Методическая статья

Валидация случайной интеграции и экспрессии трансгенов у паразитов эймерии

DOI:

10.3791/70509

⸱

5 июня 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Veterinary Public Health Security, Key Laboratory of Animal Epidemiology and Zoonosis of Ministry of Agriculture, National Animal Protozoa Laboratory & College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, 2College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем стандартизированный метод валидации интеграции и экспрессии чужеродных генов у трансгенных паразитов Eimeria . Интегрируя геномные и белковые анализы, этот рабочий процесс подтверждает стабильное вставление и экспрессию генов. Такой подход способствует разработке трансгенной эймерии для исследований и применения вакцин.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Валидация трансгенных паразитов Eimeria необходима для подтверждения стабильной геномной интеграции и экспрессии экзогенных генов. Этот протокол описывает комплексный рабочий процесс для проверки вставки трансгенов и экспрессии белков у Eimeria tenella. Процедура начинается с извлечения геномной ДНК из спорулированных ооцист, затем амплификации ПЦР для предварительной проверки наличия целевого фрагмента. Для дальнейшего подтверждения геномной интеграции проводится ресеквенирование целого генома для выявления сайтов вставки и оценки стабильности интегрированной конструкции в геноме паразита. Экспрессия белка затем исследуется с помощью западного блоттинга лизатов, приготовленных из очищенных спорозоитов, что позволяет обнаружить целевого рекомбинантного белка. Кроме того, внутриклеточная локализация визуализируется с помощью косвенного иммунофлуоресцентного анализа (IFA) с использованием инфицированных клеток хозяина. Вместе эти анализы обеспечивают надёжную и воспроизводимую основу для валидации трансгенных линий Eimeria . Этот рабочий процесс обеспечивает надёжное подтверждение интеграции генома и экспрессии белков, тем самым поддерживая дальнейшие применения в генетической манипуляции, функциональной геномике и разработке вакцин, направленных против паразитов эймерии .

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кокцидиоз, вызванный видами Eimeria, представляет собой одно из наиболее значимых экономически значимых паразитарных заболеваний у птицы, приводящее к снижению веса, плохой конверсии корма и глобальным финансовым потерям, оценивающимся в миллиарды долларовежегодно 1,2,3. Генетическая манипуляция паразитами Eimeria стала мощным инструментом как для фундаментальных исследований, так и для разработки вакцин 4,5,6. Стабильная трансфекция позволяет интегрировать и экспрессировать экзогенные гены, такие как флуоресцентные репортеры или защитные антигены, что позволяет визуализировать развитие паразитов в реальном времени и целенаправленную оценку кандидатов на вакцины 7,8,9.

Предыдущая публикация Дуана и др. предоставила стандартизированный протокол нуклеофекции и in vivo распространения трансгенной эймерии, установив эффективный метод генерации и обогащения рекомбинантных паразитическихлиний 10. Однако в настоящее время не существует единого рабочего процесса для подтверждения стабильной геномной интеграции и функциональной экспрессии трансгенов. Такая валидация крайне важна для обеспечения аутентичности, стабильности и воспроизводимости трансгенных линий, используемых для биологических исследований или применения вакцин.

В этой статье представлен полный, пошаговый протокол валидации интеграции и экспрессии трансгена в Eimeria tenella с использованием трансгенной линии E. tenella , экспрессирующей антиген VP2 вируса инфекционного бурсального заболевания (IBDV) (Et-VP2) в качестве модели11. Плазмида экспрессии p5′AMic2linkerVP2m3′A, несущая ген VP2 и репортер mCherry, была трансфектована в дикие E. tenella sporozoites (Et-WT). Красные флуоресцентные ооцисты были выделены методом флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) и последовательно проходили у кур без кокцидий. Этот рабочий процесс демонстрирует процедуры экстракции геномной ДНК, предварительного интеграционного анализа на основе ПЦР, ресеквенирования целого генома для выявления сайтов вставки, вестерн-блоттинга для проверки экспрессии белков и косвенного иммунофлуоресцентного анализа (IFA) для визуализации внутриклеточной локализации рекомбинантного белка. Вместе эти методы обеспечивают воспроизводимую и комплексную основу для подтверждения подлинности трансгенных линий Eimeria , что позволяет их надежно использовать в исследованиях функциональной геномики и разработке вакцин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных с участием кур были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Китайского сельскохозяйственного университета (номер одобрения: CAU20160628-2). Все процедуры по уходу и экспериментам проводились в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу и использованию животных Китайского сельскохозяйственного университета и соответствовали Международным руководящим принципам биомедицинских исследований с участием животных. В этом исследовании использовались семидневные самцы белого леггорна, свободного от патогенов (SPF). Птицы содержались в стандартных условиях содержания с свободным доступом к корму и воде на протяжении всего экспериментального периода. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Извлечение геномной ДНК из спорулированных ооцист видов Eimeria.

  1. Перенесите 1 мл суспензии ооцисты (≥1 × 107/мл) в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл. Добавьте равный объём стеклянных бусинок размером 1 мм, соответствующие грануле ооцисты. Разрушайте ооцисты с помощью тканевого гомогенизатора, интенсивно бить шариками при частоте 60 Гц в течение 5 минут, пока стенки ооцисты полностью не сломаются и содержимое не будет высвобождено.
  2. Соберите смесь (исключая стеклянные бусины) в новую трубку и центрифугуйте при 12 000 x g на 1 минуту. Сбросьте супернатант, добавьте 500 мкл CTAB-буфера и 40 мкл протеиназы K, и инкубуйте смесь при 60 °C в течение 30 минут.
  3. Добавьте 500 мкл фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1), вихрь на 10 с и центрифугу при 12 000 x г в течение 5 минут. Перенесите верхнюю водную фазу в новую трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотно закройте и сбросьте трубку с органическим слоем, чтобы предотвратить загрязнение окружающей среды. (По желанию) Если уровень загрязнения белками остаётся высоким, повторяйте шаг 1.3 1–2 раза дольше.
  4. Добавьте 500 мкл хлороформа: изоамил-спирт (24:1), вихрь на 10 с и центрифугу при 12 000 x г в течение 5 минут. Перенесите водную фазу в новую трубку и добавьте равный объём изопропанола. Смешивайте по инверсии, пока не появится осадок ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осадки при −20 °C в течение ≥1 часа или ночью увеличивают урожай.
  5. Центрифугу с концентрацией 12 000 г в течение 10 минут для гранулирования ДНК. Промой гранулы с 70% этанола, центрифугой при 12 000 г в течение 5 минут и выбрось супернатант. Аккуратно удаляйте остаточную жидкость вакуумным насосом и сушите гранулы на воздухе при комнатной температуре 37 °C.
  6. Растворить высушенную ДНК-гранулу в буфереddH 2Oили TE, содержащую РНазу. Инкубировать при 37 °C в течение ≥1 часа или при 4 °C ночью для удаления остаточной РНК. Храните очищенную ДНК при −20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для долгосрочного сохранения нерастворённые гранулы ДНК могут храниться непосредственно при температурах −20 °C или −80 °C. Оценить целостность и концентрацию ДНК с помощью электрофореза агарозным гелем перед последующим применением.

2. ПЦР-проверка наличия конструкции Et-VP2 в геноме паразита

  1. Пары проектных праймеров (Таблица 1) для проверки геномной интеграции конструкции Et-VP2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности грунтовки были разработаны с использованием Primer-BLAST с типичными параметрами длины грунта 18–24 bp, температурой плавления примерно 55–60 °C и минимальным вторичным образованием. Специфика каждой пары праймеров дополнительно проверялась по геному Eimeria tenella , чтобы избежать неспецифической амплификации.
  2. Приготовьте реакционную смесь объёмом 50 мкл, содержащую 25 мкл смеси Taq Master Mix 2×, 21 мкл ddH₂O, по 1 мкл прямых и обратно праймеров, а также 2 мкл ДНК-шаблона.
  3. Выполнить амплификацию с использованием следующих термических циклических условий: начальная денатурация при 95 °C в течение 5 минут; 30 циклов при температуре 95 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 1 минуты; затем следовало финальное удлинение при 72 °C на 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все реагенты тщательно смешаны перед термическим циклом. Используйте свежеприготовленные ДНК-шаблоны для достижения оптимальной эффективности амплификации.

3. Повторное секвенирование линии трансгенных паразитов (Et-VP2)

  1. Подача образцов и создание библиотеки
    1. Отправьте суспензию ооцисты объемом 1 мл (≥1 × 107/мл) коммерческому поставщику услуг секвенирования для анализа повторного секвенирования следующего поколения.
    2. После оценки качества геномной ДНК фрагментируйте ДНК с помощью механического нарушения с помощью ультразвука. Очистить фрагментированную ДНК, выполнить ремонт концов, добавить адениновую (A) основу к 3′-концам и лигировать адаптеры секвенирования.
    3. Выберите фрагменты ДНК желаемого размера с помощью электрофореза агарозного геля и выполните амплификацию ПЦР для создания библиотеки секвенирования.
    4. Подвергайте построенную библиотеку проверке качества. Выполните парное секвенирование на платформе Illumina NovaSeq с длиной считывания 150 bp. Поддерживайте глубину секвенирования 100× чтобы обеспечить точность данных, генерируя не менее 6 ГБ исходных данных с минимальным показателем качества Q20 >90%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте все реагенты и образцы ДНК с помощью асептических методов для предотвращения загрязнения. Проверьте, что параметры секвенирования соответствуют требуемым метрикам глубины и качества, прежде чем приступать к анализу данных.
  2. Анализ данных
    1. Отфильтруйте исходные данные секвенирования с помощью программного обеспечения Fastp (v0.23.2) по следующимкритериям 12:
      1. Удалите последовательности адаптеров.
      2. Установить порог низкого качества на Q20 и удалить чтения, при которых низкокачественные базы составляют более 30% от общей длины чтения.
      3. Удалите показания короче 50 ударов (bp).
    2. Выровнять считывания с контролем качества с эталонным геномом E. tenella (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1) с помощью программного обеспечения Bowtie2 (v2.4.5)13. Случайность данных секвенирования следующего поколения оценивается на основе глубины покрытия и равномерности.
    3. Убедитесь, что чтения секвенирования выровнены с трансгенной векторной последовательностью. Удалить риды, которые не отображают область T-ДНК, чтобы получить химерные риды, при которых один конец отображается в T-ДНК, а другой — на референсный геном E. tenella .
    4. На основе последовательностей химерных считываний выполните выравнивание с помощью ToxoDB (релиз 64) для определения конкретного расположения потенциальных сайтов вставки T-ДНК. Анализировать глубину секвенирования по гомологичным областям между вектором и геномом Eimeria (то есть регуляторные области 5′ и 3′) с помощью программного обеспечения Mosdepth (v0.3.3)14.
    5. Определить потенциальные участки интеграции трансгенной плазмиды в геноме E. tenella и проверить их с помощью ПЦР с использованием реакционной системы, описанной на шаге 2.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте последовательное использование версий программного обеспечения и настроек параметров на протяжении всего анализа для поддержания точности и воспроизводимости данных.

4. Вестерн-блоттинг трансгенных белков Eimeria

  1. Соберите PBS-суспензию, содержащую не менее 5 × 106 спорозоитов, в центрифугную трубку на 1,5 мл и центрифугуйте при 2500 x г в течение 5 минут. Суспензируйте гранулу в буфере RIPA на 100 мкл и инкубуйте на льду в течение 1 часа. Добавьте 20 мкл 6× буфера с нагрузкой белка и нагрейте смесь при 100 °C в течение 10 минут.
  2. Подготовьте гели SDS-PAGE с помощью стеклянной пластины диаметром 1,5 мм. Корректируйте концентрацию акриламида в зависимости от молекулярной массы целевого белка. Во время полимеризации наложите разделительный гель дистиллированной водой, чтобы обеспечить ровную поверхность перед добавлением геля.
  3. Центрифугуйте лизат при концентрации 10 000 г в течение 5 минут и загрузите 40 мкл супернатанта в каждую полосу проб. Загрузите 10 мкл белкового маркера в отдельную линию, а оставшиеся линии заполните 40 мкл буфера 1× в качестве контроля.
  4. Проводите электрофорез в буфере 1× при 70 В в течение 20 минут, затем 120 В в течение 60–90 минут, пока фронт красителя не достигнет низа геля.
  5. Вырезать гель в соответствии с ожидаемым объёмом белка. Предварительно активируйте мембрану PVDF в метаноле на 1 минуту и соберите сэндвич для переноса в следующем порядке: губка, фильтрующая бумага, гель (катодная сторона), мембрана PVDF, фильтрующая бумага, губка. Удалите любые пузырьки воздуха и перенесите белки при 70 В в течение 3 часов в буфере для переноса.
  6. Промыйте мембрану три раза PBST (по 5 минут каждая) и заблокируйте 5% обезжиренным молоком на 1 час при комнатной температуре или на ночь при 4 °C. Промыйте мембрану дважды PBST, чтобы удалить остаточный блокирующий раствор.
  7. Инкубировать мембрану первичными антителами, разбавленными в буфере антител: у мыши поликлональный анти-Flag (1:2000) и у мыши моноклональный анти-GAPDH (1:2000). Инкубировать 1 час при комнатной температуре или на ночь при 4 °C с лёгким встряхиванием. Соберите раствор антитела и промите мембрану PBST пять раз (по 5 минут каждая).
  8. Инкубировать мембрану с помощью козьего противомышиного IgG (1:2000) в течение 1 часа при комнатной температуре. Промыйте мембрану пять раз PBST (по 5 минут каждая).
  9. Подготовьте подложку ECL, смешивая равные объемы раствора A и B. Равномерно наносите субстрат на мембрану и обнаружите белковые сигналы с помощью системы хемилюминесцентной визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы, связанные с образцами белка на льду, если не указано иное. Используйте субстраты с метанолом и ECL в вытяжной вытяжке, надевая перчатки и защитные очки.

5. Внутриклеточный косвенный иммунофлуоресцентный анализ (IFA) трансгенной эймерии

  1. Очистка спорозоитов с помощью хроматографической колонки
    1. Подключите хроматографическую колонку к перистальтическому насосу и отрегулируйте расход на 50–60 Гц. Промыйте колонку дистиллированной водой и раствором глицина.
    2. Добавьте суспензию целлюлозы DE-52 в колонку с непрерывным добавлением раствора глицина до тех пор, пока слой целлюлозы не достигнет примерно 1 см в высоту.
    3. Загрузите спорозоиты, очищенные методом Перколля, на колонну. Поддерживайте расход 30–40 Гц с использованием раствора глицина и собирайте поток в центрифугную трубку на 50 мл.
    4. Контролируйте элюат, нанося капли на стеклянное стекло для микроскопического наблюдения. Если спорозоиты не обнаружены, остановите насос. Центрифугуйте собранную фракцию при 2 500 г в течение 5 минут, сбросьте супернатант и снова суспензуйте гранулу в PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы в стерильных условиях, чтобы предотвратить микробное загрязнение. Утилизировать отходы глицина и Перколя в соответствии с институциональными нормами биобезопасности.
  2. Инфекция клеток HFF спорозоитом
    1. Семя 1 × 106 спорозоитов в 24-колодцевые пластины, содержащие монослои клеток HFF. Добавьте пенициллин-стрептомицин до конечной концентрации 1× (100 U/mL пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина), аккуратно перемешайте и инкубируем при 37 °C в течение 4–6 часов, чтобы дать возможность вторжения. Снимите среду, смойте один раз с 1 мл PBS и выбросьте супернатант.
    2. Аккуратно вынимите стеклянные крышки из колодцев с помощью стерильных щипцов и перенесите их на свежую пластину на 24 лунки. Зафиксируйте образцы в 1 мл 4% параформальдегида на 30 минут, промывайте один раз с 1 мл PBS и выбросьте супернатант.
    3. Пермеабилизуйте клетки с помощью 1 мл 0,25% Triton X-100 на 30 минут. Помой один раз с 1 мл PBS и выбрось супернатант.
    4. Заблокируйте образцы 1 мл 3% BSA на 30 минут. Помой один раз с 1 мл PBS и выбрось супернатант.
    5. Разбавленный моноклональный анти-флаг антитела у мыши (1:200) в 3% BSA. Капли разбавленного антитела нанесите на герметичную пленку и инвертируйте капли (клеточной стороной вниз) на капли. Инкубировать покрытия в увлажнённой камере при 37 °C в течение 1 часа. Постирайте три раза с 1 мл PBS (по 5 минут каждая).
    6. Разбавленные FITC-конъюгированные козы против мышей IgG (1:200) и Hoechst 33258 (1:100) в 3% BSA. Капли морилки наносят на герметичную плёнку и переверните капли на капли. Инкубировать в увлажнённой камере при 37 °C в течение 1 часа, затем промыть пять раз с 1 мл PBS (по 5 минут каждая).
    7. Крепите накладки на стеклянный затвор 5 мкл антифейда. Переверните накладку (ячеточную сторону вниз) на капель, избегая воздушных пузырьков, и герметизируйте края. Храните установленные затворы в увлажнённой камере при 4 °C до проведения визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с параформальдегидом и Triton X-100 в капюшоне для химических паров, надевая перчатки и защиту для глаз. Реагентные формулы, используемые в этой процедуре, приведены в таблице 2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Геномный ПЦР-анализ подтвердил наличие целевого фрагмента в трансгенных паразитах, в то время как соответствующие полосы не были обнаружены в диких типах контроля (рисунок 1A). Ресеквенирование целого генома дополнительно показало, что линеаризованная плазмида стабильно интегрирована в геном паразита, а прогнозируемый сайт интеграции был валидирован с помощью амплификации ПЦР в области соединения (рисунок 1B).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол устанавливает комплексный рабочий процесс для валидации геномной интеграции, экспрессии белков и внутриклеточной локализации экзогенных генов в трансгенных E. tenella. Вместо того чтобы полагаться на один анализ, подход объединяет геномные и белковые данные, обеспечивая как структурное подтверждение, так и функциональное выражение вставки трансгенов.

Несколько ключевых шагов в этом протоколе сильно влияют на успешную валидацию трансгенны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2023YFD1802400).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

```html

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Antifade Mounting MediumMCEHYK1042Флуоресцентное монтажное средство для предотвращения фотоотбеливания
BSA (3%)BeyotimeST023Блокирующий буфер и буфер для разведения антител для IFA; блокировка при комнатной температуре в течение 30 мин
Chloroform:isoamyl alcohol (24:1)SigmaC0549Реагент для удаления остаточного фенола при извлечении геномной ДНК
Coccidia-Free ChickensBoehringer-IngelheimSPFИспользуется для in vivo пассажирования и амплификации трансгенных штаммов; одобрено Этическим комитетом (номер одобрения: CAU20160628-2)
CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide)Merck KGaAH5882Компонент буфера для извлечения геномной ДНК; состав: 3 г CTAB + 12,27 г NaCl + 15 мл 1 моль/л Tris-HCl + 6 мл 0,5 моль/л ЭДТА, доведено до конечного объема 150 мл с ddH2O
DE-52 CelluloseSolarbioC8350Ионообменный хроматографический средство для очистки спорозоитов; последовательно обработанный NaOH, HCl и дистиллированной водой, затем эквилибрированный с глицериновым раствором
ECL Substrate (Solution A + Solution B)thermofisher32106Хемилюминесцентный реагент для обнаружения; перед использованием смешивайте равные объемы Solution A и B
FITC-Conjugated Goat Anti-Mouse IgGSigmaAP124FФлуоресцентное вторичное антитело для IFA, соотношение разбавления 1:200
Glass beadsSigmaZ250473-1PAK
Glycine SolutionSigma67419Буфер для эквилибрирования и элюирования хроматографических колонок; состав: 0,75 г глицина + 7,9 г NaCl, растворенных в 500 мл дистиллированной воды, рН настроен на 7,4-7,6, стерилизован в автоклаве
Hoechst 33258Sigma94403Реагент для окрашивания ядер, соотношение разбавления 1:100; используется для локализации IFA
HRP-Conjugated Goat Anti-Mouse IgGSigma12-349Вторичное антитело для вестерн-блоттинга, соотношение разбавления 1:2000
Illumina NovaSeq Sequencing PlatformPersonalbio Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China)Платформа секвенирования нового поколения; секвенирование с обеих концов (длина считывания 150 н.п.), глубина секвенирования 100×, получение ≥6 ГБ необработанных данных (Q20>90%)
Low Speed CentrifugeBEIJING ERA BEILI CENTRIFUGEDT5-2
Mouse Monoclonal Anti-Flag AntibodySigmaF1804Первичное антитело, соотношение разбавления 1:200; используется для обнаружения фьюжн-протеина с тегом Flag в IFA
Mouse Monoclonal Anti-GAPDH AntibodySigmaG8795Первичное антитело, соотношение разбавления 1:2000; используется в качестве контроля загрузки для вестерн-блоттинга
Nonfat Milk (5%)BeyotimeP0216Блокирующий буфер для вестерн-блоттинга; блокировка при комнатной температуре в течение 1 ч или 4°C на ночь
Paraformaldehyde (4%)Merck KGaA30525Раствор для фиксации клеток; фиксация при комнатной температуре в течение 30 мин
PBSSolarbioP1010
Penicillin-Streptomycin (100×)Yeasen60162ES76Антибиотик для культуры клеток; ингибирует микробиальное загрязнение
Percoll (DG gradient stockGE Healthcare17-0891-09
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)Merck KGaA77617Реагент для удаления белков при извлечении геномной ДНК
Protein Loading Buffer (6×)BeyotimeP0015FБуфер для нагрузки белков в электрофорез; состав: 100 мМ Трис (рН 6,8), 4% SDS, 2 мМ ЭДТА, 2% глицери, 6 М урея; перед использованием смешивается с 50 µл 2 М DTT и 50 µл 5% бромофенол синего
Proteinase KMerck KGaA39450-01-6200 мг, растворенных в 10 мл ddH2O, используется для ферментативного расщепления белков при извлечении геномной ДНК
PVDF Membranethermofisher88518Мембрана для переноса белков; активирована метанолом в течение 1 мин перед использованием
RIPA Lysis BufferYeasen20101Буфер для извлечения белков спорозоитов
RNase AMerck KGaA9001-99-425 мг, растворенных в 2,5 мл 0,01 моль/л NaAc, нагревается при 100°C в течение 10-15 мин, рН настроен на 7,4 с 1 моль/л Tris-HCl; используется для удаления РНК из образцов ДНК
SDS-PAGE Gel Reagents (Acrylamide, Bis-acrylamide, Tris, SDS, APS, TEMED)Bio101Реагенты для приготовления гелля для SDS-PAGE; концентрация акриламида настраивается в зависимости

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saeed, M., et al. Feeding the future: A new potential nutritional impact of Lactiplantibacillus plantarum and its promising interventions in future for poultry industry. Poult Sci. 104, 105130 (2025).
  2. Blake, D. P., et al. Re-calculating the cost of coccidiosis in chickens. Vet Res. 51 (1), 115 (2020).
  3. Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Vet Parasitol. 142 (1-2), 63-70 (2006).
  4. Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with yellow fluorescent protein as reporter and the endogenous development of the transgenic parasite. PLoS One. 9 (12), e114188 (2014).
  5. Hanig, S., et al. Chimeric fluorescent reporter as a tool for generation of transgenic Eimeria (Apicomplexa, Coccidia) strains with stage-specific reporter gene expression. Parasitol Int. 61 (3), 391-398 (2012).
  6. Tang, X. M., et al. Transgenic Eimeria tenella as a vaccine vehicle: Expressing TgSAG1 elicits protective immunity against Toxoplasma gondii infections in chickens and mice. Sci Rep. 6, 29379 (2016).
  7. Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Mol Biochem Parasitol. 162 (1), 77-86 (2008).
  8. Fatoba, A. J., Adeleke, M. A. Transgenic Eimeria parasite: A potential control strategy for chicken coccidiosis. Acta Trop. 205, 105417 (2020).
  9. Sun, Y. Y., et al. Immunogenicity and protection against infectious bursal disease via a transgenic Eimeria acervulina expressing IBDV VP2-2C3d fusion protein. Vaccine. 64, 127715 (2025).
  10. Duan, C. H., et al. Nucleofection and in vivo propagation of chicken Eimeria parasites. J Vis Exp. (156), e156 (2020).
  11. Liu, Y. H., et al. Construction and identification of transgenic Eimeria tenella expressing IBDV VP2 protein. J Anim Sci Vet Med. 57 (2), 1008-1016 (2026).
  12. Chen, S. F., et al. Fastp: An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
  13. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  14. Pedersen, B. S., Quinlan, A. R. Mosdepth: Quick coverage calculation for genomes and exomes. Bioinformatics. 34 (5), 867-868 (2018).
  15. Sun, Y. Y., et al. Dual-copy VP2 expressed with CTA1-DD in transgenic Eimeria acervulina confers partial protection against infectious bursal disease virus. Poult Sci. 105 (2), 106238 (2026).
  16. Guo, Q. B., et al. Oral delivery of Eimeria acervulina transfected sequentially with two copies of the VP2 gene induces immunity against infectious bursal disease virus in chickens. Front Vet Sci. 11, 1367912 (2024).
  17. Zhang, S. X., et al. Establishment of recombinant Eimeria acervulina expressing multi-copies M2e derived from avian influenza virus H9N2. Vaccines (Basel). 9 (7), 791 (2021).
  18. Li, Y. R., et al. Genetic manipulation for the non-model protozoan Eimeria: Advancements, challenges, and future perspective. iScience. 28 (3), 112060 (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Transgenic EimeriaGenomic IntegrationProtein ExpressionEimeria TenellaGenomic DNA ExtractionPCR AmplificationWhole Genome ResequencingWestern BlottingImmunofluorescence AssayRecombinant Protein Detection

Похожие статьи