Method Article

Генерационный и моноклеточный транскриптомический анализ органоидов гепатоцеллюлярной карциномы после медикаментозного лечения

DOI:

10.3791/70511

⸱

May 26th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает упрощённый метод получения органоидов гепатоцеллюлярной карциномы, применения лекарственного лечения и проведения секвенирования одноклеточных РНК до и после лечения для характеристики транскрипционных изменений, связанных с лечением.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гепатоцеллюлярная карцинома является одной из основных причин смертности, связанной с раком, во всём мире и характеризуется выраженной внутриопухолевой гетерогенностью, что способствует вариативным реакциям на лечение, рецидиву опухоли и прогрессированию заболевания. Более глубокое понимание того, как опухолевые клетки меняются на транскрипционном уровне до и после медикаментозного лечения, поэтому необходимо для улучшения терапевтических стратегий. Однако практические экспериментальные процессы, связывающие органоидное лечение лекарствами с последующим транскриптомным профилированием отдельных клеток, остаются ограниченными. В этом исследовании разрабатывается стандартизированный рабочий процесс для генерации органоидов гепатоцеллюлярной карциномы, применения определённых лекарственных препаратов и проведения секвенирования одноклеточной РНК на образцах, собранных до и после лечения. Протокол включает возрождение и расширение органоидов, оценку качества до лечения, воздействие лекарств, подготовку органоидов к диссоциации отдельных клеток, построение библиотек и базовый сравнительный анализ транскриптомических данных отдельных клеток. Принимаются критические технические меры для повышения воспроизводимости и качества образцов. Этот процесс позволяет параллельно характеризуть состав клеток и транскрипционные изменения, связанные с медикаментолечением у гепатоцеллюлярной карциномы. Протокол надёжен, масштабируем и адаптируем в различных органоидных системах, предоставляя практическую платформу для изучения изменений экспрессии генов, связанных с лечением, с разрешением одной клетки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) — самый распространённый первичный рак печени у взрослых и основная причина смертей, связанных с раком, во всёммире 1,2,3. Плохой клинический исход обусловлен значительной внутриопухолевой гетерогенностью, что приводит к устойчивости к лечению ирецидиву 4. Недавнее исследование показывает, что разнообразие развития и пластичность клеточного состояния, обусловленные ключевыми транскрипционными программами, такими как ось FOXM1/CEBPB, способствуют терапевтической устойчивости в

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования с использованием человеческих тканей были рассмотрены и одобрены Комитетами по этическому обзору исследований Гуанчжоуского медицинского университета (одобрение No GYZL-2024-KY31). Все процедуры, связанные с человеческими образцами, проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по исследованиям на людях. От всех пациентов было получено письменное информированное согласие на использование их клинических образцов для медицинских исследований. Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.

Этот рабочий процесс включает восстановление и расш....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1 описывает формирование и характеристику органоидов гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). На рисунке 1A опухолевые ткани, полученные пациентами, использовались для создания органоидных культур для гистологического анализа и исследований лечения. Рисунок 1B показывает яркие изображения органоидов на 1 и 6 день после восстановления, демонстрируя выживаемость и расширение при стандартных трёхмерн.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для обеспечения воспроизводимости, эффективности и высококачественного одноклеточного транскриптомного анализа несколько технических этапов этого рабочего процесса требуют тщательного контроля. Согласованность при возрождении и расширении органоидов ГЦК, полученных пациентами, имеет решающее значение, поскольку вариации плотности посева, состава матрикса базальных мембран и времени культурирования могут влиять на морфологию, рост и реакции на лечениена последующих.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), Гуандунским фондом фундаментальных и прикладных исследований (2023A1515011416) и Гуанчжоуским фондом фундаментальных и прикладных исследований (2024A04J6575). Некоторые схемные элементы были созданы с помощью Home for Research (https://www.home-for-researchers.com) и адаптированы авторами. Схематические иллюстрации были созданы с помощью Figdraw (https://www.figdraw.com) и адаптированы авторами.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-gastrin I человекMerckG9145
Микротрубки объемом 1,5 млMerckAXYMCT150LC
1X буфер лизиса эритроцитовТермо Фишер Сайентифик00-4333-57
2,0 мл криогенных флаконов с внутренней резьбойГнездо607001
A8301 (ингибитор TGFb)Tocris Bioscience2939
Поликлональные антитела AFPProteintech14550-1-AP
Антиальбуминовое антитело [ALB/2144]AbcamAB236492
Анти-HNF-4-альфа-антитела [EPR16885] - Класс CHIPAbcamAB181604
Антипреальбуминовое антитело [EPR3219]Abcamab92469
Антитела к анти-SOX9 [EPR14335-78]Abcamab185966
Добавка B27 (503), без витамина AТермо Фишер Сайентифик12587010
Решение для восстановления элементов, 100 млКорнинг354253Реагент, используемый для растворения матрицы базальной мембраны и восстановления органоидов перед репликацией или последующей обработкой
CellTiter-Glo®   Анализ жизнеспособности 3D-клетокPromegaG9681
CHIR99021MerckSML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, библиотека и Набор для гелевых бусинок v3.110x GenomicsCG000227
Клетка Corning Cell, 40 и миль; м, Синий, S, IND, 1/50Корнинг431750
Costar 24 лунки с прозрачным плоским дном, ультранизкое крепление, несколько пластин с колодцами, индивидуально упакованные, стерильныеКорнинг3473
Cultrex Reduced Growth Factor BME, тип 2 PathClear (BME)Merck3533-005-02Внеклеточная матрица, используемая для поддержки трёхмерной органоидной культуры и формирования купола
DMSOMerckC6164Растворитель, используемый для приготовления запасных растворов для лекарств и управления транспортными средствами
Модифицированный Eagle Medium от Dulbecco/F-12 от HamТермо Фишер Сайентифик12634028Продвинутый DMEM/F-12
E7080 (Ленватиниб)СеллекS1164Ингибитор тирозинкиназы, используемый для органоидного лечения и терапевтического возмущения
Ценность сыворотки для плода в FBSGibcoA5256701
ФорсколинTocris Bioscience1099
Добавка GlutaMAXТермо Фишер Сайентифик35050061
Набор для окрашивания гематоксилина и эозинаBeyotimeC0105S
HEPES, 1 MТермо Фишер Сайентифик15630080
Флуоресцентный моторизованный микроскоп Leica DM6 BLeicaН/Д
Дополнение N2 (1003)Термо Фишер Сайентифик17502048
N-ацетилцистеинMerckA0737-5MG
НикотинамидMerckN0636
Конические стерильные полипропиленовые центрифугные трубки Nunc объёмом 15 млТермо Фишер Сайентифик339651
Пенициллин/стрептомицин (10 000 U/мл)Термо Фишер Сайентифик15140122
Фосфатно-буферный физиологический растворGENOM BIOGNM20012Буфер, используемый для промывания органоидов и подготовки образцов к дальнейшей обработке
Рекомбинантный человеческий EGFPeprotechAF-100-15
Рекомбинантный человек FGF10Peprotech100-26
Рекомбинантный человеческий HGFPeprotech100-39
Рекомбинантный человеческий НоггинPeprotech120-10C
Ингибитор рокиназы Y-27632 дигидрохлоридMerckY0503Ингибитор ROCK, используемый для повышения выживаемости органоидов после оттаивания или прохода
Среда, обусловленная R-spodin1(Брутье и др.)Н/ДСекреция клеточных линий
Синевая морилка Trypan, 0,4% мембранная фильтрация, приготовленная в солевом растворе 0,85%Gibco15250061
Фермент TrypLE Express (1 раз), без фенолового красногоТермо Фишер Сайентифик12604013Заместитель трипсинов
Среда, обусловленная Wnt-3a,(Брутье и др.)Н/ДСекреция клеточных линий

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatocellular Carcinoma OrganoidsSingle Cell RNA SequencingDrug Treatment ResponseOrganoid Drug ScreeningOrganoid DissociationCell Viability AssayOrganoid Morphology AnalysisGene Expression ProfilingTumor HeterogeneityPathway Enrichment Analysis

Related Articles