Методическая статья

Оптимизированный протокол по инфекции Candida albicans в среднесредиземноморье Schmidtea для изучения патогенезов грибков и защиты хозяина

DOI:

10.3791/70500

⸱

17 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Health Sciences Research Institute, University of California, Merced, 4Center for Cellular and Biomolecular Machines, University of California, Merced

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предоставляет оптимизированное и подробное руководство по использованию планарной среднеземной системы Schmidtea в качестве модельной системы для изучения взаимодействий хозяина и патогена во время грибковой инфекции. Метод основан на предыдущей процедуре заражения планарийцев грибковым патогеном человека Candida albicans, предоставляя подробные рекомендации для повышения воспроизводимости и экспериментальной консистенции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans — распространённый оппортунистический грибной патоген, который бессимптомно колонизирует большинство людей. Хотя дисбиоз обычно является доброкачественным, вызванный употреблением антибиотиков, нарушением иммунной работы или нарушением эпителиального барьера, может вызвать чрезмерный рост грибков и инфекцию — от поверхностных заболеваний слизисти до опасного для жизни системного кандидоза. Для анализа патогенеза C. albicans in vivo требуются новые доклинические модели инфекции на различных стадиях инфекции и с разными измеримыми исходами для хозяина. Планарий Schmidtea mediterranea ранее был установлен как беспозвоночный хозяин для изучения взаимодействий хозяина и патогена во время заражения C. albicans . S. mediterranea полностью опирается на сохранённые врожденные иммунные механизмы, способные преодолевать инфекцию патогенными микроорганизмами, включая бактерии и грибы. Выдающаяся регенеративная способность планарийцев и доступные популяции стволовых клеток делают этот организм удобной моделью для анализа ранних иммунных ответов, восстановления тканей и очищения патогенов in vivo. Эта модель поддерживает одновременный анализ вирулентности грибков и транскрипционных ответов хозяина, предоставляя ценные данные о динамике инфекции. Здесь был представлен обновлённый протокол с детальными изменениями, стандартизированными процедурами и оптимизированными этапами для заражения S. mediterranea C. albicans , предназначенный для повышения воспроизводимости и обеспечения систематических исследований грибкового патогенеза и защиты хозяина.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans — распространённый оппортунистический грибковый патоген, который бессимптомно заселяет 50-70% людей 1,2,3. Обычно безвредные комменсалы C. albicans могут перерасти при таких условиях, как дисбаланс микробиоты, использование антибиотиков, иммуносупрессия, нарушение эпителиального барьера или наличие медицинских устройств, что приводит к заболеваниям от поверхностных слизистых инфекций до опасного для жизни системного кандидоза 4,5. У людей с ослабленным иммунитетом — включая людей с ВИЧ/СПИДом, пациентов, проходящих химиотерапию или иммуносупрессивную терапию, людей с хроническими заболеваниями или тех, кто находится в отделениях интенсивной терапии — уровень смертности может превышать 70%, что подчёркивает значительную нагрузку инвазивного кандидоза для общественного здоровья 6,7,8. В мире инвазивные грибковые инфекции ежегодно затрагивают более 6,5 миллионов человек, при этом прямые расходы на здравоохранение только в США превышают 8 миллиардов долларов в год для инфекций, связанных с Кандидой, 9,10 миллиардов. Несмотря на доступные противогрибковые методы, показатели заболеваемости и смертности, связанные с инфекциями C. albicans, оставались в основном неизменными десятилетиями, что подчёркивает острую необходимость лучшего понимания взаимодействия хозяина и патогена при грибковых заболеваниях.

C. albicans использует разнообразный набор факторов вирулентности, которые поддерживают колонизацию, устойчивость и патогенез в различных условиях хозяина. К ним относятся адгезия к тканям хозяина, уклонение от иммунитета, ремоделирование клеточной стенки, секреция гидролитических ферментов, морфологическая пластичность и формированиебиопленок 11,12,13,14,15,16. В совокупности эти признаки позволяют C. albicans адаптироваться к разнообразным нишам хозяев, модулировать иммунные ответы и сопротивляться противогрибковой терапии 16,17,18,19,20,21. Объяснение того, как эти процессы формируют исходы инфекции — включая заболеваемость, смертность хозяина и устранение патогена — крайне важно для разработки более эффективных профилактических и терапевтических стратегий.

Для изучения динамики хозяина и патогена мы создали модельную систему, используя планарную Schmidtea mediterranea в качествехозяина 22,23,24. Эта модель служит универсальной платформой для изучения мультисистемного ответа хозяина на грибковую инфекцию, используя метод заражения на основе замачивания, который позволяет синхронно подвергать животных воздействию C. albicans. В следующем разделе представлены обновлённые пошаговые процедуры, которые усовершенствуют этот протокол, повышают воспроизводимость и способствуют согласованному внедрению в лабораториях.

Планарии — это свободно живущие беспозвоночные с исключительной регенеративной способностью, способные быстро восполнять ткани, потерянные из-за травм илиинфекции 25. Они лишены адаптивной иммунной системы и полностью полагаются на консервативные врожденные защитные механизмы — включая рецепторы распознавания образов, антимикробные пептиды, секрецию слизи и фагоцитарные клетки — чтобы очистить бактериальные и грибковые патогены втечение 26, 27, 28 и 29 дней. Поскольку врождённый иммунитет является первой линией защиты эукариот и остаётся недостаточно изученным вне млекопитающих27, планарии предоставляют возможность изучать эти процессы in vivo с клеточным и молекулярным разрешением. Их регенеративная способность обусловлена взрослыми плюрипотентными стволовыми клетками, известными как необласты, которые составляют примерно 30% взрослых клеток и способствуют восстановлению послезаражения 23,30. Эти особенности делают S. mediterranea мощной моделью для вскрытия вирулентности патогена и защиты хозяина на генетическим, клеточном, тканевом и организмном уровнях, позволяя нам решать вопросы, которые часто трудно изучать с помощью традиционных млекопитающих.

Кроме того, небольшой размер планарийцев (обычно несколько миллиметров в длину), низкая стоимость и простотаобслуживания поддерживают масштабные эксперименты, избегая финансовых, этических и регуляторных ограничений, присущих моделям позвоночных. Как и C. albicans, S. mediterranea геномно обработан, имеет полностью секвенированный и аннотированный геном, а также поддерживает передовые молекулярные и клеточные методы — включая транскрипционное профилирование, высокоразрешающую иммуногистохимию и гистологию, а также устойчивую РНК-интерференцию (РНКi)32,33,34,35,36,37,38. Эти инструменты позволяют параллельно анализировать реакции хозяина и патогена во время инфекции.

Для изучения грибковых инфекций использовалось несколько альтернативных доклинических моделей. Беспозвоночные хозяева, такие как Galleria mellonella (восковая мотыль), Caenorhabditis elegans (круглый червь) и Drosophila melanogaster (плодовая мушка), а также позвоночный Danio rerio (данио-рерио), каждый из них обладает особыми экспериментальными преимуществами, но также имеет заметные ограничения. Эти системы часто опираются на выживаемость как на основную конечную точку, поскольку инфекции быстро вызывают гибель хозяина, препятствуя детальной оценке заболеваемости, восстановлению и мультисистемных реакций — особенности, которые планарная модель легко отражает.

Модели млекопитающих, такие как Mus musculus (мышь), Rattus norvegicus (крыса), Oryctolagus cuniculus (кролик) и Cavia porcellus (морская свинка), более точно отражают физиологию человека, но ограничены высокими затратами, малыми размерами когорт, этическими и нормативными требованиями, а также сложностью различия врождённых от адаптивных иммунных ответов. Кроме того, десятилетия исследований грибкового патогенеза у мышей в основном сосредоточены на поздних стадиях системныхинфекций 39,40,41,42,43, часто упуская из виду ранние события, такие как нарушение эпителиального барьера и чрезмерный рост слизисты — наиболее распространённые пути возникновения грибковых заболеваний у человека 44,45,46.

Изучение взаимодействий хозяина и патогена важно для понимания биологических процессов, лежащих в основе вирулентности грибов, защиты хозяина и прогрессирования заболевания. Инвазивные грибковые инфекции представляют растущую глобальную угрозу, при этом многие виды уже проявляют устойчивость ко всем основным классам противогрибковых препаратов. По оценкам, более 1 миллиарда человек страдают от грибковых инфекций, а такие факторы, как изменение климата, широкое использование антимикробных препаратов и растущее число людей с ослабленным иммунитетом, ускоряют появление противогрибковых устойчивыхпатогенов 47, 48, 49, 50. Понимание того, как патогенные грибы колонизируют и взаимодействуют со своими хозяевами, крайне важно для разработки новых профилактических и терапевтических стратегий.

Ниже описывается пересмотренный и стандартизированный системный протокол инфекции взаимодействия S. mediterranea-C. albicans, направленный на стимулирование воспроизводимости и систематическое исследование грибкового патогенеза и защитных механизмов хозяина. Первоначальный протокол был использован в предыдущих публикациях22, 23, 24. Таблица 1 суммирует ключевые обновления, включённые в эту пересмотренную версию, включая улучшения процедур вакцинации грибов, уменьшение объёмов скважин, определённые критерии включения животных, определение инфекционных и летальных доз, а также обновленные рекомендации по животноводству. Этот рабочий процесс даёт подробные рекомендации по культивированию C. albicans, заражению планариев через замачивание и оценке вирулентности грибов и реакций хозяина с помощью качественных и количественных показаний при симптоматических и летальных дозах (Рисунок 1). Оптимизированные процедуры, представленные здесь, включают переменные, эмпирически выявленные как ключевые факторы, определяющие динамику инфекции и исходы хозяина, что повышает воспроизводимость и позволяет систематически оценивать взаимодействия хозяина и патогена.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол основывается на предыдущих методах22, 23, 24 и устанавливает чёткие, стандартизированные процедуры для повышения воспроизводимости и обеспечения систематического исследования грибкового патогенеза и реакции хозяина у S. mediterranea. Ключевые усовершенствования протокола включают заранее определённые критерии включения и исключения животных, стандартизированную микробную подготовку и всестороннюю оценку конечных точек хозяина.

Все процедуры должны выполняться с использованием соответствующих стерильных и асептических методов биобезопасности уровня 2. Стандартные лабораторные средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая перчатки, лабораторный халат и обувь с закрытым носком, должны быть ношены постоянно. Процедуры, связанные с планарным видом S. mediterranea , проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по этическому использованию беспозвоночных.

Все усовершенствования протокола приведены в таблице 1. Все реагенты, критически важное оборудование, а также среды, буферы и рецепты иммунокрашивки перечислены в Таблице материалов и Таблице 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, связанные с беспозвоночной моделью животных S. mediterranea , должны проводиться с целью обеспечения высочайших стандартов благополучия животных. S. mediterranea следует содержать в оптимальных условиях, имитирующих естественные среды обитания. Эксперименты должны быть разработаны так, чтобы минимизировать потенциальную боль или страдания, чтобы обеспечить этичное лечение на протяжении всего исследования.

1. Культивирование грибов

  1. Информация о штаммах C. albicans
    1. Стандартный лабораторный штамм C. albicans SN25051 использовался как дикий тип для всех экспериментов и доступен в Центре генетики грибков (http://www.fgsc.net/). SN250 получен из клинического изолята SC5314, изначально взятого из посева крови пациента с диссеминированнымкандидозом 52.
    2. Штаммы C. albicans поддерживаются в виде запасов 25% глицерина при −80°C.
  2. Культивирование штаммов C. albicans для инфицирования
    1. Полосы из криогенного запаса
      1. Используя стерильный аппликатор, нанесите желаемый штамм из бульона −80°C на агарные пластины с дрожжевым пептонным экстрактом (YPD) (1% экстракт дрожжей, 2% пептона, 2% глюкозы; pH 6,8).
      2. Инкубировать статически при 30°C в течение 72 часов.
  3. Подготовка ночных культур
    1. Инокулировать одну колонию в жидкую YPD объемом 4 мл в стерильных боросиликатных стеклянных пробирках (18 мм × 150 мм) с помощью стерильной апликаторной палочки.
    2. Включить отрицательную контрольную трубку с непрививённым YPD при аналогичных условиях.
    3. Слабо закрывайте трубки для аэрации и инкубируйте ночью (16 часов) при 30 °C с встряхиванием на 220 об/мин (орбитальный) в трясещем инкубаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если микробный рост происходит в отрицательной контроли, прекратите эксперимент и возобновите с использованием новых средств и стерильной техники.
  4. Сбор и промывка ячеек
    1. С помощью асептической техники переносите культуры в маркированные центрифугные трубки объемом 15 мл.
    2. Центрифуга культивирует в течение 5 минут при ~3 000 × г для гранулирования клеток.
    3. Аккуратно удалите супернатант YPD, не нарушая гранулу.
    4. Повторно суспензировать гранулу в планарной воде (см. таблицу 2 для состава) в объёме, равном используемому YPD.
    5. Тщательно перемешайте с помощью вихря.
    6. Повторите шаги 1.4.2-1.4.4 ещё дважды, чтобы полностью удалить растительную среду.
    7. После финальной промывки заново подвесьте клеточную гранулу в свежей планарной воде путём вихря.
  5. Количественная оценка концентрации клеток C. albicans
    1. Разбавление для измерения OD
      1. Подготовьте три стерильные микроцентрифугные трубки по 1,7 мл с разбавлением 1:20 (культура 50 мкл + 950 мкл планарной воды) или альтернативным выбранным фактором разбавления. Тщательно перемешайте.
      2. Подготовьте пустую трубку с 1000 мкл планарной водой.
    2. Спектрофотометрия
      1. Настройте спектрофотометр на измерение оптической плотности на 600 нм (OD 600).
      2. Заглушить спектрофотометр планарной водой.
      3. ИзмерьтеOD 600 для каждого разбавлённого образца и запишите значения.
      4. Усредняйте три показания и умножьте на коэффициент разбавления, чтобы определитьOD 600 в бульевой культуре. ПреобразоватьOD 600 в концентрацию ячейки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: коэффициент преобразования оптической плотности должен определяться эмпирически для каждого спектрофотометра. Исходя из конкретного инструмента,OD 600 из 1 соответствует примерно 2 клеткам ×10 7 C. albicans /mL 53.
  6. Определение экспериментальных концентраций инокулюма
    1. Подготовьте желаемую концентрацию инокуля для каждого экспериментального состояния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите как минимум три биологических репликации для определения эффективной дозы для планарной колонии, особенно для инфекционных или летальных конечных точек. Репрезентативный расчёт для подготовки концентраций инфекционных и летальных инокулумов приведен в Дополнительном файле 1.

2. Планарные виды и поддержание

  1. Планарные виды и поддержание
    1. Для всех экспериментов используйте бесполую клональную линию CIW4 планарного S. mediterranea .
    2. Содержать планарные колонии в прозрачных пищевых пластиковых контейнерах с 1 500–2 000 мл 1× планарной воды.
    3. Держите контейнеры в темноте при температуре 20 °C с крышками слабо закрытыми для газообмена.
    4. Не лечите планарийцев антибиотиками.
  2. Содержание и кормление колонии
    1. Кормите колонии свежим процеженным пюре из говяжьей печени раз в неделю.
    2. Мойте контейнеры два раза в неделю.
    3. Поддерживайте плотность планарии на уровне 200–400 животных в контейнере. Предыдущие исследования демонстрируют подробные процедуры подготовки колонии и долгосрочногосодержания 31.
  3. Кондиционирование до эксперимента
    1. Перед экспериментальной инфекцией планарии голодают 7–12 дней для стандартизации метаболических и размерных условий.
    2. Используйте группы по 5–10 животных в каждой скважине для каждого экспериментального состояния. Обеспечьте равное количество животных во всех условиях, включая положительный и отрицательный контроль.
  4. Выбор размера животных
    1. Отобранные планарии длиной примерно 5 мм, что соответствует ~5 × 105 клеток хозяев наживотное 54.
    2. Избегайте использования планарий меньше 5 мм, так как животные такого размера могут включать особей с бластемами или неполным развитием, что может давать непоследовательные результаты.
    3. Избегайте использования планарий размером более 5 мм, так как крупные животные менее подходят для флуоресцентного иммуноокрашивания.
    4. Используйте планарии длиной примерно 5 мм при установлении условий инфекционной дозы (ID50) и летальной дозы (LD50).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения единообразного выбора размеров распечатайте сетку отсчёта 5 мм × 5 мм и поместите её в пластиковый конвертер под прозрачным планарным контейнером. Убедитесь, что планарии полностью вытянуты перед измерением длины.
  5. Критерии здоровья и включения
    1. КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Изучите все планарии под стереомикроскопом перед использованием.
    2. Исключайте животных с видимыми повреждениями или травмами, включая следующие состояния:
      1. Наличие бластем (ткани без пигментации) или неполное развитие пигментации.
      2. Аномальная пигментация, например, значительно более тёмные участки.
      3. Отсутствуют или повреждаются ткани.
      4. Поражения или рубцы.
      5. Открытые раны.
      6. Морфологические аномалии или деформации.
      7. Любое хроническое или не заживающее состояние.
    3. Исключайте животных с нарушениями развития.
      1. Разделённые или дублированные области головы или хвоста.
      2. Деформированная или асимметричная морфология тела.
      3. Неправильное количество фоторецепторов (допустима только одна двусторонняя пара).
      4. Аномально расположенная глотка.
      5. Дефектная ресничка приводит к снижению подвижности или нерегулярному планированию.
    4. Включайте только животных длиной примерно 5 мм, полностью развитых и не имеющих видимых повреждений или аномалий.
  6. Подготовка тарелки
    1. Переместить здоровые планарии, соответствующие всем критериям включения, в 2 мл свежей планарийной воды на скважину в 6-колодцевую полистироловую пластину без тканевой культуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переведите животных за день до заражения, чтобы обеспечить адаптацию к новой среде и плотности популяции.
    2. Назначайте скважины для следующих экспериментальных условий:
      1. Отрицательный контроль: неинфицированные или имитированные животные.
      2. Положительные контрольные: животные, инфицированные диким типом C. albicans.
    3. Удалите и замените всю воду на 2 мл пресной планарийской воды для обеспечения равномерности между колодцами.

3. Установка инфекции

  1. Подготовьте прививку (см. Дополнительный файл 1 для примера расчёта)
    1. Используя асептическую технику, аккуратно удалите всю воду с пластины с 6 колодцами, наклонив её к пользователю.
    2. Добавьте рассчитанный объём планарной воды в каждую скважину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Делайте шаг за шагом, чтобы животные не высыхали.
    3. Добавьте рассчитанный объём культуры C. albicans в каждую скважину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте длительного воздействия воздуха животных, так как сушка может вызвать стресс и повлиять на исход инфекции.
  2. Условия экспериментальной инкубации плит
    1. Поставьте инокулированную пластину с 6 лунками в тёмном, статичном месте при комнатной температуре.
    2. Поддерживайте экспериментальные плиты в отдельной зоне от незаражённых планарных колоний, чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение.
    3. Запишите дату и время вакцинации (обозначено как время 0 часа).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте зон с интенсивным движением или вибрацией (например, ящики, поверхности для приборов или оживлённые рабочие столы), так как движение может напрягать животных и запутать результаты.
    4. Инкубировать планарии с C. albicans до 72 часов, в зависимости от желаемой конечной точки.
  3. Ресуспензия грибковых клеток
    1. В каждом моменте аккуратно подвесьте устоявшиеся клетки C. albicans , не беспокоя планарии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время (часы [h] или дни [d] после заражения) — это время, прошедшее с момента первого контакта (время 0).
    2. Через 24 часа после заражения (HPI)
      1. Используя стерильную трансферную пипетку объемом 3 мл, слегка наклоните пластину к пользователю.
      2. Вдыхайте планарную воду и аккуратно выпустите её в участок колодца, свободный от животных, чтобы смешать оседшийся грибной слой.
      3. Повторяйте этот шаг 5–10 раз за каждую яму, чтобы разрушить осевший грибной слой, избегая прямого контакта с планариями.
      4. Наблюдайте за осадкой грибов на тёмном фоне для лучшей видимости до и после этапов подвески.
      5. Приостановить незаражённые контрольные скважины при аналогичных условиях.
    3. При мощности 48 hpi
      1. Повторите процедуру повторного подвески, описанную выше.
      2. Выполните все этапы реанимации в течение ± 1 часа от установленного времени.
  4. Конец экспозиции (72 hpi)
    1. При мощности 72 hpi аккуратно переведите планарии на новую пластину с 6 колодцами, содержащую по 2 мл свежей планарной воды на каждую скважину.
    2. Минимизировать перенос грибковой культуры, используя минимальный объём жидкости.
    3. После переноса животных удалите всю воду и замените её свежей планарной водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно обращайтесь с животными и фрагментами тканей, чтобы избежать механических повреждений или дополнительного напряжения.

4. Оценка конечной точки хозяина

  1. Запись результатов хозяев
    1. Начинайте оценивать результаты хозяина через 1 день после заражения (dpi) и продолжайте ежедневно до желаемой экспериментальной точки.
    2. Количественно оцените урон хозяина с помощью стандартизированной системы оценки 0–3 (рисунок 2).
      Балл 0: Нет изменений по сравнению с неинфицированными контролями (здоровые, бессимптомные).
      Оценка 1: Лёгкие симптомы.
      Оценка 2: Тяжёлые симптомы.
      Счёт 3: Смерть.
  2. Критерии оценки симптомов хозяина
    1. Балл 0 (бессимптомный):
      1. Определите животных с нормальной морфологией, пигментацией, поведением и отзывчивостью без заметных изменений по сравнению с неинфицированными контролями.
    2. Оценка 1 (Мягкая):
      Присваивайте лёгкую оценку, если по крайней мере один из следующих симптомов наблюдается относительно бессимптомной контрольной группы.
      1. Снижение скорости движения или аномальное планирование.
      2. Частичная или полная потеря фототактической реакции.
      3. Продолжительные или повторяющиеся схватки тела.
      4. Аномальная или неравномерная пигментация (светлые или тёмные участки).
      5. Регрессия ткани головы или хвоста.
    3. Оценка 2 (Тяжёлая):
      Назначайте тяжёлую оценку, если один или несколько из следующих симптомов присутствуют, пока животные живы.
      1. Пленка глаза или потеря одного или обоих глаз.
      2. Полная потеря головы или заметное повреждение передней части тканей.
      3. Значительная потеря ткани в префарингеальной области.
      4. Фрагментация на несколько областей тела (головные, глоточные или задние сегменты).
      5. Открытые раны с секрецией слизи или внутренней протечкой или без неё.
      6. Частичный лизис тканей, приводящий к потере структурной целостности.
      7. «С-образная» поза тела, паралич или сильное нарушение подвижности.
    4. Счёт 3 (Смерть):
      Определите смерть по одному или нескольким из следующих критериев.
      1. Полная ткань или лизис целого животного.
      2. Полная потеря реакции на стимулы.
      3. Неспособность восстановиться или регенерировать.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 2 содержит репрезентативные изображения и определяющие признаки для каждой оценки, чтобы обеспечить последовательную классификацию фенотипов хозяина.

5. Определение выживаемости хозяина после воздействия грибков

  1. При 3 dpi аккуратно перенесите планарии на новую пластину с 6 колодцами, содержащую по 2 мл свежей планарной воды на каждую скважину, чтобы избежать переноса остаточной грибной культуры.
  2. Наблюдайте животных с помощью световой микроскопии (≥ 10x объектива).
  3. Фиксируйте результаты хоста с использованием стандартизированного таблицы оценок, предоставленного в Дополнительном файле 2.
  4. Определение живых животных
    1. Идентифицируйте живых животных по одному или нескольким из следующих критериев.
      1. Негативный фототаксис.
      2. Реакция на мягкое возмущение пипетки переноса.
      3. Целое строение тела.
      4. Стабильное крепление к пластине.
  5. Определение мёртвых животных
    1. Идентифицируйте мёртвых животных по одному или нескольким из следующих критериев.
      1. Полный лизис или дезинтеграция (только остаточный мусор).
      2. Прозрачное или выпотрошенное тело.
      3. Отсутствие движения или реакции на стимулы.
      4. Отсутствие регенерации (отсутствие образования бластемы).
  6. Удаление мёртвых животных
    1. Удаляйте мёртвые животные и мусор только после подтверждения нежизнеспособности при микроскопии.
    2. КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Немедленно удалять мёртвых животных, чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение или изменение показателей выживаемости.
    3. Если остались остатки или грибковые остатки, переместите выживших животных обратно на свежую плиту с чистой планарной водой, чтобы предотвратить повторный посев C. albicans или образование биопленки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время визуального осмотра разместите пластины с 6 колодцями на тёмном фоне для улучшения контраста и облегчения оценки фенотипа.

6. Оценка грибковой нагрузки

  1. Количественная оценка единицы формирования колоний (CFU)
    1. В нужные моменты заражения собирайте планарий (от 5 до 10 животных на каждое состояние в день). Включайте совпадение с неинфицированными/имитационными контролями и дикими инфицированными контролями.
    2. Аккуратно промыйте колодцы два раза 2 мл свежей планарной воды, чтобы удалить фоновые клетки C. albicans .
    3. Переведите планарии в стерильные и маркированные микроцентрифугные трубки объемом 1,7 мл или 5,0 мл и удалите всю остаточную воду.
    4. Добавьте 300 мкл свежей планарийской воды в каждую трубку.
    5. Животных гомогенизируют с помощью стерильного пестика, пока не останется крупных фрагментов (примерно 30–45 с).
    6. Выполните последовательные разбавления гомогената (например, 1:10, 1:100, 1:100).
    7. Пластинка 100–200 мкл каждого разбавления на агарные пластины YPD дополняется по 50 мкг/мл ампициллина, рифампицина, стрептомицина и неомицина. Равномерно распределяйте с помощью стерильных стеклянных бусинок или стерильного клеточного распределителя.
    8. Оставьте пластины вертикально на столе 5–10 минут после нанесения пластин, чтобы жидкость могла впитаться в агар.
    9. Подготовьте трёхэкзовые тарелки для каждого разбавления и условия.
    10. Инкубировать тарелки при 30 °C в течение 48 часов.
    11. Посчитайте CFU и умножьте на коэффициент разбавления.
    12. Нормализуйте значения CFU к количеству планарианцев, чтобы рассчитать средние CFU на планарию по условиям. Например, если наблюдается 100 колоний при разбавлении 10× от гомогената из 5 животных, рассчитанное значение составляет 200 CFU на животное.

7. Иммунофлуоресцентное окрашивание против кандиды

  1. Общие соображения по окрашиванию
    1. Выполняйте все этапы с лёгким покачиванием орбиты (100–140 об/мин) при комнатной температуре, если не указано иное. См. дополнительный файл 1 для информации об антителах и источниках реагентов.
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид, додецилсульфат натрия (SDS) и перекись водорода являются опасными химикатами и должны использоваться в соответствии с институциональными нормами безопасности. Формальдегид токсичен и классифицируется как канцероген; SDS — это раздражитель; а перекись водорода — это сильный окиситель, который может вызывать ожоги. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты (лабораторный халат, нитриловые перчатки, обувь с закрытыми носками и защитные очки). Выполнять процедуры с использованием летучих реагентов в сертифицированной химической вытяжке и утилизировать отходы в соответствии с институциональными рекомендациями по охране окружающей среды и безопасности.
  2. Сбор образцов
    1. Собирайте животных из каждого экспериментального состояния и временной точки.
    2. Переместить животных в маркированные сцинтилляционные флаконы объёмом 20 мл с 2 мл планарной воды.
    3. Удалите всю жидкость, прополосните один раз 2 мл свежей планарической воды, затем снова всю жидкость.
  3. Фиксация и проницаемость
    1. Жертвовать животных в 7,5% N-ацетилцистеина (NAC) за 1× PBS в течение 3 минут.
    2. Удалите раствор и зафиксируйте животных в 4% формальдегиде в 0,3% PBSTx на 15 минут.
    3. Промывайте образцы дважды с 1× PBS.
    4. Пермеабилизуйте образцы в 1% SDS в течение 15 минут.
    5. Промывайте образцы три раза с 1× PBS.
  4. Отбеливание
    1. Отбеливатель пробирует 6% перекиси водорода в течение 1× PBS под ярким светодиодным светом в течение 4–12 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если отбеливание не может начаться немедленно, храните фиксированные образцы в 1× PBS при 4 °C до 1 недели или обезвоживайте образцы в 100% метаноле для длительного хранения.
  5. Блокировка и инкубация антител
    1. Переместить животных на пластины с 24 лунками, содержащие 1× PBS.
    2. Блокировать неспецифическое связывание в 2,5% PBS-TB (PBS, содержащий тритон X-100 и бычий сывороточный альбумин) в течение 4 часов при комнатной температуре или 8 часов при 4 °C.
    3. Инкубировать образцы с первичным антителом к кандидозу (1:500 в PBS-TB) в течение 4 часов при комнатной температуре или 8 часов при 4 °C.
    4. Удалять образцы первичных антител и промывки восемь раз в 20 минут с 0,3% PBSTx (всего ~2,5 часа).
    5. Инкубировать образцы с вторичным антителом, сопряжённым с Alexa-568 (1:800 в PBS-TB) в течение 4 часов при комнатной температуре или 8 часов при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите образцы от света, чтобы предотвратить фотоотбеливание. Растворы антител могут использоваться повторно.
    6. Удалять вторичные образцы антител и промывку восемь раз в 20 минут с 0,3% PBSTx.
  6. Опциональное крепление затвора
    1. Поместите животных на микроскопическое стекло так, чтобы все они были ориентированы передней стороной вверх.
    2. Удалите лишнюю воду с помощью трансферной пипетки.
    3. Аккуратно впитывайте оставшуюся жидкость с краёв с помощью края бумажного полотенца.
    4. Добавляйте 150–175 мкл крепежной среды Gelvatol (Таблица 2 для состава) по каплю, пока животные полностью не покрыются.
    5. Аккуратно положите накладку на образец, чтобы избежать пузырьков воздуха.
    6. Дайте гельватолу затвердеть не менее 2 часов перед визуализацией.
    7. Магазинные слайды в прохладном, тёмном месте для долгосрочного сохранения.
  7. Визуализация
    1. Снимите образцы с использованием жёлто-зелёного возбуждения (~578 нм) и наблюдайте оранжево-красное излучение (~603 нм).
    2. Используйте объективную линзу 2x, чтобы визуализировать узоры окрашиваний целого животного.

8. Устранение неполадок

  1. Если исходы заражения непоследовательны, выполните кривую дозы-титрирования с использованием дикого типа SN250 или другого базового штамма с шагом в 5–10 × 107 клеток/мл.
  2. Проведите как минимум три биологических репликации с 5–10 животными в каждой группе.
  3. Включайте отрицательные и положительные контрольные группы для выявления потенциальных проблем, таких как перекрёстное загрязнение, сбой асептической техники, проблемы с жизнеспособностью штамма или плохое базовое состояние здоровья животных.
  4. После завершения эксперимента с дозой и титрированием пул повторяется для определения медианной выживаемости на группу.
  5. Анализируйте различия выживаемости с помощью логарифм-рангового анализа Мантел–Кокса.
  6. Используйте анализ выживаемости Каплана–Майера для оценки различий во времени смерти между штаммами или методами лечения.
  7. При сублетальных или инфекционных дозах анализируйте симптоматические исходы хозяина (например, лёгкие или тяжёлые фенотипы или колонизацию грибками) вместо выживаемости.
  8. Сравните реакции хозяина по группам доз, чтобы определить подходящий инфекционный или летальный диапазон доз для последующих экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен обновлённый протокол для заражения планарийцев C. albicans (рисунок 1) и систематической количественной оценки исходов хозяина (рисунок 2). Этот усовершенствованный рабочий процесс поддерживает надёжную оценку множества параметров инфекции, включая заболеваемость (симптоматическую тяжесть заболевания), выживаемость (летальность), грибковую нагрузку (CFUs) и пространственно-временную динамику колонизации пато...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изменение инфекционной дозы дикого типа C. albicans приводит к воспроизводимым, зависящим от дозы различиям в заболеваемости у S. mediterranea, что подчёркивает чувствительность модели к количественной оценке вирулентности грибов. Этот протокол определяет стратегии установления базовых инфекционных и летальных доз в лабораторно поддерживаемых планарных колониях и предлагает критерии подтверждения успешной системной инфекции посредством замачивания, интегрируя оценку здо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.J.N. является соучредителем компании BioSynesis, Inc., разрабатывающей диагностику и лечение биопленочных инфекций. Все остальные авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят всех членов лабораторий Нобиле, Овьедо и Херндей за содержательные обсуждения модели инфекции S. mediterranea-C. albicans и выражают благодарность Эдельвейс Пфистер за управление лабораторией и обслуживание планарии. Эта работа была поддержана наградами R35GM156045 и R35GM124594 C.J.N., а также R35GM158501 и R01GM132753 N.J.O. Эта работа также была поддержана семьёй Камангар в виде учреждённой кафедры C.J.N. N.M.S. была поддержана стипендиями Центра клеточных и биомолекулярных машин (CCBM), Национального научного фонда (NSF), Центра исследовательского превосходства в науке и технологиях (CREST) по грантам NSF-HRD-1547848 и NSF-EES-2112675.

Спонсоры не участвовали в проектировании исследования, сборе и анализе данных, интерпретации данных, написании рукописи или решении о публикации результатов. N.M.S. признаёт использование ChatGPT для помощи в редактировании рукописи (проверка орфографии, грамматики, форматирования и структуры предложений).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,7 мл микроцентрифугных трубок VWR/Genemate490004-436-BOXOF500Чисто, коробка на 500 штук
Флаконы по 20 мл сцинтиллонаFisher Scientific12-100-006Прозрачные стеклянные бутылки для иммунного окрашивания
Необработанные полистироловые пластины с 24 скважиныFisher Scientific08-772-51Иммунокраска
5,0 мл микроцентрифугных трубок Эппендорф/Сигма ОлдричEP0030119487-200EAПрозрачно, коробка на 200 штук
6-колодящие, необработанные полистиролные пластиныFisher Scientific08-772-49Анализы инфекций
АгарVWR89405-066Бактериологическая оценка среды YPD
Палочки-аппликаторыТермо Фишер/Пуритан22-029-491C. albicans культивирование
BioRenderBioRender Inc.Н/ДПрограммное обеспечение для дизайна фигур, используемое для создания схемных иллюстраций
Хлорид кальция (CaCl2)Сигма-ОлдричC5080-500GПланарийская вода/1x Монжуиумль; c-соли
Candida albicans поликлональные антитела против кролика, IgGТермо ФишерPA1-27158Иммунокраска
Центрифугные трубкиVWR89039-664C. albicans сбор
Культивные трубки боросиликатного стекла 18x150 ммVWR47729-583C. albicans культивирование
КюветтыFisher Scientific14-955-127Для измерения оптической плотности культур
Декстроза (D-глюкоза)Fisher ScientificD16-3Среда YPD
ГлицеринFisher ScientificG33-4Молекулярно-биологический класс в дополнение для криогенного хранения C. albicans 
Инструмент построения графиков и визуализации данныхGraphPad/PrismСтатистическое программное обеспечение и инструмент визуализации. Verison 10.6.1.
Инструмент построения графиковRСтатистическое программное обеспечение. Verison 4.4.3.
Шейкер инкубатораЭппендорфEPM1282-0004-1EANew Brunswick Innova 44/44R для<эм> культивирование C. albicans
Хлорид магния (MgCl2)SigmaM8266-100GДля планарной воды   (1x Montjuï c-соли)
Сульфат магния (MgSO4)Сигма-ОлдричM7506-500GДля планарной воды   (1x Montjuï c-соли)
Микроскопические слайдыVWR16004-368
Мультизум-микроскопNikonNikon AZ100 
N-ацетил-L-цистеинСигма ОлдричA7250-50GМуколитический и жертвенный реагент   Фиксация
Парамальдегид, 16% раствор, молекулярно-биологический классНауки об электронной микроскопии15710Фиксационный реагент
Беспроводной мотор с пеллетным пестикомFisher Scientific12-141-361Планарная гомогенизация
Пептон, бактериологический классHIMEDIA/VWR89129-480Среда YPD
ПестлыFisher Scientific12-141-368Одноразовые гранулы без РНазы для планарной гомогенизации
Чашки Петри, 100 x 15 ммVWR25384-342
Поли (виниловый спирт)Сигма-ОлдричP-8136 Для Gelvatol
Хлорид калия (KCl)Sigma Life ScienceP9541-500GПланарная среда/вода  (1x Montjuï c-соли)
Вторичный антител Козий анти-кролик, IgG, Alexa Fluor 568Fisher ScientificA-11011Иммунокраска
SN250Центр генетики грибковДикий тип C. albicans strain (https://www.fgsc.net/)
Натрий АзидFisher ScientificS227-100Для Gelvatol
Бикарбонат натрия (NaHCO3)Сигма-ОлдричS5761-1KGПланарная среда/вода  (1x Montjuï c-соли)
Хлорид натрия (NaCl)Sigma Life ScienceS3014-500GПланарная среда/вода  (1x Montjuï c-соли)
СпектрофотометрAgilent26354Microplate BioTek Epoch 2 для измерения оптической плотности
Статический инкубаторFisher Scientific15-015-2634C. albicans культивирование
Трансферные пипеткиFisher Scientific13-711-9CMСтерильные одноразовые градуированные пипетты для переносящихся планарийцев
База ТрисСигма-Олдрич252859Для Gelvatol
Экстракт дрожжейТермо Фишер212750Среда YPD

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Delavy, M., et al. Unveiling Candida albicans intestinal carriage in healthy volunteers: the role of micro- and mycobiota, diet, host genetics and immune response. Gut Microbes. 15 (2), 2287618(2023).
  2. Bays, D. J., Savage, H. P. Candida albicans gastrointestinal colonization resistance: a host-microbiome balancing act. Infect Immun. 93 (9), e0061024(2025).
  3. Nash, A. K., et al. The gut mycobiome of the Human Microbiome Project healthy cohort. Microbiome. 5 (1), 153(2017).
  4. Fróis-Martins, R., Lagler, J., LeibundGut-Landmann, S. Candida albicans virulence traits in commensalism and disease. Curr Clin Microbiol Rep. 11 (4), 231-240 (2024).
  5. Kumamoto, C. A., Gresnigt, M. S., Hube, B. The gut, the bad and the harmless: Candida albicans as a commensal and opportunistic pathogen in the intestine. Curr Opin Microbiol. 56, 7-15 (2020).
  6. Fisher, M. C., et al. Tackling the emerging threat of antifungal resistance to human health. Nat Rev Microbiol. 20 (9), 557-571 (2022).
  7. Gow, N. A. R., et al. The importance of antimicrobial resistance in medical mycology. Nat Commun. 13 (1), 5352(2022).
  8. Lockhart, S. R., Chowdhary, A., Gold, J. A. W. The rapid emergence of antifungal-resistant human-pathogenic fungi. Nat Rev Microbiol. 21 (12), 818-832 (2023).
  9. Denning, D. W. Global incidence and mortality of severe fungal disease. Lancet Infect Dis. 24 (7), e428-e438 (2024).
  10. Benedict, K., Jackson, B. R., Chiller, T., Beer, K. D. Estimation of direct healthcare costs of fungal diseases in the United States. Clin Infect Dis. 68 (11), 1791-1797 (2019).
  11. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
  12. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 71-92 (2015).
  13. Höfs, S., Mogavero, S., Hube, B. Interaction of Candida albicans with host cells: virulence factors, host defense, escape strategies, and the microbiota. J Microbiol. 54 (3), 149-169 (2016).
  14. Talapko, J., et al. Candida albicans—the virulence factors and clinical manifestations of infection. J Fungi. 7 (2), 79(2021).
  15. Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
  16. Gaffar, N. R., Valand, N., Venkatraman Girija, U. Candidiasis: insights into virulence factors, complement evasion and antifungal drug resistance. Microorganisms. 13 (2), 272(2025).
  17. Xie, J., et al. White-opaque switching in natural MTLa/α isolates of Candida albicans: evolutionary implications for roles in host adaptation, pathogenesis, and sex. PLoS Biol. 11 (3), e1001525(2013).
  18. Costa-de-Oliveira, S., Rodrigues, A. G. Candida albicans antifungal resistance and tolerance in bloodstream infections: the triad yeast-host-antifungal. Microorganisms. 8 (2), 154(2020).
  19. Whaley, S. G., et al. Azole antifungal resistance in Candida albicans and emerging non-albicans Candida species. Front Microbiol. 7, 2173(2017).
  20. Marichal, P., et al. Contribution of mutations in the cytochrome P450 14α-demethylase to azole resistance in Candida albicans. Microbiology. 145 (10), 2701-2713 (1999).
  21. Lee, Y., Robbins, N., Cowen, L. E. Molecular mechanisms governing antifungal drug resistance. npj Antimicrob Resist. 1 (1), 5(2023).
  22. Maciel, E. I., Jiang, C., Barghouth, P. G., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. The planarian Schmidtea mediterranea is a new model to study host-pathogen interactions during fungal infections. Dev Comp Immunol. 93, 18-27 (2019).
  23. Maciel, E. I., Valle Arevalo, A., Ziman, B., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. Epithelial infection with Candida albicans elicits a multi-system response in planarians. Front Microbiol. 11, 629526(2021).
  24. Maciel, E. I., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. A planarian model system to study host-pathogen interactions. Methods Mol Biol. 2680, 231-244 (2023).
  25. Sánchez Alvarado, A. Planarian regeneration: its end is its beginning. Cell. 124 (2), 241-245 (2006).
  26. Sluys, R., Riutort, M. Planarian diversity and phylogeny. Methods Mol Biol. 1774, 1-56 (2018).
  27. Riera Romo, M., Pérez-Martínez, D., Castillo Ferrer, C. Innate immunity in vertebrates: an overview. Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).
  28. Peiris, T. H., Hoyer, K. K., Oviedo, N. J. Innate immune system and tissue regeneration in planarians: an area ripe for exploration. Semin Immunol. 26 (4), 295-302 (2014).
  29. Kangale, L. J., Raoult, D., Fournier, P. E., Abnave, P., Ghigo, E. Planarians as an emerging model organism for investigating innate immune mechanisms. Front Cell Infect Microbiol. 11, 619081(2021).
  30. Karami, A., Tebyanian, H., Goodarzi, V., Shiri, S. Planarians: an in vivo model for regenerative medicine. Int J Stem Cells. 8 (2), 128-133 (2015).
  31. Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. Establishing and maintaining a colony of planarians. Cold Spring Harb Protoc. 2008 (10), (2008).
  32. Ivanković, M., et al. A comparative analysis of planarian genomes reveals regulatory conservation in the face of rapid structural divergence. Nat Commun. 15, 8215(2024).
  33. Fincher, C. T., Wurtzel, O., De Hoog, T., Kravarik, K. M., Reddien, P. W. Cell type transcriptome atlas for the planarian Schmidtea mediterranea. Science. 360 (6391), eaaq1736(2018).
  34. Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods Mol Biol. 1774, 455-466 (2018).
  35. Rouhana, L., et al. RNA interference by feeding in vitro-synthesized double-stranded RNA to planarians: methodology and dynamics. Dev Dyn. 242 (6), 718-730 (2013).
  36. Winsor, L., Sluys, R. Basic histological techniques for planarians. Methods Mol Biol. 1774, 285-351 (2018).
  37. Lu, J., et al. 3D reconstruction of neuronal allometry and neuromuscular projections in asexual planarians using expansion tiling light sheet microscopy. eLife. 13, e101103(2025).
  38. Rink, J. C., Vu, H. T. K., Alvarado, A. S. The maintenance and regeneration of the planarian excretory system are regulated by EGFR signaling. Development. 138 (17), 3769-3780 (2011).
  39. Fajardo, P., Cuenda, A., Sanz-Ezquerro, J. J. A mouse model of candidiasis. Methods Mol Biol. 2321, 63-74 (2021).
  40. Singh, S., Singh, S., Kumar, A. Systemic Candida albicans infection in mice causes endogenous endophthalmitis via breaching the outer blood-retinal barrier. Microbiol Spectr. 10 (4), e01658-e01722 (2022).
  41. Spellberg, B., Ibrahim, A. S., Edwards, J. E., Filler, S. G. Mice with disseminated candidiasis die of progressive sepsis. J Infect Dis. 192 (2), 336-343 (2005).
  42. Andes, D. Use of an animal model of disseminated candidiasis in the evaluation of antifungal therapy. Methods Mol Biol. 118, 111-128 (2005).
  43. Spellberg, B., et al. Parenchymal organ, and not splenic, immunity correlates with host survival during disseminated candidiasis. Infect Immun. 71 (10), 5756-5764 (2003).
  44. Clinical overview of invasive candidiasis. , Centers for Disease Control and Prevention. Available at: https://www.cdc.gov/candidiasis/hcp/clinical-overview/index.html (2024).
  45. Kobayashi, G. S. Medical microbiology. , NCBI Bookshelf. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8103/ (1996).
  46. Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 18026(2018).
  47. Van Rhijn, N., Rhodes, J. Evolution of antifungal resistance in the environment. Nat Microbiol. 10 (8), 1804-1815 (2025).
  48. Brown, G. D., et al. The pathobiology of human fungal infections. Nat Rev Microbiol. 22 (11), 687-704 (2024).
  49. Osset-Trénor, P., Pascual-Ahuir, A., Proft, M. Fungal drug response and antimicrobial resistance. J Fungi. 9 (5), 565(2023).
  50. Yan, Z. Z., et al. Environmental microbiome, human fungal pathogens, and antimicrobial resistance. Trends Microbiol. 33 (1), 112-129 (2025).
  51. Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network. PLoS Genet. 5 (12), e1000783(2009).
  52. Noble, S. M., French, S., Kohn, L. A., Chen, V., Johnson, A. D. Systematic screens of a Candida albicans homozygous deletion library decouple morphogenetic switching and pathogenicity. Nat Genet. 42 (7), 590-598 (2010).
  53. Gulati, M., et al. In Vitro Culturing and Screening of Candida albicans Biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60(2018).
  54. Takeda, H., Nishimura, K., Agata, K. Planarians Maintain a Constant Ratio of Different Cell Types During Changes in Body Size by Using the Stem Cell System. Zoological Science. 26 (12), 805-813 (2009).
  55. Roberts-Galbraith, R. H. RNAi screening to assess tissue regeneration in planarians. Methods Mol Biol. 2450, 509-527 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи