Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерационный и моноклеточный транскриптомический анализ органоидов гепатоцеллюлярной карциномы после медикаментозного лечения

495 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70511

⸱

26 мая 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает упрощённый метод получения органоидов гепатоцеллюлярной карциномы, применения лекарственного лечения и проведения секвенирования одноклеточных РНК до и после лечения для характеристики транскрипционных изменений, связанных с лечением.

Аннотация

Гепатоцеллюлярная карцинома является одной из основных причин смертности, связанной с раком, во всём мире и характеризуется выраженной внутриопухолевой гетерогенностью, что способствует вариативным реакциям на лечение, рецидиву опухоли и прогрессированию заболевания. Более глубокое понимание того, как опухолевые клетки меняются на транскрипционном уровне до и после медикаментозного лечения, поэтому необходимо для улучшения терапевтических стратегий. Однако практические экспериментальные процессы, связывающие органоидное лечение лекарствами с последующим транскриптомным профилированием отдельных клеток, остаются ограниченными. В этом исследовании разрабатывается стандартизированный рабочий процесс для генерации органоидов гепатоцеллюлярной карциномы, применения определённых лекарственных препаратов и проведения секвенирования одноклеточной РНК на образцах, собранных до и после лечения. Протокол включает возрождение и расширение органоидов, оценку качества до лечения, воздействие лекарств, подготовку органоидов к диссоциации отдельных клеток, построение библиотек и базовый сравнительный анализ транскриптомических данных отдельных клеток. Принимаются критические технические меры для повышения воспроизводимости и качества образцов. Этот процесс позволяет параллельно характеризуть состав клеток и транскрипционные изменения, связанные с медикаментолечением у гепатоцеллюлярной карциномы. Протокол надёжен, масштабируем и адаптируем в различных органоидных системах, предоставляя практическую платформу для изучения изменений экспрессии генов, связанных с лечением, с разрешением одной клетки.

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) — самый распространённый первичный рак печени у взрослых и основная причина смертей, связанных с раком, во всёммире 1,2,3. Плохой клинический исход обусловлен значительной внутриопухолевой гетерогенностью, что приводит к устойчивости к лечению ирецидиву 4. Недавнее исследование показывает, что разнообразие развития и пластичность клеточного состояния, обусловленные ключевыми транскрипционными программами, такими как ось FOXM1/CEBPB, способствуют терапевтической устойчивости вHCC-5. Эти результаты подчёркивают необходимость понимания того, как популяции опухолевых клеток адаптируются и переходят между состояниями под устойчивым давлением лечения. Однако большинство доклинических моделей не отражают должным образом динамичный, непрерывный характер этих переходов состояний, связанных с лечением, что ограничивает механистические исследования адаптации опухоли и терапевтических неудач.

Органоиды, полученные пациентами (PDO), предоставляют полезную платформу для этой цели, поскольку сохраняют важные геномные изменения и клеточную гетерогенность исходнойопухоли 6. ГЦК-органоиды могут сохраняться в долгосрочной культуре, сохраняя ключевые тканевыеособенности 7, что делает их особенно подходящими для исследований лечебно-ответного ответа. Кроме того, исследования на основе органоидов продемонстрировали возможность использования органоидов рака печени для лекарственного тестирования и фиксации межстационарных и внутриопухолевых различий в терапевтической чувствительности, что подтверждает их ценность как доклинических моделей для исследований лечебно-ответногоответа 8,9. Однако большинство исследований лекарств на основе органоидов по-прежнему в основном опираются на измерения жизнеспособности конечной точки или сосредоточены преимущественно на объёмных фенотипических ответах, предоставляя лишь ограниченную информацию о гетерогенных клеточных ответах и транскрипционных изменениях, связанных с лечением. Параллельно быстрое развитие терапевтических стратегий на основе РНК для ГЦК дополнительно подчеркивает необходимость доклинических систем, способных точно предсказывать и механистически анализировать ответы на лечение с разрешением одной клетки10.

Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) позволяет высокоразрешающе характеризуть состав клетки и транскрипционные состояния в органоидныхмоделях 11. При применении к органоидам, собранным до и после обработки, scRNA-seq может выявлять изменения экспрессии генов, сдвиги в популяциях клеток и гетерогенные реакции, не отражаемые в массовых анализах. Таким образом, этот подход представляет собой практическую и мощную стратегию для исследования транскрипционного ремоделирования, связанного с лечением, у органоидов ГЦК. Однако практический, воспроизводимый рабочий процесс, интегрирующий культуру органоидов ГЦК, лечение лекарственными препаратами и секвенирование одноклеточных РНК до и после лечения, по-прежнему отсутствует. Такой рабочий процесс наиболее эффективен, когда целостность органоидов сохраняется во время воздействия лекарств и при последующем профилировании отдельных клеток будет восстановлено достаточное количество жизнеспособных клеток. Как и в других органоидных подходах, важные ограничения включают неполное представление стромальных, сосудистых и иммунных компонентов микросреды опухоли, а также потенциальное смещение отбора при длительной культуре in vitro.

Описывается интегрированный экспериментальный рабочий процесс для генерации органоидов ГЦК, применения определённого лечения лекарственными препаратами и обработки образцов органоидов для секвенирования одноклеточных РНК до и после лечения. Этот рабочий процесс включает возрождение и расширение органоидов, оценку качества перед лечением, контролируемое воздействие лекарственных препаратов и последующем секвенированию одиночных РНК соответствующих образцов. Этот подход предоставляет практическую основу для сравнения, с разрешением одной клетки, изменений в составе клеток и программах экспрессии генов, связанных с лечением, у органоидов ГЦК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследования с использованием человеческих тканей были рассмотрены и одобрены Комитетами по этическому обзору исследований Гуанчжоуского медицинского университета (одобрение No GYZL-2024-KY31). Все процедуры, связанные с человеческими образцами, проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по исследованиям на людях. От всех пациентов было получено письменное информированное согласие на использование их клинических образцов для медицинских исследований. Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.

Этот рабочий процесс включает восстановление и расширение криоконсервированных органоидов гепатоцеллюлярной карциномы с незначительными адаптациями для последующих терапевтических возмущений и секвенирования одноклеточной РНК. Цель — получить органоидные культуры достаточного качества и консистенции для последующих экспериментов смедикаментозным лечением 12.

1. Создание и расширение органоидов, полученных пациентами из ГЦК

  1. Оттаивание и восстановление криоконсервированных органоидов
    1. Подготовка перед размораиванием
      1. Предварительно разогрейте водяную ванну до 37 °C. Предварительное равновесие пластины с 24 лунками в инкубаторе при температуре 37 °C не менее 1 часа перед нанесением пластины.
      2. Заранее подготовьте полную органоидную культурную среду и держите экстракт базальной мембраны (BME) на льду до использования. Состав полного органоидного культурного материала приведён в дополнительной таблице 1.
    2. Оттаивание органоидов
      1. Извлеките криовиалы с замороженные органоиды ГЦК из жидкого азота и немедленно поместите их в водяную ванну при температуре 37 °C.
      2. Аккуратно перемешивайте флакон и прекращайте оттаивание, когда останется лишь маленький ледяной кристалл.
    3. Удаление криопротектора
      1. Аккуратно нанесите пипеткой размораживавшую суспензию, чтобы подвесить содержимое обратно.
      2. Переместить суспензию в коническую трубку объёмом 15 мл, содержащую 3–5 мл полного органоидного посевного материала.
      3. Центрифуга при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C. Аккуратно аспирируйте и сбрасывайте супернатант, не нарушая гранулу.
  2. Вложение и воспроизведение органоидов
    1. Приготовление восстановительной смеси
      1. Суспензировать органоидную гранулу в полной органоидной культурной среде. Состав полного органоидного культурного материала приведён в дополнительной таблице 1.
      2. Аккуратно смешайте с равным объёмом ледяного BME, чтобы получить смесь для покрытия.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Храните смесь на льду, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию.
    2. Покрытие органоидных куполов
      1. В каждую яме предварительно нагретой пластины на 24 лунки насыпать 50 мкл смеси органоидно-матричной смеси.
      2. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут для обеспечения затвердевания матрицы.
      3. Добавьте 500 мкл полного органоидного культурного материала с добавлением 20 мкм Y-27632 в каждую скважину вдоль стенки колодца.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничите использование Y-27632 первыми 2–3 днями после оттаивания или прохода. Убедитесь, что каждый купол остаётся компактным и прикреплённым к дну колодца, не распространяясь наружу.
  3. Культура органоидов и расширение
    1. Условия культуры восстановления
      1. Поддерживайте органоиды при 37 °C с 5%CO2.
      2. Используйте среду с содержанием 20 мкм Y-27632 в первые 2–3 дня после размораивания.
    2. Средняя замена
      1. Заменяйте посевную форму каждые 3–4 дня с помощью мягкой аспирации.
      2. Добавьте свежий материал вдоль стены каждой скважины, чтобы не повредить матричные купола.
      3. Сохраняйте одинаковый график замены среды во всех скважинах в рамках одного эксперимента.
    3. Мониторинг роста
      1. Отслеживайте восстановление и расширение органоидов с помощью микроскопа с ярким полем с постоянными настройками визуализации.
      2. Записывайте репрезентативные изображения в определённые моменты времени во время восстановления и расширения.
      3. Подтверждается успешное восстановление, когда большинство структур сохраняются целыми, органоиды имеют форму округлых или овальных с гладкими краями, наблюдается постепенное увеличение со временем, а также минимальные обломки или обрушившиеся структуры.
      4. Исключить скважины, содержащие менее 10 целостных органоидов, из дальнейшего количественного анализа.
    4. Критерии принятия и расширения
      1. Проходные органоиды наблюдаются после стабильного расширения.
      2. Подтвердить стабильное расширение путём воспроизводимого увеличения размера органоидов или общей площади с сохраненной морфологией.
      3. Используйте согласованные критерии интервала визуализации, увеличения и включения во всех экспериментах.
      4. Генерируйте репрезентативные кривые роста на основе площади органоидов или подсчетов для подтверждения стабильности.
    5. Критерии для последующих экспериментов
      1. Используйте органоидные линии, демонстрирующие стабильный трёхмерный рост, не показывающие загрязнения или масштабного обрушения, а также обеспечивающие достаточный выход для параллельных экспериментальных условий.
      2. Сохраняйте культуры не менее 7–10 дней после оттаивания или до завершения восстановления и одного цикла расширения.
      3. Продвигайте только органоидные линии, показывающие согласованную морфологию через репликационные колодцы.

2. Подготовка органоидов для терапевтического возмущения

  1. Оценка качества до обработки
    1. Оценка на основе морфологии
      1. Подтвердите, что органоиды имеют форму округлой или овальной формы.
      2. Убедитесь, что органоиды имеют гладкие и чётко очерченные границы.
      3. Убедитесь, что внутри купола нет клеточного мусора.
      4. Исключайте культуры с обширной фрагментацией, затемневшими люменами, масштабным коллапсом или явным загрязнением.
    2. Оценка в состоянии расширения
      1. Используйте только органоидные культуры, которые завершили восстановление и перешли в стабильную экспансию.
      2. Подтвердите прогрессирующее увеличение со временем.
      3. Подтвердите согласованную морфологию между реплицируемыми скважинами.
  2. Воспроизведение органоидов для медикаментозного лечения
    1. Восстановление органоидов из матрицы
      1. Растворить органоидные купола на льду, используя 1 мл раствора для восстановления ледяных клеток на каждую скважину в течение 15–20 минут.
      2. Осторожно каждые 5 минут во время инкубации.
      3. Центрифугуйте восстановленную подвеску при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
      4. Суспензируйте гранулу в полном органоидном посевном среде.
    2. Стандартизация перед повторением
      1. Стандартизуйте начальное количество органоидных запасов в скважинах перед медикаментозным лечением.
      2. Определить жизнеспособное число клеток после частичной диссоциации, когда это возможно.
      3. Нормализуйте образцы с одинаковым количеством входных ячеек на каждую скважину.
      4. Размещайте примерно 1 000–5 000 жизнеспособных ячеек на одну скважину в формате с 24 лунками.
      5. Если прямой подсчёт клеток не выполняется, нормализуйте, обеспечив сопоставимое количество морфологически целых органоидов на одну скважину и одинаковое распределение по размеру между группами.
      6. Зафиксируйте начальное количество органоидов и исходную морфологию для каждого заранее до обработки.
      7. Используйте одинаковые критерии включения и стратегию обшивки во всех скважинах в рамках одного эксперимента.
    3. Репродукция для лечения наркозависимости
      1. Смешивают восстановленные органоиды с ледяной матрицей базальной мембраны при конечной концентрации 30–50%.
      2. Раздайте по 50 мкл куполов в каждую яме пластины на 24 лунки.
      3. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут для полимеризации.
      4. Добавьте по 500 мкл полного органоидного посева на каждую скважину вдоль стены колодца.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что каждый купол остаётся компактным и прикреплённым к дну колодца, не распространяясь наружу. Используйте одинаковый объём купола и концентрацию матрицы во всех скважинах в одном эксперименте.
  3. Восстановление до лечения наркозависимостью
    1. Восстановление после повторения
      1. Дайте органоидам восстановиться за ночь при стандартных условиях культуры.
      2. Обработка начинается только после восстановления целостной морфологии внутри восстановленных куполов.
    2. Критерии поступления на лечение наркозависимости
      1. Начинайте лечение лекарствами только тогда, когда органоиды остаются целыми после восстановления, нет масштабного обрушения или избыточного обломка, а нагрузка органоидов сопоставимая между скважинами.
      2. Записывать исходные изображения яркого поля для всех экспериментальных групп перед лечением.
      3. Поддерживайте одинаковую начальную нагрузку, время восстановления после повторения и время начала лечения во всех контрольных и лечебных колодцах.
  4. Вопросы безопасности
    1. Выполнять все процедуры, связанные с органоидами, полученными человеком, с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты и практик биобезопасности.
    2. Аккуратно обращайтесь с ферментативными реагентами для диссоциации, чтобы избежать контакта кожи или глаз.
    3. Утилизировать жидкие и твёрдые биологические отходы в соответствии с институциональными нормами биобезопасности.

3. Медикаментозное лечение органоидов ГЦК

  1. Подготовка и лечение лекарств
    1. Подготовка лекарств
      1. Приготовьте раствор ленватиниба в DMSO согласно инструкциям производителя.
      2. Разведите наложный раствор в предварительно подогретой культурной среде непосредственно перед использованием до заранее определённой рабочей концентрации.
      3. Поддерживайте одинаковую конечную концентрацию DMSO во всех скважинах (≤ 0,1%).
      4. Подготовьте достаточный объём для обеспечения равного итогового объёма обработки в каждой скважине.
    2. Лечение наркотиков
      1. Добавьте среду, содержащую ленватиниб (20 мкм) вдоль стенки каждой скважины, чтобы избежать нарушения матричных куполов.
      2. Включите управление транспортом с той же конечной концентрацией DMSO.
      3. Инкубировать органоиды в стандартных условиях культуры в течение заранее определённого периода лечения.
      4. Заменяйте медикаментозное средство каждые 48–72 часа при длительности лечения более 72 часа.
      5. Используйте одинаковый график замены среды во всех скважинах эксперимента.
      6. Запишите исходные изображения яркого поля перед обработкой.
      7. Получайте изображения с фиксированными интервалами во время лечения, используя одинаковые настройки микроскопа, увеличение и положения поля.
  2. Оценка ответа на лечение
    1. Оценка на основе морфологии
      1. Оценить реакцию на лечение с помощью следующих показаний на основе изображений: кривая роста площади органоидов, средний диаметр органоидов и количество сохранившихся органоидов.
      2. Используйте одинаковые настройки экспозиции, пороги увеличения и анализа для всех изображений.
      3. Измеряйте кривую роста площади органоидов, вычисляя общую площадь органоида на скважину или поле в каждой точке времени и нормализуя до базовой точки.
      4. Измеряйте средний диаметр органоида, определяя диаметр отдельных целых органоидов и вычисляя среднее значение на скважину.
      5. Определите количество сохранившихся органоидов, подсчитывая морфологически идентифицируемые целостные органоиды и исключая обломки и свернувшиеся фрагменты.
    2. Опциональное измерение жизнеспособности
      1. Проведите трёхмерный анализ люминесцентной жизнеспособности в конечной точке лечения, если требуется дополнительная оценка объёмной жизнеспособности.
      2. Следуйте инструкциям производителя для проведения анализа.
  3. Анализ данных
    1. Нанимите кривые роста органоидной площади со временем.
    2. Сравните средний диаметр органоидов между группами, обработанными транспортными средствами, и группами, обработанными ленватинибом.
    3. Сравните количество сохранившихся органоидов между группами лечения.
    4. Применяйте одинаковые графики получения изображений, критерии включения органоидов и параметры анализа во всех группах для обеспечения воспроизводимости.

4. Подготовка органоидов для секвенирования одноклеточной РНК

  1. Отбор и восстановление органоидов
    1. Оценка до диссоциации
      1. Выберите органоидные скважины, которые демонстрируют целостную трёхмерную морфологию без широкого колапса, содержат достаточное количество материала для захвата одной клетки и не показывают явного загрязнения.
      2. Собирайте органоиды в соответствующих экспериментальных временных точках между контрольными и обработанными образцами.
      3. Сохраняйте одинаковую плотность покрытия, график обработки и условия замены среды по всем образцам.
      4. Записывайте яркие изображения каждого выбранного задолго до диссоциации, используя идентичные настройки микроскопа, увеличение и критерии выбора поля.
    2. Удаление матрицы
      1. Аспирируйте культурную среду полностью из каждой скважины.
      2. Промыйте каждую колодцу ледяным PBS, чтобы удалить остатки среды и мусор.
      3. Добавьте 1 мл раствора для восстановления ледяных клеток в каждую скважину.
      4. Инкубировать на льду в течение 20–30 минут.
      5. Осторожно набирайте пипетки каждые 5–7 минут во время инкубации, чтобы облегчить растворение матрицы.
      6. Перенесите растворённый материал в предварительно охлаждённые трубы с помощью ширококаналного или резанного наконечника пипетки, чтобы минимизировать сдвиговое напряжение.
      7. Ферментативная диссоциация переходят только после того, как матрица в значительной степени растворится и останется минимальный видимый остаток геля.
  2. Ферментативная диссоциация и подготовка суспензии в одной клеточке
    1. Ферментативная диссоциация
      1. Центрифугировать восстановленную органоидную суспензию при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
      2. Аккуратно удалите супернатант, не трогая гранулу.
      3. Ресуспендировать гранулу в 1 мл фермента диссоциации рекомбинантных клеток.
      4. Инкубировать при 37 °C в течение 5–10 минут.
      5. Пипетки аккуратно 8–10 раз каждые 2–3 минуты с помощью ширококалиберного наконечника P1000 для стимулирования диссоциации.
      6. Останавливают пищеварение, когда большинство органоидных фрагментов рассеиваются в отдельные клетки, и остаются лишь небольшие остаточные кластеры.
      7. Избегайте длительного переваривания, чтобы предотвратить снижение жизнеспособности клеток, артефакты, связанные со стрессом, и увеличение загрязнения окружающей РНК.
    2. Закалка и фильтрация
      1. Добавьте 4 мл ледяной сыворотки PBS с 2% сывороткой плода для бычьего скота, чтобы остановить пищеварение.
      2. Фильтруйте подвеску через сито с элементами 40 мкм.
      3. Промыйте один раз PBS, чтобы удалить остатки фермента, заполнителей и мусор.
      4. Проведите лиз эритроцитов, если обнаружено загрязнение эритроцитами, следуя инструкциям производителя.
    3. Подготовка и контроль качества клеток
      1. Считайте ячейки с помощью исключения трипана синего цвета.
      2. Определите жизнеспособность клетки до подготовки к библиотеке.
      3. Используйте только образцы с жизнеспособностью ≥ 85%.
      4. Отрегулируйте конечную концентрацию ячеек до 700–1 200 клеток/мкл.
      5. Исключайте образцы с избыточным обломком, обильными мёртвыми клетками, крупными видимыми заполняющими частицами или неполной диссоциацией.
      6. Повторяйте фильтрацию перед загрузкой, если присутствуют заполнители.
      7. Контроль процесса и обработанные образцы при одинаковых условиях, включая фермент диссоциации, время пищеварения, частоту пипетирования, метод фильтрации, концентрацию клетки и стратегию загрузки.
  3. Подготовка и секвенирование библиотек с одной ячейкой
    1. Захват одиночных ячейок и подготовка библиотеки
      1. Загрузите подготовленную подвеску с одной ячейкой на платформу для захвата капель в соответствии с инструкциями производителя.
      2. Выполнять обратную транскрипцию, амплификацию cDNA и создание библиотеки с использованием соответствующего процесса с одной ячейкой 3′.
    2. Параметры секвенирования
      1. Библиотеки последовательностей на глубине не менее 50 000 чтений на ячейку.
      2. Нагрузочные ячейки обеспечивают восстановление примерно 6 000–10 000 ячеек на библиотеку.
      3. Записывайте секвенирование химии, структуру чтения и настройки приборов.
  4. Критерии качества для нижнего анализа
    1. Убедитесь, что готовая подготовка обладает высокой жизнеспособностью ячеек, минимальным количеством мусора и низкой нагрузкой заполнителя.
    2. Подтвердить пригодность для последующих транскриптомических анализов клеточной гетерогенности и переходов состояния клеток.

5. Базовая обработка и контроль качества данных секвенирования РНК для одной клетки

  1. Первичная обработка
    1. Генерация матрицы счёта
      1. Обработка необработанных данных секвенирования с использованием рекомендуемого конвейера для выбранной платформы.
      2. Генерируйте матрицу подсчёта генов за клетками.
      3. Версия программного обеспечения записи, сборка референсного генома и выпуск аннотации транскриптов.
    2. Первичная оценка качества на уровне библиотеки
      1. Суммируем метрики секвенирования для каждой библиотеки, включая общее количество чтений, оценочное количество восстановленных клеток, медианные гены на клетку, медианные UMI на клетку и насыщение секвенирования (если применимо).
      2. Используйте одинаковые настройки референсного генома и аннотации для всех образцов.
  2. Контроль качества на уровне ячейки
    1. Фильтрация ячеек низкого качества
      1. Оценить для каждой клетки количество обнаруженных генов, общее количество UMI, долю митохондриальных транскриптов и доказательства дублетов или мультиплетов.
      2. Исключать клетки с крайне низким количеством генов, чрезвычайно низким количеством UMI или аномально высокими фракциями митохондриальных транскриптов.
      3. Определите пороги фильтрации на основе распределения наборов данных.
      4. Применяйте одинаковые пороги для соответствующих групп лечения.
    2. Удаление вероятных дублетов
      1. Определите вероятные дублеты с помощью соответствующего вычислительного метода.
      2. Удалите дублеты с помощью совместимого с платформой процесса обнаружения.
      3. Применяйте одну и ту же стратегию обнаружения двойников ко всем образцам.
  3. Нормализация, кластеризация и аннотация
    1. Нормализация данных
      1. Нормализуйте отфильтрованную матрицу подсчёта с помощью стандартного одноклеточного рабочего процесса РНК-последовательности.
      2. Применяйте одинаковые процедуры нормализации для всех выборок.
    2. Уменьшение размерности и кластеризация
      1. Выполнить уменьшение размерности.
      2. Провести неконтролируемое кластерирование для выявления основных транскрипционных популяций.
      3. Визуализируйте состояния ячеек с помощью низкоразмерного метода вложения, такого как UMAP.
    3. Идентификация маркерных генов
      1. Идентифицировать маркерные гены с помощью анализа дифференциальной экспрессии между кластерами.
      2. Присваивать биологическую интерпретацию основным состояниям эпителиальных клеток на основе экспрессии маркеров.
  4. Сравнительный анализ условий лечения
    1. Интеграция метаданных
      1. Аннотируйте каждую клетку с указанием состояния лечения, органоидной линии, полученной пациентом, и партией обработки.
      2. Поддерживать последовательную структуру метаданных для всех выборок.
    2. Анализ изменений, связанных с лечением,
      1. Сравните контрольные и обработанные образцы.
      2. Определить транскрипционное ремоделирование, связанное с лечением.
      3. Определите сдвиги в составе состояния клеток.
      4. Определить популяции-кандидаты клеток, связанные с терапевтической адаптацией.
      5. Интерпретировать результаты вместе с морфологическими и жизнеспособными показаниями.
  5. Результаты анализа данных
    1. Сгенерировать матрицу с контролем качества генов по клеткам.
    2. Генерировать низкоразмерные визуализации транскрипционно различных популяций.
    3. Определить маркерные гены для крупных кластеров.
    4. Поддерживать согласованность всех образцов в эталонном геноме, рабочем процессе предварительной обработки, критериях фильтрации, стратегии кластеризации и критериях аннотации.
    5. Документируйте любые отклонения от стандартного рабочего процесса, специфичные для примеров.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 1 описывает формирование и характеристику органоидов гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). На рисунке 1A опухолевые ткани, полученные пациентами, использовались для создания органоидных культур для гистологического анализа и исследований лечения. Рисунок 1B показывает яркие изображения органоидов на 1 и 6 день после восстановления, демонстрируя выживаемость и расширение при стандартных трёхмерн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для обеспечения воспроизводимости, эффективности и высококачественного одноклеточного транскриптомного анализа несколько технических этапов этого рабочего процесса требуют тщательного контроля. Согласованность при возрождении и расширении органоидов ГЦК, полученных пациентами, имеет решающее значение, поскольку вариации плотности посева, состава матрикса базальных мембран и времени культурирования могут влиять на морфологию, рост и реакции на лечениена последующих...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), Гуандунским фондом фундаментальных и прикладных исследований (2023A1515011416) и Гуанчжоуским фондом фундаментальных и прикладных исследований (2024A04J6575). Некоторые схемные элементы были созданы с помощью Home for Research (https://www.home-for-researchers.com) и адаптированы авторами. Схематические иллюстрации были созданы с помощью Figdraw (https://www.figdraw.com) и адаптированы авторами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
[Leu15]-gastrin I человекMerckG9145
Микротрубки объемом 1,5 млMerckAXYMCT150LC
1X буфер лизиса эритроцитовТермо Фишер Сайентифик00-4333-57
2,0 мл криогенных флаконов с внутренней резьбойГнездо607001
A8301 (ингибитор TGFb)Tocris Bioscience2939
Поликлональные антитела AFPProteintech14550-1-AP
Антиальбуминовое антитело [ALB/2144]AbcamAB236492
Анти-HNF-4-альфа-антитела [EPR16885] - Класс CHIPAbcamAB181604
Антипреальбуминовое антитело [EPR3219]Abcamab92469
Антитела к анти-SOX9 [EPR14335-78]Abcamab185966
Добавка B27 (503), без витамина AТермо Фишер Сайентифик12587010
Решение для восстановления элементов, 100 млКорнинг354253Реагент, используемый для растворения матрицы базальной мембраны и восстановления органоидов перед репликацией или последующей обработкой
CellTiter-Glo®   Анализ жизнеспособности 3D-клетокPromegaG9681
CHIR99021MerckSML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, библиотека и Набор для гелевых бусинок v3.110x GenomicsCG000227
Клетка Corning Cell, 40 и миль; м, Синий, S, IND, 1/50Корнинг431750
Costar 24 лунки с прозрачным плоским дном, ультранизкое крепление, несколько пластин с колодцами, индивидуально упакованные, стерильныеКорнинг3473
Cultrex Reduced Growth Factor BME, тип 2 PathClear (BME)Merck3533-005-02Внеклеточная матрица, используемая для поддержки трёхмерной органоидной культуры и формирования купола
DMSOMerckC6164Растворитель, используемый для приготовления запасных растворов для лекарств и управления транспортными средствами
Модифицированный Eagle Medium от Dulbecco/F-12 от HamТермо Фишер Сайентифик12634028Продвинутый DMEM/F-12
E7080 (Ленватиниб)СеллекS1164Ингибитор тирозинкиназы, используемый для органоидного лечения и терапевтического возмущения
Ценность сыворотки для плода в FBSGibcoA5256701
ФорсколинTocris Bioscience1099
Добавка GlutaMAXТермо Фишер Сайентифик35050061
Набор для окрашивания гематоксилина и эозинаBeyotimeC0105S
HEPES, 1 MТермо Фишер Сайентифик15630080
Флуоресцентный моторизованный микроскоп Leica DM6 BLeicaН/Д
Дополнение N2 (1003)Термо Фишер Сайентифик17502048
N-ацетилцистеинMerckA0737-5MG
НикотинамидMerckN0636
Конические стерильные полипропиленовые центрифугные трубки Nunc объёмом 15 млТермо Фишер Сайентифик339651
Пенициллин/стрептомицин (10 000 U/мл)Термо Фишер Сайентифик15140122
Фосфатно-буферный физиологический растворGENOM BIOGNM20012Буфер, используемый для промывания органоидов и подготовки образцов к дальнейшей обработке
Рекомбинантный человеческий EGFPeprotechAF-100-15
Рекомбинантный человек FGF10Peprotech100-26
Рекомбинантный человеческий HGFPeprotech100-39
Рекомбинантный человеческий НоггинPeprotech120-10C
Ингибитор рокиназы Y-27632 дигидрохлоридMerckY0503Ингибитор ROCK, используемый для повышения выживаемости органоидов после оттаивания или прохода
Среда, обусловленная R-spodin1(Брутье и др.)Н/ДСекреция клеточных линий
Синевая морилка Trypan, 0,4% мембранная фильтрация, приготовленная в солевом растворе 0,85%Gibco15250061
Фермент TrypLE Express (1 раз), без фенолового красногоТермо Фишер Сайентифик12604013Заместитель трипсинов
Среда, обусловленная Wnt-3a,(Брутье и др.)Н/ДСекреция клеточных линий

Ссылки

  1. Villanueva, A. Hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 380 (15), 1450-1462 (2019).
  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Safri, F., et al. Heterogeneity of hepatocellular carcinoma: from mechanisms to clinical implications. Cancer Gene Ther. 31 (8), 1105-1112 (2024).
  5. Zhang, X. F., et al. Targeting cell-state plasticity driven by FOXM1/CEBPB axis disrupts developmental heterogeneity and therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 84 (2), 370-384 (2026).
  6. Thorel, L., et al. Patient-derived tumor organoids: a new avenue for preclinical research and precision medicine in oncology. Exp Mol Med. 56 (7), 1531-1551 (2024).
  7. Liu, Y., et al. A decade of liver organoids: advances in disease modeling. Clin Mol Hepatol. 29 (3), 643-669 (2023).
  8. Li, L., et al. Human primary liver cancer organoids reveal intratumor and interpatient drug response heterogeneity. JCI Insight. 4 (2), e121490 (2019).
  9. Yang, H., et al. Pharmacogenomic profiling of intra-tumor heterogeneity using a large organoid biobank of liver cancer. Cancer Cell. 42 (4), 535-551.e8 (2024).
  10. Xing, L., et al. RNA-based therapies in hepatocellular carcinoma: state of the art and clinical perspectives. Hepatoma Res. 10, 24 (2024).
  11. Aissa, A. F., et al. Single-cell transcriptional changes associated with drug tolerance and response to combination therapies in cancer. Nat Commun. 12 (1), 1628 (2021).
  12. Zhang, C. Y., et al. Development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery. J Vis Exp. (198), e65785 (2023).
  13. Wang, Q., et al. Breakthroughs and challenges of organoid models for assessing cancer immunotherapy: a cutting-edge tool for advancing personalised treatments. Cell Death Discov. 11 (1), 222 (2025).
  14. Yang, C., et al. Modeling methods of different tumor organoids and their application in tumor drug resistance research. Cancer Drug Resist. 8, 32 (2025).
  15. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
  16. Yip, S., et al. Give them vasculature and immune cells: how to fill the gap of organoids. Cells Tissues Organs. 212 (5), 369-382 (2023).
  17. Zhou, C., et al. Standardization of organoid culture in cancer research. Cancer Med. 12 (13), 14375-14386 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Секвенирование РНК единичных клетокответ на лекарственную терапиюлекарственный скрининг органоидовдиссоциация органоидованализ жизнеспособности клетоканализ морфологии органоидовпрофилирование экспрессии геновгетерогенность опухолианализ обогащения сигнальных путей
Генерационный и моноклеточный транскриптомический анализ органоидов гепатоцеллюлярной карциномы после медикаментозного лечения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.