Валидация случайной интеграции и экспрессии трансгенов у паразитов эймерии

Summary

Здесь мы представляем стандартизированный метод валидации интеграции и экспрессии чужеродных генов у трансгенных паразитов Eimeria . Интегрируя геномные и белковые анализы, этот рабочий процесс подтверждает стабильное вставление и экспрессию генов. Такой подход способствует разработке трансгенной эймерии для исследований и применения вакцин.

Abstract

Валидация трансгенных паразитов Eimeria необходима для подтверждения стабильной геномной интеграции и экспрессии экзогенных генов. Этот протокол описывает комплексный рабочий процесс для проверки вставки трансгенов и экспрессии белков у Eimeria tenella. Процедура начинается с извлечения геномной ДНК из спорулированных ооцист, затем амплификации ПЦР для предварительной проверки наличия целевого фрагмента. Для дальнейшего подтверждения геномной интеграции проводится ресеквенирование целого генома для выявления сайтов вставки и оценки стабильности интегрированной конструкции в геноме паразита. Экспрессия белка затем исследуется с помощью западного блоттинга лизатов, приготовленных из очищенных спорозоитов, что позволяет обнаружить целевого рекомбинантного белка. Кроме того, внутриклеточная локализация визуализируется с помощью косвенного иммунофлуоресцентного анализа (IFA) с использованием инфицированных клеток хозяина. Вместе эти анализы обеспечивают надёжную и воспроизводимую основу для валидации трансгенных линий Eimeria . Этот рабочий процесс обеспечивает надёжное подтверждение интеграции генома и экспрессии белков, тем самым поддерживая дальнейшие применения в генетической манипуляции, функциональной геномике и разработке вакцин, направленных против паразитов эймерии .

Introduction

Кокцидиоз, вызванный видами Eimeria, представляет собой одно из наиболее значимых экономически значимых паразитарных заболеваний у птицы, приводящее к снижению веса, плохой конверсии корма и глобальным финансовым потерям, оценивающимся в миллиарды долларов^{ежегодно 1,2,3}. Генетическая манипуляция паразитами Eimeria стала мощным инструментом как для фундаментальных исследований, так и для разработки вакцин ^4,5,6. Стабильная трансфекция позволяет интегрировать и экспрессировать экзогенные гены, такие как флуоресцентные репортеры или защитные антигены, что позволяет визуализировать развитие паразитов в реальном времени и целенаправленную оценку кандидатов на ^{вакцины 7,8,9}.

Предыдущая публикация Дуана и др. предоставила стандартизированный протокол нуклеофекции и in vivo распространения трансгенной эймерии, установив эффективный метод генерации и обогащения рекомбинантных паразитических^{линий 10}. Однако в настоящее время не существует единого рабочего процесса для подтверждения стабильной геномной интеграции и функциональной экспрессии трансгенов. Такая валидация крайне важна для обеспечения аутентичности, стабильности и воспроизводимости трансгенных линий, используемых для биологических исследований или применения вакцин.

В этой статье представлен полный, пошаговый протокол валидации интеграции и экспрессии трансгена в Eimeria tenella с использованием трансгенной линии E. tenella , экспрессирующей антиген VP2 вируса инфекционного бурсального заболевания (IBDV) (Et-VP2) в качестве модели¹¹. Плазмида экспрессии p5′AMic2linkerVP2m3′A, несущая ген VP2 и репортер mCherry, была трансфектована в дикие E. tenella sporozoites (Et-WT). Красные флуоресцентные ооцисты были выделены методом флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) и последовательно проходили у кур без кокцидий. Этот рабочий процесс демонстрирует процедуры экстракции геномной ДНК, предварительного интеграционного анализа на основе ПЦР, ресеквенирования целого генома для выявления сайтов вставки, вестерн-блоттинга для проверки экспрессии белков и косвенного иммунофлуоресцентного анализа (IFA) для визуализации внутриклеточной локализации рекомбинантного белка. Вместе эти методы обеспечивают воспроизводимую и комплексную основу для подтверждения подлинности трансгенных линий Eimeria , что позволяет их надежно использовать в исследованиях функциональной геномики и разработке вакцин.

Protocol

Все эксперименты на животных с участием кур были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Китайского сельскохозяйственного университета (номер одобрения: CAU20160628-2). Все процедуры по уходу и экспериментам проводились в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу и использованию животных Китайского сельскохозяйственного университета и соответствовали Международным руководящим принципам биомедицинских исследований с участием животных. В этом исследовании использовались семидневные самцы белого леггорна, свободного от патогенов (SPF). Птицы содержались в стандартных условиях содержания с свободным доступом к корму и воде на протяжении всего экспериментального периода. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Извлечение геномной ДНК из спорулированных ооцист видов Eimeria.

1. Перенесите 1 мл суспензии ооцисты (≥1 × 10⁷/мл) в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл. Добавьте равный объём стеклянных бусинок размером 1 мм, соответствующие грануле ооцисты. Разрушайте ооцисты с помощью тканевого гомогенизатора, интенсивно бить шариками при частоте 60 Гц в течение 5 минут, пока стенки ооцисты полностью не сломаются и содержимое не будет высвобождено.
2. Соберите смесь (исключая стеклянные бусины) в новую трубку и центрифугуйте при 12 000 x g на 1 минуту. Сбросьте супернатант, добавьте 500 мкл CTAB-буфера и 40 мкл протеиназы K, и инкубуйте смесь при 60 °C в течение 30 минут.
3. Добавьте 500 мкл фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1), вихрь на 10 с и центрифугу при 12 000 x г в течение 5 минут. Перенесите верхнюю водную фазу в новую трубку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плотно закройте и сбросьте трубку с органическим слоем, чтобы предотвратить загрязнение окружающей среды. (По желанию) Если уровень загрязнения белками остаётся высоким, повторяйте шаг 1.3 1–2 раза дольше.
4. Добавьте 500 мкл хлороформа: изоамил-спирт (24:1), вихрь на 10 с и центрифугу при 12 000 x г в течение 5 минут. Перенесите водную фазу в новую трубку и добавьте равный объём изопропанола. Смешивайте по инверсии, пока не появится осадок ДНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осадки при −20 °C в течение ≥1 часа или ночью увеличивают урожай.
5. Центрифугу с концентрацией 12 000 г в течение 10 минут для гранулирования ДНК. Промой гранулы с 70% этанола, центрифугой при 12 000 г в течение 5 минут и выбрось супернатант. Аккуратно удаляйте остаточную жидкость вакуумным насосом и сушите гранулы на воздухе при комнатной температуре 37 °C.
6. Растворить высушенную ДНК-гранулу в буфере_{ddH 2O}или TE, содержащую РНазу. Инкубировать при 37 °C в течение ≥1 часа или при 4 °C ночью для удаления остаточной РНК. Храните очищенную ДНК при −20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для долгосрочного сохранения нерастворённые гранулы ДНК могут храниться непосредственно при температурах −20 °C или −80 °C. Оценить целостность и концентрацию ДНК с помощью электрофореза агарозным гелем перед последующим применением.

2. ПЦР-проверка наличия конструкции Et-VP2 в геноме паразита

1. Пары проектных праймеров (Таблица 1) для проверки геномной интеграции конструкции Et-VP2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности грунтовки были разработаны с использованием Primer-BLAST с типичными параметрами длины грунта 18–24 bp, температурой плавления примерно 55–60 °C и минимальным вторичным образованием. Специфика каждой пары праймеров дополнительно проверялась по геному Eimeria tenella , чтобы избежать неспецифической амплификации.
2. Приготовьте реакционную смесь объёмом 50 мкл, содержащую 25 мкл смеси Taq Master Mix 2×, 21 мкл ddH₂O, по 1 мкл прямых и обратно праймеров, а также 2 мкл ДНК-шаблона.
3. Выполнить амплификацию с использованием следующих термических циклических условий: начальная денатурация при 95 °C в течение 5 минут; 30 циклов при температуре 95 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 1 минуты; затем следовало финальное удлинение при 72 °C на 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все реагенты тщательно смешаны перед термическим циклом. Используйте свежеприготовленные ДНК-шаблоны для достижения оптимальной эффективности амплификации.

3. Повторное секвенирование линии трансгенных паразитов (Et-VP2)

1. Подача образцов и создание библиотеки
   1. Отправьте суспензию ооцисты объемом 1 мл (≥1 × 10⁷/мл) коммерческому поставщику услуг секвенирования для анализа повторного секвенирования следующего поколения.
   2. После оценки качества геномной ДНК фрагментируйте ДНК с помощью механического нарушения с помощью ультразвука. Очистить фрагментированную ДНК, выполнить ремонт концов, добавить адениновую (A) основу к 3′-концам и лигировать адаптеры секвенирования.
   3. Выберите фрагменты ДНК желаемого размера с помощью электрофореза агарозного геля и выполните амплификацию ПЦР для создания библиотеки секвенирования.
   4. Подвергайте построенную библиотеку проверке качества. Выполните парное секвенирование на платформе Illumina NovaSeq с длиной считывания 150 bp. Поддерживайте глубину секвенирования 100× чтобы обеспечить точность данных, генерируя не менее 6 ГБ исходных данных с минимальным показателем качества Q20 >90%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте все реагенты и образцы ДНК с помощью асептических методов для предотвращения загрязнения. Проверьте, что параметры секвенирования соответствуют требуемым метрикам глубины и качества, прежде чем приступать к анализу данных.
2. Анализ данных
   1. Отфильтруйте исходные данные секвенирования с помощью программного обеспечения Fastp (v0.23.2) по следующим^{критериям 12}:
      1. Удалите последовательности адаптеров.
      2. Установить порог низкого качества на Q20 и удалить чтения, при которых низкокачественные базы составляют более 30% от общей длины чтения.
      3. Удалите показания короче 50 ударов (bp).
   2. Выровнять считывания с контролем качества с эталонным геномом E. tenella (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1) с помощью программного обеспечения Bowtie2 (v2.4.5⁾¹³. Случайность данных секвенирования следующего поколения оценивается на основе глубины покрытия и равномерности.
   3. Убедитесь, что чтения секвенирования выровнены с трансгенной векторной последовательностью. Удалить риды, которые не отображают область T-ДНК, чтобы получить химерные риды, при которых один конец отображается в T-ДНК, а другой — на референсный геном E. tenella .
   4. На основе последовательностей химерных считываний выполните выравнивание с помощью ToxoDB (релиз 64) для определения конкретного расположения потенциальных сайтов вставки T-ДНК. Анализировать глубину секвенирования по гомологичным областям между вектором и геномом Eimeria (то есть регуляторные области 5′ и 3′) с помощью программного обеспечения Mosdepth (v0.3.3)¹⁴.
   5. Определить потенциальные участки интеграции трансгенной плазмиды в геноме E. tenella и проверить их с помощью ПЦР с использованием реакционной системы, описанной на шаге 2.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте последовательное использование версий программного обеспечения и настроек параметров на протяжении всего анализа для поддержания точности и воспроизводимости данных.

4. Вестерн-блоттинг трансгенных белков Eimeria

1. Соберите PBS-суспензию, содержащую не менее 5 × 10⁶ спорозоитов, в центрифугную трубку на 1,5 мл и центрифугуйте при 2500 x г в течение 5 минут. Суспензируйте гранулу в буфере RIPA на 100 мкл и инкубуйте на льду в течение 1 часа. Добавьте 20 мкл 6× буфера с нагрузкой белка и нагрейте смесь при 100 °C в течение 10 минут.
2. Подготовьте гели SDS-PAGE с помощью стеклянной пластины диаметром 1,5 мм. Корректируйте концентрацию акриламида в зависимости от молекулярной массы целевого белка. Во время полимеризации наложите разделительный гель дистиллированной водой, чтобы обеспечить ровную поверхность перед добавлением геля.
3. Центрифугуйте лизат при концентрации 10 000 г в течение 5 минут и загрузите 40 мкл супернатанта в каждую полосу проб. Загрузите 10 мкл белкового маркера в отдельную линию, а оставшиеся линии заполните 40 мкл буфера 1× в качестве контроля.
4. Проводите электрофорез в буфере 1× при 70 В в течение 20 минут, затем 120 В в течение 60–90 минут, пока фронт красителя не достигнет низа геля.
5. Вырезать гель в соответствии с ожидаемым объёмом белка. Предварительно активируйте мембрану PVDF в метаноле на 1 минуту и соберите сэндвич для переноса в следующем порядке: губка, фильтрующая бумага, гель (катодная сторона), мембрана PVDF, фильтрующая бумага, губка. Удалите любые пузырьки воздуха и перенесите белки при 70 В в течение 3 часов в буфере для переноса.
6. Промыйте мембрану три раза PBST (по 5 минут каждая) и заблокируйте 5% обезжиренным молоком на 1 час при комнатной температуре или на ночь при 4 °C. Промыйте мембрану дважды PBST, чтобы удалить остаточный блокирующий раствор.
7. Инкубировать мембрану первичными антителами, разбавленными в буфере антител: у мыши поликлональный анти-Flag (1:2000) и у мыши моноклональный анти-GAPDH (1:2000). Инкубировать 1 час при комнатной температуре или на ночь при 4 °C с лёгким встряхиванием. Соберите раствор антитела и промите мембрану PBST пять раз (по 5 минут каждая).
8. Инкубировать мембрану с помощью козьего противомышиного IgG (1:2000) в течение 1 часа при комнатной температуре. Промыйте мембрану пять раз PBST (по 5 минут каждая).
9. Подготовьте подложку ECL, смешивая равные объемы раствора A и B. Равномерно наносите субстрат на мембрану и обнаружите белковые сигналы с помощью системы хемилюминесцентной визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы, связанные с образцами белка на льду, если не указано иное. Используйте субстраты с метанолом и ECL в вытяжной вытяжке, надевая перчатки и защитные очки.

5. Внутриклеточный косвенный иммунофлуоресцентный анализ (IFA) трансгенной эймерии

1. Очистка спорозоитов с помощью хроматографической колонки
   1. Подключите хроматографическую колонку к перистальтическому насосу и отрегулируйте расход на 50–60 Гц. Промыйте колонку дистиллированной водой и раствором глицина.
   2. Добавьте суспензию целлюлозы DE-52 в колонку с непрерывным добавлением раствора глицина до тех пор, пока слой целлюлозы не достигнет примерно 1 см в высоту.
   3. Загрузите спорозоиты, очищенные методом Перколля, на колонну. Поддерживайте расход 30–40 Гц с использованием раствора глицина и собирайте поток в центрифугную трубку на 50 мл.
   4. Контролируйте элюат, нанося капли на стеклянное стекло для микроскопического наблюдения. Если спорозоиты не обнаружены, остановите насос. Центрифугуйте собранную фракцию при 2 500 г в течение 5 минут, сбросьте супернатант и снова суспензуйте гранулу в PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы в стерильных условиях, чтобы предотвратить микробное загрязнение. Утилизировать отходы глицина и Перколя в соответствии с институциональными нормами биобезопасности.
2. Инфекция клеток HFF спорозоитом
   1. Семя 1 × 10⁶ спорозоитов в 24-колодцевые пластины, содержащие монослои клеток HFF. Добавьте пенициллин-стрептомицин до конечной концентрации 1× (100 U/mL пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина), аккуратно перемешайте и инкубируем при 37 °C в течение 4–6 часов, чтобы дать возможность вторжения. Снимите среду, смойте один раз с 1 мл PBS и выбросьте супернатант.
   2. Аккуратно вынимите стеклянные крышки из колодцев с помощью стерильных щипцов и перенесите их на свежую пластину на 24 лунки. Зафиксируйте образцы в 1 мл 4% параформальдегида на 30 минут, промывайте один раз с 1 мл PBS и выбросьте супернатант.
   3. Пермеабилизуйте клетки с помощью 1 мл 0,25% Triton X-100 на 30 минут. Помой один раз с 1 мл PBS и выбрось супернатант.
   4. Заблокируйте образцы 1 мл 3% BSA на 30 минут. Помой один раз с 1 мл PBS и выбрось супернатант.
   5. Разбавленный моноклональный анти-флаг антитела у мыши (1:200) в 3% BSA. Капли разбавленного антитела нанесите на герметичную пленку и инвертируйте капли (клеточной стороной вниз) на капли. Инкубировать покрытия в увлажнённой камере при 37 °C в течение 1 часа. Постирайте три раза с 1 мл PBS (по 5 минут каждая).
   6. Разбавленные FITC-конъюгированные козы против мышей IgG (1:200) и Hoechst 33258 (1:100) в 3% BSA. Капли морилки наносят на герметичную плёнку и переверните капли на капли. Инкубировать в увлажнённой камере при 37 °C в течение 1 часа, затем промыть пять раз с 1 мл PBS (по 5 минут каждая).
   7. Крепите накладки на стеклянный затвор 5 мкл антифейда. Переверните накладку (ячеточную сторону вниз) на капель, избегая воздушных пузырьков, и герметизируйте края. Храните установленные затворы в увлажнённой камере при 4 °C до проведения визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с параформальдегидом и Triton X-100 в капюшоне для химических паров, надевая перчатки и защиту для глаз. Реагентные формулы, используемые в этой процедуре, приведены в таблице 2.

Results

Геномный ПЦР-анализ подтвердил наличие целевого фрагмента в трансгенных паразитах, в то время как соответствующие полосы не были обнаружены в диких типах контроля (рисунок 1A). Ресеквенирование целого генома дополнительно показало, что линеаризованная плазмида стабильно интегрирована в геном паразита, а прогнозируемый сайт интеграции был валидирован с помощью амплификации ПЦР в области соединения (рисунок 1B).

Discussion

Этот протокол устанавливает комплексный рабочий процесс для валидации геномной интеграции, экспрессии белков и внутриклеточной локализации экзогенных генов в трансгенных E. tenella. Вместо того чтобы полагаться на один анализ, подход объединяет геномные и белковые данные, обеспечивая как структурное подтверждение, так и функциональное выражение вставки трансгенов.

Несколько ключевых шагов в этом протоколе сильно влияют на успешную валидацию трансгенны...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Медиум для монтажа антифейда	MCE	HYK1042	Флуоресцентная монтажная среда для предотвращения фотоотбеливания
BSA (3%)	Beyotime	ST023	Блокирующий буфер и буфер разведения антител для IFA; Блокируйте при комнатной температуре 30 минут
Хлороформ:изоамиловый спирт (24:1)	Sigma	C0549	Реагент для удаления остаточного фенола при экстракции геномной ДНК
Куры без кокцидии	Бёрингер-Ингельхайм	SPF	Используется для in vivo передачи и усиления трансгенных штамм; утверждён Этическим комитетом (номер утверждения: CAU20160628-2)
CTAB (бромид цетилтриметиламмония)	Merck KGaA	H5882	Компонент буфера экстракции геномной ДНК; Формулировка: 3 г CTAB + 12,27 г NaCl + 15 мл 1 моль/л Tris-HCl + 6 мл 0,5 моль/л EDTA, скорректировано до итогового объёма 150 мл с ddH2O
Целлюлоза DE-52	Solarbio	C8350	Ионообменная хроматографическая среда для очистки спорозоита; последовательно обработаны NaOH, HCl и дистиллированной водой, затем уравновешивают раствором глицина
Подложка ECL (Раствор A + Раствор B)	Thermofisher	32106	Реагент для обнаружения хемилюминесцентного обнаружения; Перед употреблением смешайте равные объёмы раствора A и B
FITC-конъюгированный козёл против мышей IgG	Sigma	AP124F	Флуоресцентное вторичное антитело к IFA, коэффициент разбавления 1:200
Стеклянные бусины	Sigma	Z250473-1PAK
Раствор глицина	Sigma	67419	Буфер уравновесия и элюции для хроматографических колонок; Формулировка: 0,75 г глицина + 7,9 г NaCl, растворённого в дистиллированной воде с 500 мл дистиллированной воды, pH отрегулирован до 7,4-7,6, автоклав
Hoechst 33258	Sigma	94403	Ядерный окрашивающий реагент, коэффициент разбавления 1:100; используется для локализации IFA
IgG с сопряжённым козлом IgG	Sigma	12-349	Вторичное антитело к западному блотингу, коэффициент разбавления 1:2000
Платформа секвенирования Illumina NovaSeq	Personalbio Biotechnology Co., Ltd. (Шанхай, Китай)		Платформа следующего поколения для секвенирования; парное секвенирование (длина чтения 150 bp), глубина секвенирования 100 и больше раз;, генерация ≥ 6 ГБ необработанных данных (Q20>90%)
Центрифуга с низкой скоростью	ЦЕНТРИФУГА БЭЙЛИ ПЕКИНСКОЙ ЭПОХИ	DT5-2
Мышиный моноклональный антифлаговый антитело	Sigma	F1804	Первичное антитело, соотношение разбавления 1:200; используемый для обнаружения IFA белка с флагом фьюжна
Моноклональное анти-GAPDH-антитело у мышей	Sigma	G8795	Первичное антитело, коэффициент разбавления 1:2000; использовался как регулятор нагрузки при западном блотинге
Обезжиренное молоко (5%)	Beyotime	P0216	Блокирующий буфер для западного протирания; блокировать при комнатной температуре в течение 1 часа или 4 градуса; C ночью
Параформальдегид (4%)	Merck KGaA	30525	Раствор фиксации клеток; Фиксируйте при комнатной температуре 30 минут
PBS	Solarbio	P1010
Пенициллин-стрептомицин (100 и больше раз;)	Йеасен	60162ES76	Антибиотик для культивирования клеток; Подавляет микробное загрязнение
Перколл (запас с уклоном DG	GE Healthcare	17-0891-09
Фенол: хлороформ:изоамил-спирт (25:24:1)	Merck KGaA	77617	Реагент для удаления белка во время экстракции геномной ДНК
Буфер загрузки белка (6 раз ;)	Beyotime	P0015F	Буфер нагрузки на электрофорез белков; Формулировка: 100 мМ Трис (pH 6,8), 4% SDS, 2 мМ ЭДТА, 2% глицерин, 6 М мочевины; Смешайте с 50 и MU; L 2 M DTT и 50 & mu; L 5% бромофенол синий перед использованием
Протеиназа K	Merck KGaA	39450-01-6	200 мг, растворённых в 10 мл ddH2O, используется для переваривания белков при экстракции геномной ДНК
Мембрана PVDF	Thermofisher	88518	Мембрана переноса белка; Активируется с помощью метанола за 1 минуту до использования
RIPA Lysis Buffer	Йеасен	20101	Буфер лизиса для экстракции белка спорозоита
RNase A	Merck KGaA	9001-99-4	25 мг, растворённый в 2,5 мл 0,01 моль/л NaAc, нагрев при 100°; C в течение 10-15 минут, pH скорректирован до 7,4 при 1 моль/л Tris-HCl; Используется для удаления РНК из образцов ДНК
Гель-реагенты SDS-PAGE (акриламид, бисакриламид, Tris, SDS, APS, TEMED)	Биография	101	Реагенты для приготовления геля SDS-PAGE; концентрация акриламида регулируется в зависимости от молекулярной массы целевого белка
Натрий тауроддезоксихолат гидрат	Sigma	T0875
решение)
Taq Master Mix (2 раза;)	Вазиме	P112-01/02/03	Премикс для амплификации ПЦР, содержащий Taq-полимеразу, dNTP и др.
Triton X-100 (0,25%)	Merck KGaA	9036	Раствор для проницаемости клеток; Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут
Трипсин	Solarbio	T8150
Вихревой миксер	Beijing North TZ-Biotech	HQ-60-II
Водяной термостат	Grant Instruments (Кембридж)	GD120,GM0815010