферментов, таких как PARP1/PARP2, PARG или других белков восстановления ДНК (например, дефекты BER или гомологичные рекомбинационные факторы, такие как BRCA1/BRCA2), могут изменять активациюPARP 33,34,35,36.

Анализ LivePAR использует фрагмент белка безымянного пальца 146 (RNF146), который кодирует домен WWE (аминокислоты 100–182), связанный с усиленным зелёным флуоресцентным белком (EGFP)3. Домен WWE — это глобулярный домен, названный в честь консервативных остатков триптофана (W) и глутамата (E) в его зонесвязывания 37. Домены WWE связываются с изо-ADP-рибозой — наименьшей внутренней структурной единицей в цепяхPAR 38,39. RNF146 — это убиквитинлигаза E3, которая распознаёт изо-ADP-рибозу38,40 и, как сообщается, нацелена на белки, участвующие в BER (XRCC1, ДНК-лигаза III и PARP1) для деградации протеасом. Связывание этого домена WWE с EGFP позволяет визуализировать и обнаруживать генотоксин-индуцированные участки парилирования в клетках млекопитающих. В этом протоколе мы описываем формирование стабильных клеточных линий, экспрессирующих репортер LivePAR (рисунок 1A), индукцию повреждения ДНК для активации PARP1/PARP2, производство PAR, а также сбор и анализ данных конфокальной флуоресцентной микроскопии (рисунок 1).

Плазмида pMD2.g(VSVG) обеспечивает вирусную оболочку гликопротеин (VSVG), которая расширяет диапазон клеток, которые вирус может заразить, по сравнению с нативным белком оболочки лентивируса. Плазмида pRSV-REV обеспечивает белок регуляторного элемента (REV), который является важным трансактиватором, связывающимся с вирусной РНК и активируя транскрипцию вирусных генов; Он необходим для эффективного размножения вирусов. Плазмида pMDLg/pRRE содержит несколько ключевых компонентов внутренней упаковки, а именно gag, кодирующего матрикс (MA), капсид (CA) и нуклеокапсидные (NC) белки, pol, который кодирует ферменты, необходимые для репликации вируса и интеграции в геном клетки хозяина; и регуляторный элемент РНК (RRE), который является РНК-элементом, повышающим эффективность трансляции вирусной РНК и упаковки геномной РНК. Плазмида pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (рисунок 1A) содержит кДНК, кодирующую усиленный зелёный флуоресцентный белок (EGFP), который сливается с C-концом домена WWE RNF146 (аминокислоты 100–182), белковый домен, связывающийся с поли(ADP-рибозными) цепями, а вектор также кодирует гигромицин-резистентную кассету. Вирус изолируется из супернатанта клеточной культуры и может храниться при -80 °C или немедленно использоваться для трансдукции (рисунок 1B).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Производство лентивируса

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует систему упаковки лентивирусатретьего поколения 42,43 для генерации клеток, экспрессирующих генетически закодированный репортёр PAR. Лентивирусные частицы образуются в клетках 293FT с использованием четырёхплазмидной системы, включающей компоненты огибающей, регулятора и упаковки, а также конструкцию pLV-EF1A-LivePAR-Hygro, кодирующей домен WWE RNF146, маркированный EGFP, который связывает поли(ADP-рибозы) цепи. Полученный вирус используется для создания стабильных клеточных линий с целью визуализации и количественной оценки накопления PAR.

  1. Культивировать клетки с низким проходом 293FT в DMEM, содержащие 10% FBS и 1% Pen/Strep, в увлажнённой атмосфере при 37 °C и 5%CO2. Убедитесь, что клетки 293FT не находились в культуре более 3 недель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы регулярно используем ячейки 293FT с номерами проходов от 3 до 10. Клетки 293FT были преобразованы и увековечены большим антигеном SV40. Эти клетки обладают высокой эффективностью трансфекции, что крайне важно для производства рекомбинантного белка и исследований экспрессии генов. Они хорошо реагируют как на липидную трансфекцию, так и на методы вирусной трансдукции.
  2. Пластина 1.7 × 105 клеток 293FT на 60-мм контейнер для культивирования тканей в итоговом объёме 5,5 мл культурной среды на первый день. Вернуть клетки в инкубатор на 24 часа.
  3. На второй день (день трансфекции) добавьте 375 мкл среды FBS- и Pen/Strep DMEM в стерильную микроцентрифугационную трубку объемом 1,5 мл. Затем добавьте 10 мкл липидного трансфекционного реагента, 4 мкг плазмиды pLV-EF1A-LivePAR-Hygro, 2 мкг плазмиды pMD2.g(VSVG), 2 мкг плазмиды pRSV-REV и 2 мкг плазмиды pMDLg/pRRE. Аккуратно постукуйте по микроцентрифугационной трубке, чтобы смешать среду, трансфекционный реагент и плазмидную ДНК (избегайте вихря). Инкубировать 15–30 минут при комнатной температуре для формирования комплекса реагентов ДНК и трансфекции.
  4. Добавьте смесь реагентов плазмид/трансфекции в антенну диаметром 60 мм, содержащую клетки 293FT для трансфекции, не удаляя среду по каплям. Вернуть клетки в инкубатор на 48 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот период позволяет вырабатывать и выпускать лентивирусные частицы в растущую среду.
  5. На четвёртый день соберите культурную среду из трансфектированных клеток 293FT для выделения частиц лентивируса. Фильтруйте через стерильный фильтр 0,45 мкм для отделения клеточного остатка от лентивирусных частиц.
  6. Определите титр лентивируса с помощью доступных реагентов (опционально).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод обычно даёт от 105 до10 6 инфекционных единиц на мл (IFU/mL), что соответствует приблизительному мультипликативности инфекции (MOI) ~5 при использовании, как указано на следующем этапе трансдукции.
  7. Аликвотируйте среду с частицами лентивируса в четыре стерильных криовиала (1,0 мл на пробирку) и храните при -80 °C.

2. Трансдукция

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описан протокол лентивирусной трансдукции, используемый для введения трансгена в клеточные линии (рисунок 1B). В нашей лаборатории он стабильноэффективен 1, 3, 3, 33, 37, 44, 45.

  1. Культивируйте выбранную клеточную линию (низкое количество проходов) в соответствующей среде в увлажнённой атмосфере при температуре 37 °C и 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с раннего описания нужного типа клетки. Новый флакон с клетками должен быть разморажен и пропущен хотя бы один раз перед посевом для трансдукции.
  2. В первый день семя 1 × 105–1,5 × 10по 5 клеток на каждую колодцу на каждую яме пластины на 6 лунок в 2 мл растительной среды. Вернуть клетки в инкубатор на 24 часа.
  3. Во второй день (день трансдукции) убедитесь, что клетки соединяются между 20% и 40%. Добавьте 1 мл вируса, 1 мл среды роста и 2 мкл полибрена (2 мг/мл) в коническую трубку объемом 15 мл и аккуратно перемешайте инверсией (избегайте вихря).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полибрен используется во время трансдукции лентивируса для предотвращения электростатического отталкивания между частицами вируса и клеточной мембраной. Поскольку полибрен положительно заряжен, он взаимодействует с отрицательно заряженными вирусными гликопротеинами, нейтрализуя их заряд. Кроме того, полибрен связывается с гликозаминогликанами в клеточной культурной среде, предотвращая их взаимодействие с вирусом. Таким образом, полибрена значительно повышает эффективность трансдукции.
  4. Снимите растительную среду из пластины на 6 лунок и добавьте смесь вируса, среды и полибрена в каждую колодцу. Поместите ячейки с трансдукционной смесью в инкубатор с увлажнённой атмосферой при 32 °C и 5%CO2 в течение 16–18 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация клеток при 32 °C ночью во время лентивирусной трансдукции — это распространённая, хотя и не обязательная, практика, которая значительно повышает эффективность вирусной инфекции. Снижение температуры замедляет клеточный метаболизм, снижая клеточную защиту и увеличивая восприимчивость к вирусным инфекциям.
  5. На третий день замените среду вирусных клеток на свежие и переместите их в инкубатор при температуре 37 °C. Инкубировать 48 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этих двух дней достаточно, чтобы клетки выработали трансген RNF146(100–182)-EGFP и стали устойчивыми к гигромицину.
  6. Для разработки полученных поликлональных стабильных клеточных линий, экспрессирующих трансген RNF146(100–182)-EGFP, далее начинается отбор гигромицинов через 2 дня инкубации, как показано на шаге 2.5.
    1. Альтернативно, расширить эту популяцию трансдуцированных клеток при отсутствии гигромицина и использовать для анализа PAR в течение следующих 10–14 дней (временная трансдукция), как описаноранее 1.
  7. Перенесите клетки на пластину диаметром 100 мм, когда они вырастут в присутствии гигромицина, и расширяйтесь настолько, насколько это необходимо.
  8. Подготовьте криозапасы трансдуцированных ячеек для будущего использования.
  9. Подтвердить экспрессию трансгена RNF146(100–182)-EGFP с помощью конфокальной микроскопии, как изложено в разделе 3. Трансген RNF146(100–182)-EGFP будет экспрессироваться по всей клетке.
  10. Валидировать экспрессию трансгена RNF146(100–182)-EGFP с помощью иммуноблоттинга, как описано вдругих статьях 1,37.

3. Конфокальная микроскопия и анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе протокола подробно описана подготовка коверслипсов, засев клеток, экспрессирующих LivePAR, воздействие обработок (tBuOOH, MNNG, PARGi, PARPi и/или NRH), а также подготовку фиксированных клеток на микроскопических стеклянах для конфокальной визуализации и анализа очагов PAR (рисунок 1C). Также описывается использование программного обеспечения ImageJ и собственного макроса для полуавтоматической количественной оценки фокусов PAR. Этот протокол может использоваться для изучения влияния различных факторов (например, малых молекул, нокаутов белка BER) на ПАРилирование, зависящее от повреждения ДНК, и успешно применялся в нашейлаборатории 34,37.

  1. Подготовка к укрытию
    1. Замочите 20 × 20 мм накладных сливок на 20 минут в диэтиловом эфире в стеклянной ёмкости в вытяжной вытяжке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с диэтиловым эфиром используйте вытяжку с дымом из-за его воспламеняемости и потенциальных опасностей.
    2. Удалить диэтиловый эфир и промыть покрытия в уменьшающихся концентрациях этанола [100%, 70%, 50%, затем 0% (ddH 2O)].
    3. Удалите воду и замочите накладки на 20 минут в 1 N HCl с аккуратным перемешиванием.
    4. Снимите HCl и трижды помой чехлы с помощьюddH 20.
    5. Храните покрытия в 70% этаноле при 4 °C до использования.
  2. Покрытие клеток
    1. Поставьте две стерильные накладки диаметром 20 × 20 мм в 60-мм контейнер для клеточной культуры рядом друг с другом. Приготовьте столько блюд, сколько потребуется для эксперимента. Убедитесь, что весь этанол испарился, прежде чем добавлять какие-либо клетки в блюдо с коверсликами. Смойте остатки этанола, добавив стерильный PBS в блюдо на 10–15 минут; Удалите PBS перед посадкой ячеек.
    2. Семена 200 000 клеток, экспрессирующих LivePAR, в одну чашу клеточной культуры. Дайте клеткам 24–36 часов прилипнуть к покровным сплитам, подготовьте среду и начните размножение (рост).
  3. Индукция очков PAR
    1. Подвергайте клетки, экспрессирующие LivePAR, воздействию 100 мкм NRH, 10 мкм PARGi и 10 мкм MNNG или 40 мкм tBuOOH. Кроме того, для проверки образования PAR, зависящего от PARP1/PARP2, ингибируйте PARP1/PARP2 путём добавления 10 мкм PARPi. Добавляйте соединения непосредственно в среду, содержащуюся клетки на покрытиях, и аккуратно перемещайте их в контейнерах для клеточной культуры, чтобы распределить соединения. Инкубировать тарелки толщиной 60 мм при 37 °C в течение 60–90 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: NRH используется для обеспечения достаточного уровня клеточного NAD+ для оптимальной парилирования, опосредованной PARP1/PARP2 33,46,47. PARGi используется для предотвращения разложения цепочек PAR, синтезированных PARP1/PARP2, с помощью PARG. MNNG или tBuOOH используется для индуцирования модификаций оснований ДНК с целью инициации BER, что приводит к активации PARP1/PARP2. PARPi используется для подтверждения того, что сигнал (фокусы) возникает в результате активации PARP1/PARP2.
  4. Фиксация ячеек и монтаж накладных слоев
    1. Снимите медиум и стирайте с помощью PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка один-два раза с помощью PBS важна, так как среда, используемая для культивирования клеток, содержит высокую концентрацию белков сыворотки. Промывка с помощью PBS также удаляет остатки MNNG или tBuOOH, оставшиеся в медиа.
    2. Префикс 4% формальдегида в PBS на 15 минут при комнатной температуре. Промывайте клетки 3 раза с помощью PBS.
    3. Фиксируйте, добавив 3 мл холодного (-20 °C) метанола: ацетона (7:3) в ячейки. Поставьте тарелку при -20 °C на 9 минут.
    4. Удалите метанол: ацетон. Стирайте 3 раза с PBS.
    5. Пипетта 15 мкл антифейд-среды с DAPI на стеклянных стеклах. Аккуратно закрепите чехлы на месте монтажного материала так, чтобы клетки были обращены внутрь, минимизируя пузырьки.
    6. Центрируйте, закрепите и герметизируйте боковые стороны покрытия стеклянного стекла, нанеся небольшое количество прозрачной верхней эмали для ногтей на боковые стороны покрытия. Поставьте слайды в темноту, чтобы верхний слой высох эмаль (~10 мин). Храните слайды в темноте при 4 °C до готовности к съёмке.
  5. Визуализационные клетки
    1. Снимите все стекли не менее чем в 10 раз при увеличении 63× с помощью конфокального микроскопа. Обнаружение очагов PAR с помощью лазера 488 нм и ядерного окрашивания (DAPI) с помощью лазера 405 нм (например, см. рисунок 2).
  6. Анализ конфокальных изображений
    1. Создайте текстовый файл со следующим текстом и назовите его «LivePAR_Macro». Этот макрос облегчает «автоматическую» количественную оценку очков PAR в ядрах клеток, экспрессирующих LivePAR:
      макро "DAPI положительное окрашивание [1]" {
      tit=getTitle();
      run("Duplicate...", "title=DAPI duplicate");
      selectWindow("DAPI")
      run("8-bit");
      run("Разделённые каналы")
      selectWindow("C2-"+"DAPI");
      близко();
      selectWindow("C1-"+"DAPI");
      run("Гауссианское размытие...", "Sigma=3");
      setAutoThreshold("По умолчанию");
      run("Make Binary");
      run("Инвертировать")
      run("Fill Holes")
      run("Водораздел")
      run("Анализировать частицы...", "size=50.00-Бесконечность круговости=0.00-1.00 show=Контуры добавить исключить in_situ»);
      переименовать("DAPI_"+синица);
      selectWindow("DAPI_"+tit);
      близко();
      }
      macro "PAR [2]" {
      setBatchMode (true);
      run("8-bit");
      t=getTitle();
      run("Duplicate...", "title=GB1 duplicate");
      run("Duplicate...", "title=GB20 duplicate");
      selectWindow("GB20")
      run("Гауссово размытие...", "radius=20 стек");
      selectWindow("GB1");
      run("Гауссово размытие элементов...", "radius=1 стек");
      imageCalculator («Вычитать создать стек», «GB1», «GB20»);
      selectWindow("GB1");
      близко();
      selectWindow("GB20");
      близко();
      selectWindow («Результат GB1»);
      переименовать("Blank_GB1-GB20_"+t);
      title = getTitle();
      run("Разделённые каналы")
      selectWindow("C1-"+title);
      близко();
      selectWindow("C2-"+title);
      setThreshold(90,255) /значение 90 можно изменить с учётом экспериментальной вариабельности
      run("Анализировать частицы...", "size=0.00-200 circularity=0.00-1.00 show=Маски обобщать»);
      close («C2-"+title);
      selectWindow("Маска C2-"+title);
      close ();
      setBatchMode (ложно);
      }
    2. Скачайте и установите ImageJ на компьютер (https://imagej.net/ij/download.html).
    3. Откройте ImageJ и установите макрос (текстовый файл: LivePAR_Macro), нажав на Плагины | Макросы | Установить.
    4. Откройте все конфокальные файлы в ImageJ и сохраняйте их как *.tif файлы, чтобы сохранить оригинальные файлы.
    5. Откройте документ в таблице и сохраните его как [date]_[Cell line]_Foci Analysis.
    6. Анализируйте по одному *.tif файлу за раз. Нажмите 1 , чтобы найти ядра; когда открывается окно под названием ROI Manager , выберите все записи в окне и нажмите добавить , чтобы наложить область ядра поверх оригинального изображения. Удалить неправильно идентифицированные ядра. Нарисуйте ядро с помощью инструмента свободного выбора и нажмите 2 , чтобы количественно определить фокусы PAR.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не включайте ядра, которые не полностью находятся в рамке.
    7. Выберите каждое ядро в менеджере ROI по одному и нажмите 2. Появится подсчёт, указывающий количество фокусов внутри выбранного ядра. После оценки фокусов во всех ядрах файла скопируйте и вставьте информацию в открытый документ таблицы.
    8. Повторите шаги 3.6.6 и 3.6.7 со всеми файлами *.tif.
    9. Разместите фокусы PAR на ядро в выбранном программном обеспечении (например, см . рисунок 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Клетки, экспрессирующие зонд LivePAR, можно генерировать путём выработки лентивируса, кодирующего белок-слияние RNF146(100-182)-EGFP (рисунок 1A). Клетки могут оцениваться после экспрессии временной экспрессии в течение до двух недель после трансдукции или как стабильные клеточные линии после отбора в гигромицине (рисунок 1B)1. После обработки генотоксином очаги PAR, вызванные повреждением ДНК, могут быть...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Анализ LivePAR был разработан для обнаружения участков повреждения ядерной геномной ДНК, где PARP1/PARP2 активно синтезирует цепи PAR. Для этого фрагмент RNF146, кодирующей домен WWE (аминокислоты 100–182), был слит сEGFP 1,2,3,37. Дополнительные PAR-зонды, которые мы описали, кодируют EGFP, сплавленный с аминокислотными остатками от 1 до 166 DTX4, аминокислотн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Р.В.С. является соучредителем Canal House Biosciences, LLC, входит в Научный консультативный совет и обладает долей в долях, но эта компания не участвовала в этом проекте, как и консультационная работа, связанная с этим исследованием. Авторы утверждают, что конфликта интересов нет.

Благодарности

Особая благодарность Мари Миго (Университет Южной Алабамы) за её постоянную поддержку в вопросах поставки NRH на протяжении многих лет и за экспертные советы. Исследования в лаборатории Соболь по ремонту ДНК, анализу повреждения ДНК и влиянию генотоксичного воздействия и стресса при репликации финансировались грантами NIH [ES029518, ES028949, CA238061, CA236911, AG069740 и ES032522], а также NSF [NSF-1841811]. Поддержку также предоставлял Фонд эндаументов онкологического центра Легоретта (R.W.S.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реактивы, химикаты и пептиды
0.45 µm Durapore steriflip фильтрыSigma-AldrichCat# SE1M003M00
Кристаллические стеклянные накладки для микроскопа, 20 x 20 ммThermo Fisher ScientificCat# 22-170-371
АцетонThermo Fisher ScientificCat# A18-1
Культуральные чаши, 100 ммVWRCat# 25382-166
Культуральные чаши, 60 ммFisher ScientificCat# 430166
Культуральные пластинки, 6-лунныеVWRCat# 62406-161
Криовиалы, 2 млVWRCat# 89499-722
Диэтиловый эфирThermo Fisher ScientificCat# 60-29-7
ДиметилсульфоксидThermo Fisher ScientificCat# BP231-1
Одноразовые стерильные фильтры, 0.45 µmSigma-AldrichCat# SE1M003M00
DMEMCorningCat# 15-017-CV
Этанол, 200 доказательствDecon LabsCat# 2701
Стеклянные микроскопические предметные стёклаThermo Fisher ScientificCat# 12-544-4
Теплоинактивированная сыворотка плода быкаAtlanta BiologicsCat# S11150
Соляная кислотаThermo Fisher ScientificCat# A144-212
ГиgromицинThermo Fisher ScientificCat# 10687010
Большие салфетки Kim WipesKimberly-ClarkCat# 34256
Lenti-X GoStix Plus KitTakaraCat# 631280
МетанолThermo Fisher ScientificCat# A452SK-4
MNNGMolportCat# N493990
NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-дигидрокси-5-(гидроксиметил) тетрагидрофурано-2-ил]-4H-пиридин-3-карбоксиамид)Marie Migaud или NuChem Sciences Inc
Ингибитор PARG (PDD00017273)Sigma-AldrichCat# SML1781
Ингибитор PARPi (Велипариб, ABT-888)MedChemExpressCat# HY-10129
Пенициллин/стрептомицинGibcoCat# 15140-122
ПолибренSigma-AldrichCat# TR-1003-G
tBuOOHThermo Fisher ScientificCat# 180345000
TransIT-x2 (реагент для трансфекции)MirusCat# MIR-6006
Triton-X100VWRCat# 0694
Трипсин-ЭДТАThermo Fisher ScientificCat# 25200-056
Vectashield (H-1000) среда для монтирования с подавлением искаженийThermo Fisher ScientificCat# NC1695563
Клеточные линии
293-FTThermo Fisher ScientificCat# R70007
(производные от трансформированных клеток человеческой эмбриональной почки большим антигеном SV40 Т)Thermo Fisher ScientificCat# R70007
LN428Великодушный подарок отN/A
(Человеческая линия клеток глиоматозы)Dr. Ian Pollack (Университет Питтсбурга)N/A
RPE-1ATCCCat# CRL-4000
(человеческие hTERT-бессмертные клетки ретинального пигментного эпителия)ATCCCat# CRL-4000
U2OSATCCCat# HTB-96
(Человеческая линия клеток остеосаркомы)ATCCCat# HTB-96
Рекомбинантная ДНК
pMDLg/pRREЛабораторный запас# 253Addgene, Cat# 12251
pRSV-RevЛабораторный запас# 254Addgene, Cat# 12253
pMD2.GЛабораторный запас# 252Addgene, Cat# 12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro
(LivePAR - это домен WWE RNF146, аминокислотные остатки 100-182, склеенный с EGFP; содержит кассету устойчивости к гиgromицину)		Лабораторный запас# 1727Addgene, Cat# 176063
Программное обеспечение и алгоритмы
Adobe Illustrator (для подготовки фигур)Adobe SystemsВерсия 2024
GraphPad PrismGraphPadВерсия 10.5.0 (Mac OS X)
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/download.html

Ссылки

  1. Koczor, C. A., et al. Quantitative analysis of nuclear poly(ADP-ribose) dynamics in response to laser-induced DNA damage. Methods Mol Biol. 2609, 43-59 (2023).
  2. Koczor, C. A., et al. Live cell detection of poly(ADP-ribose) for use in genetic and genotoxic compound screens. Cancers (Basel). 14 (15), 3676 (2022).
  3. Koczor, C. A., et al. Temporal dynamics of base excision/single-strand break repair protein complex assembly/disassembly are modulated by the PARP/NAD(+)/SIRT6 axis. Cell Rep. 37 (5), 109917 (2021).
  4. Almeida, K. H., Sobol, R. W. A unified view of base excision repair: lesion-dependent protein complexes regulated by post-translational modification. DNA Repair (Amst). 6 (6), 695-711 (2007).
  5. Krokan, H. E., Bjoras, M. Base excision repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a012583 (2013).
  6. Al-Rahahleh, R. Q., Sobol, R. W. Poly-ADP-ribosylation dynamics, signaling, and analysis. Environ Mol Mutagen. 65 (9), 315-337 (2024).
  7. Saville, K. M., et al. NAD(+)-mediated regulation of mammalian base excision repair. DNA Repair (Amst). 93, 102930 (2020).
  8. Ibeanu, G., et al. Overexpression of human DNA repair protein N-methylpurine-DNA glycosylase results in the increased removal of N-methylpurines in DNA without a concomitant increase in resistance to alkylating agents in Chinese hamster ovary cells. Carcinogenesis. 13 (11), 1989-1995 (1992).
  9. Svilar, D., Goellner, E. M., Almeida, K. H., Sobol, R. W. Base excision repair and lesion-dependent subpathways for repair of oxidative DNA damage. Antioxid Redox Signal. 14 (12), 2491-2507 (2011).
  10. Bjoras, M., et al. Opposite base-dependent reactions of a human base excision repair enzyme on DNA containing 7,8-dihydro-8-oxoguanine and abasic sites. EMBO J. 16 (20), 6314-6322 (1997).
  11. Chen, D. S., Herman, T., Demple, B. Two distinct human DNA diesterases that hydrolyze 3'-blocking deoxyribose fragments from oxidized DNA. Nucleic Acids Res. 19 (21), 5907-5914 (1991).
  12. Demple, B., Herman, T., Chen, D. S. Cloning and expression of APE, the cDNA encoding the major human apurinic endonuclease: definition of a family of DNA repair enzymes. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (24), 11450-11454 (1991).
  13. Almeida, K. H., Andrews, M. E., Sobol, R. W. AP endonuclease 1: biological updates and advances in activity analysis. Methods Enzymol. 705, 347-376 (2024).
  14. Dianov, G., Price, A., Lindahl, T. Generation of single-nucleotide repair patches following excision of uracil residues from DNA. Mol Cell Biol. 12 (4), 1605-1612 (1992).
  15. Sobol, R. W., et al. Requirement of mammalian DNA polymerase-beta in base-excision repair. Nature. 379 (6561), 183-186 (1996).
  16. Kubota, Y., et al. Reconstitution of DNA base excision-repair with purified human proteins: interaction between DNA polymerase beta and the XRCC1 protein. EMBO J. 15 (23), 6662-6670 (1996).
  17. Prasad, R., et al. Specific interaction of DNA polymerase beta and DNA ligase I in a multiprotein base excision repair complex from bovine testis. J Biol Chem. 271 (27), 16000-16007 (1996).
  18. Alkhatib, H. M., et al. Cloning and expression of cDNA for human poly(ADP-ribose) polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (5), 1224-1228 (1987).
  19. Cherney, B. W., et al. cDNA sequence, protein structure, and chromosomal location of the human gene for poly(ADP-ribose) polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (23), 8370-8374 (1987).
  20. Ame, J. C., et al. PARP-2, a novel mammalian DNA damage-dependent poly(ADP-ribose) polymerase. J Biol Chem. 274 (25), 17860-17868 (1999).
  21. Fisher, A. E., Hochegger, H., Takeda, S., Caldecott, K. W. Poly(ADP-ribose) polymerase 1 accelerates single-strand break repair in concert with poly(ADP-ribose) glycohydrolase. Mol Cell Biol. 27 (15), 5597-5605 (2007).
  22. Jankevicius, G., et al. A family of macrodomain proteins reverses cellular mono-ADP-ribosylation. Nat Struct Mol Biol. 20 (4), 508-514 (2013).
  23. Zaja, R., et al. Comparative analysis of MACROD1, MACROD2 and TARG1 expression, localisation and interactome. Sci Rep. 10 (1), 8286 (2020).
  24. Ishiwata-Endo, H., et al. ARH family of ADP-ribose-acceptor hydrolases. Cells. 11 (23), 3853 (2022).
  25. Prokhorova, E., et al. Unrestrained poly-ADP-ribosylation provides insights into chromatin regulation and human disease. Mol Cell. 81 (12), 2640-2655.e8 (2021).
  26. Groslambert, J., et al. The interplay of TARG1 and PARG protects against genomic instability. Cell Rep. 42 (9), 113113 (2023).
  27. Min, W., Wang, Z. Q. Poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) and its therapeutic potential. Front Biosci (Landmark Ed). 14 (5), 1619-1626 (2009).
  28. Gagne, J. P., Hendzel, M. J., Droit, A., Poirier, G. G. The expanding role of poly(ADP-ribose) metabolism: current challenges and new perspectives. Curr Opin Cell Biol. 18 (2), 145-151 (2006).
  29. Bonicalzi, M. E., Haince, J. F., Droit, A., Poirier, G. G. Regulation of poly(ADP-ribose) metabolism by poly(ADP-ribose) glycohydrolase: where and when?. Cell Mol Life Sci. 62 (7-8), 739-750 (2005).
  30. Brochu, G., et al. Mode of action of poly(ADP-ribose) glycohydrolase. Biochim Biophys Acta. 1219 (2), 342-350 (1994).
  31. Thomassin, H., Menard, L., Hengartner, C., Kirkland, J. B., Poirier, G. G. Poly(ADP-ribosyl)ation of chromatin in an in-vitro poly(ADP-ribose)-turnover system. Biochim Biophys Acta. 1137 (2), 171-181 (1992).
  32. Kratz, A., et al. A multi-scale map of protein assemblies in the DNA damage response. Cell Syst. 14 (6), 447-463.e8 (2023).
  33. Li, J., et al. NAD(+) bioavailability mediates PARG inhibition-induced replication arrest, intra S-phase checkpoint and apoptosis in glioma stem cells. NAR Cancer. 3 (4), zcab044 (2021).
  34. Khan, M. M., et al. DNA polymerase beta expression in head and neck cancer modulates the poly(ADP-ribose)-mediated replication checkpoint. DNA Repair (Amst). 150, 103853 (2025).
  35. Ibrahim, M., et al. Replication-associated base excision repair/single-strand break repair regulates PARG inhibitor response via the PRMT1/PRMT5/ATR axis. NAR Cancer. 7 (4), zcaf057 (2025).
  36. Acharya, G., et al. CHK1 inhibitor induced PARylation by targeting PARG causes excessive replication and metabolic stress and overcomes chemoresistance in ovarian cancer. Cell Death Discov. 10 (1), 278 (2024).
  37. Al-Rahahleh, R. Q., et al. Overexpression of the WWE domain of RNF146 modulates poly-(ADP)-ribose dynamics at sites of DNA damage. DNA Repair (Amst). 150, 103845 (2025).
  38. He, F., et al. Structural insight into the interaction of ADP-ribose with the PARP WWE domains. FEBS Lett. 586 (21), 3858-3864 (2012).
  39. Wang, Z., et al. Recognition of the iso-ADP-ribose moiety in poly(ADP-ribose) by WWE domains suggests a general mechanism for poly(ADP-ribosyl)ation-dependent ubiquitination. Genes Dev. 26 (3), 235-240 (2012).
  40. DaRosa, P. A., et al. Allosteric activation of the RNF146 ubiquitin ligase by a poly(ADP-ribosyl)ation signal. Nature. 517 (7533), 223-226 (2015).
  41. Kang, H. C., et al. Iduna is a poly(ADP-ribose) (PAR)-dependent E3 ubiquitin ligase that regulates DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14103-14108 (2011).
  42. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  43. Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).
  44. Inanc, B., et al. TRIP12's role in the governance of DNA polymerase beta involvement in DNA damage response and repair. Nucleic Acids Res. 53 (12), gkaf574 (2025).
  45. Li, J., et al. Overcoming temozolomide resistance in glioblastoma via enhanced NAD(+) bioavailability and inhibition of poly-ADP-ribose glycohydrolase. Cancers (Basel). 14 (15), 3572 (2022).
  46. Yang, Y., Zhang, N., Zhang, G., Sauve, A. A. NRH salvage and conversion to NAD(+) requires NRH kinase activity by adenosine kinase. Nat Metab. 2 (4), 364-379 (2020).
  47. Yang, Y., Mohammed, F. S., Zhang, N., Sauve, A. A. Dihydronicotinamide riboside is a potent NAD(+) concentration enhancer in vitro and in vivo. J Biol Chem. 294 (23), 9295-9307 (2019).
  48. Nowak, K., et al. Engineering Af1521 improves ADP-ribose binding and identification of ADP-ribosylated proteins. Nat Commun. 11 (1), 5199 (2020).
  49. Kalisch, T., Ame, J. C., Dantzer, F., Schreiber, V. New readers and interpretations of poly(ADP-ribosyl)ation. Trends Biochem Sci. 37 (9), 381-390 (2012).
  50. Barkauskaite, E., et al. The recognition and removal of cellular poly(ADP-ribose) signals. FEBS J. 280 (15), 3491-3507 (2013).
  51. Karlberg, T., Langelier, M. F., Pascal, J. M., Schuler, H. Structural biology of the writers, readers, and erasers in mono- and poly(ADP-ribose) mediated signaling. Mol Aspects Med. 34 (6), 1088-1108 (2013).
  52. Krietsch, J., et al. Reprogramming cellular events by poly(ADP-ribose)-binding proteins. Mol Aspects Med. 34 (6), 1066-1087 (2013).
  53. Li, M., Lu, L. Y., Yang, C. Y., Wang, S., Yu, X. The FHA and BRCT domains recognize ADP-ribosylation during DNA damage response. Genes Dev. 27 (16), 1752-1768 (2013).
  54. Teloni, F., Altmeyer, M. Readers of poly(ADP-ribose): designed to be fit for purpose. Nucleic Acids Res. 44 (3), 993-1006 (2016).
  55. Furman, J. L., Mok, P. W., Shen, S., Stains, C. I., Ghosh, I. A turn-on split-luciferase sensor for the direct detection of poly(ADP-ribose) as a marker for DNA repair and cell death. Chem Commun (Camb). 47 (1), 397-399 (2011).
  56. Krastev, D. B., et al. Coupling bimolecular PARylation biosensors with genetic screens to identify PARylation targets. Nat Commun. 9 (1), 2016 (2018).
  57. Serebrovskaya, E. O., et al. Genetically encoded fluorescent sensor for poly-ADP-ribose. Int J Mol Sci. 21 (14), 5004 (2020).
  58. Challa, S., et al. Development and characterization of new tools for detecting poly(ADP-ribose) in vitro and in vivo. Elife. 11, e72464 (2022).
  59. Hanzlikova, H., et al. The importance of poly(ADP-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication. Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Активация PARP1ответ на генотоксиныполи-АДФ-рибозаответ на повреждение ДНКфлуоресцентный репортерный анализконфокальная микроскопиялентивирусная трансдукцияанализ в ImageJколичественное определение PAR-фокусов
Визуализация и количественный анализ активации PARP1/PARP2, индуцированной генотоксином, в клетках с помощью репортера на основе флуоресцентного синтеза белка
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.