Среднепроизводительная экстракция ДНК из колонки с использованием 24-колодных стеллажей

Краткое содержание

Этот протокол описывает экономичный метод ускорения экстракции плазмидной ДНК. Используя индивидуальные 3D-печатные стойки, совместимые со стандартными роторами с качающимися пластинами, исследователи могут одновременно обрабатывать до 48 спин-колонн с крышками или до 116 колонок без них, что значительно сокращает время обработки по сравнению с ручными методами микроцентрифуг.

Аннотация

Экстракция спин-колонны с помощью кремнеземной мембраны является стандартом высококачественной очистки ДНК, но требует трудоёмких усилий и трудно масштабировать вручную за пределами небольших партий. Существующие автоматизированные роботы для обработки жидкостей часто всё ещё слишком дороги для малых и средних лабораторий. В этой статье представлен упрощённый, полуавтоматизированный подход с использованием специально разработанных 3D-печатных стеллажей, подходящих для стандартных роторов центрифугных пластин.

Предлагаемая система позволяет параллельную обработку до 116 стандартных коммерческих спин-колонок. Конструкция стойки предусматривает «вложенную» конфигурацию, позволяющую одновременно очищать лизат (через фильтрационные колонны) и связывать ДНК (с помощью кремнеземных колонок) за один этап центрифуга. Кроме того, конструкция включает общий резервуар для отходов, что устраняет необходимость отбрасывать поток из отдельных труб во время промывки.

Этот метод обеспечивает выход и чистоту ДНК, сопоставимую со стандартными ручными протоколами, но сокращает общее время обработки примерно на 50–70% для партий образцов более 24 (60–90 минут вместо 120–180 минут). Общее время, необходимое для выполнения этапов, включая фильтрацию лизата, промывку и утилизацию отходов, сокращается на 5–10 минут независимо от количества обработанных образцов. Этот аппаратный подход с открытым исходным кодом преодолевает разрыв между ручной мини-препрепи и дорогой автоматизацией.

Введение

Выделение нуклеиновых кислот с помощью кремнезёмных матриц впервые было разъяснено в 1979 году Фогельштейном и Гиллеспи, которые установили основополагающий принцип адсорбции фрагментов ДНК в стеклянный порошок в присутствии высоких концентраций хаотропных солей, в частности йодида^{натрия 1}. Этот прорыв предложил более безопасную и эффективную альтернативу токсичной экстракции фенолхлороформ и трудоёмким методам ультрацентрифугации с градиентом цезия-хлорида, которые доминировали в ту эпоху. Впоследствии Бум и соавторы значительно оптимизировали эту методологию, введя гуанидиний тиоцианат (GuSCN) в качестве основного хаотропного^{агента 2}. Это нововведение было ключевым, поскольку GuSCN одновременно действует как мощный денатуратор для лизных клеток и как мощный ингибитор РНаз и ДНКаз, сохраняя целостность нуклеиновых кислот на начальных этапах экстракции.

С момента появления эта технология твёрдофазной экстракции — широко известная как «метод бума» — претерпела значительную доработку. Он адаптирован для выделения нуклеиновых кислот из всё более сложных биологических матриц, варьирующихся от бактериальной^{плазмиды 3} и^{геномной ДНК 4} до эукариотической митохондриальной⁵ и геномной ДНК с высоким молекулярным весом. Кроме того, технология была масштабирована для клинических и судебных применений, включая выделение свободной клеточной циркулирующей ДНК из^{плазмы 6}, экстракцию непокорной растительной ДНК и РНК, богатых^{полифенолами-7}, а также очистку вирусных нуклеиновых кислот⁸. Также доступны многие коммерческие наборы с прядовыми колонками.

Физико-химический механизм, лежащий в основе этого процесса, основан на нарушении водной структуры хаотропными ионами. При наличии высокой ионной прочности и низкого pH удаляются гидратационные оболочки, окружающие как каркас нуклеинового кислотного фосфата, так и поверхность кремнезема (обезвоживание). Это способствует формированию катионных мостов — обычно опосредованных Na⁺ или хаотропными катионами — между отрицательно заряженными силаноловыми группами на поверхности кремнезёма и фосфатными группами нуклеиновой кислоты. Селективность по типу нуклеиновой кислоты (ДНК против РНК) и длине фрагмента достигается за счёт точной модуляции буферной химии. Например, определённые концентрации соли и уровни pH могут способствовать связыванию длинных геномных цепочек по сравнению с короткими олигонуклеотидами или различать РНК и ДНК. Кроме того, современные итерации этой технологии часто используют модифицированные кремнеземные поверхности для усиления дифференциальных изотерм адсорбции определённых видов нуклеиновых кислот.

Канонический рабочий процесс очистки нуклеиновых кислот на основе кремнезёма проходит через четыре отдельные фазы: (1) Лиз, при котором биологический исходный материал гомогенизируется, а клеточные структуры разлагаются, часто с использованием щелочных условий или детергентов (SDS/Triton); (2) Очистка, при которой клеточный мусор, осадкованные белки и полисахариды удаляются для предотвращения закупорки колонок; (3) Связывание, при котором супернатант регулируется с помощью хаотропных солей и этанола для стимулирования адсорбции к кремнеземной мембране; и (4) Промывка, при которой мембранные нуклеиновые кислоты промываются буферами на основе спирта для удаления остаточных солей и ингибиторов перед элюированием в буфере с низкой ионной прочностью.

Хотя химия этого процесса надёжна, механическая обработка отдельных спиновых колонн остаётся значительным узким местом для рабочих процессов со средней производительностью (24–100 образцов), создавая разрыв между ручной обработкой и дорогими автоматизированными системами обработки жидкости. Существующие подходы к упрощению ручной экстракции нуклеиновых кислот на основе колонок включают вакуумные коллекторы и роботизированные рабочие станции для автоматизированной^{очистки} 9,10,11,12.

Вакуумные коллекторы обычно доступны либо в конфигурации с произвольным доступом, оснащённой 20–24 адаптерами Люэра для центробежных колонн, либо в конструкции, предназначенной для использования с пластинами с 96 ямы. Вакуумные коллекторы, рассчитанные на 20–24 образцы, ускоряют этап промывания колонки при очистке ДНК по сравнению с центрифугированием, поскольку устраняют необходимость удаления колонн из ротора. Хотя этот метод удобен, перекрёстное загрязнение может возникнуть, потому что кончик дренажа колонны соприкасается с отверстием Люра вакуумного коллектора. Если ДНК из колонны попадает в отверстие Люэра, она может быть перенесена в другой столбец образца при последующем использовании в многообразии. Для предотвращения загрязнения производители рекомендуют дополнительные^{аксессуары 10, 13}; однако они усложняют сборку системы экстракции и часто опускаются.

Вакуумные коллекторы, разработанные для формата с 96 лунками, имеют другую конструкцию и предназначены не для колонн микроцентрифуг, а для совместимых пластин для экстракции ДНК на 96 лунок, в которых скважины содержат кремнеземную мембрану. В этом случае экстракция ДНК проводится с использованием заранее упакованных комплектов для ДНК в формате 96 лунок¹⁴. Эти наборы обладают высокой пропускной способностью, но имеют ограниченную применимость, так как обработка менее 96 образцов часто непрактична.

Автоматизированные роботизированные рабочие станции для экстракции нуклеиновых кислот, несомненно, являются самым удобным методом очистки ДНК, поскольку они требуют минимального участия оператора, что экономит время исследователей и минимизирует стохастические факторы, такие как загрязнение. К сожалению, большинство экстракционных станций не имеют универсальности и работают исключительно с специализированными комплектами. Эти рабочие станции в основном используются в диагностических лабораториях, но для большинства небольших и средних академических лабораторий они невыгодны.

Таким образом, в лабораторной практике существует пробел для среднепроизводительных методов экстракции ДНК, способных обработать от 12 до 96 образцов менее чем за 1 час. Мы представляем 24-колодную стойку, которая позволяет вручную изолировать до 48 образцов с помощью колонок с закрытым спином и до 116 образцов с использованием незакрытых спиновых колонок. В качестве дополнительного оборудования используются центрифуга с вращающимся ковшем и микроцентрифуга с фиксированным углом. Процедура очистки плазмидной ДНК представлена как пример использования 24-луночных стеллажей, поскольку изоляция плазмидной ДНК включает этап уточнения для удаления лизированных клеточных остатков, что затрудняет автоматизацию процесса. Тем не менее, эти стойки могут использоваться практически для любого метода извлечения нуклеиновых кислот из колонок.

Протокол

1. Подготовка оборудования для 3D-печати

1. Печатайте стойку с помощью 3D-принтера с расплавленной нитью и соплом диаметром 0,4 мм. Используйте обычные филаменты PLA, PETG или ABS с 100% заполнением. Установите высоту слоя на 0,1 мм и включите сглаживание поверхности. Настройте настройки печати для обеспечения водонепроницаемости и механической устойчивости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы STL для компонентов стойки приведены в Дополнительном файле 1. Следуйте заданным параметрам печати для базового резервуара. Перед использованием проверьте резервуар, заполнив его 70% этанолом и центрифугировав на более длительное время (1, 2, 5, 10 и 30 минут), чтобы убедиться в отсутствии протечек или повреждений конструкции.
2. Склейте компоненты базового резервуара, чтобы получить герметичный блок.

2. Бактериальная культура и лизис

1. Инокулятируйте преобразующие E. coli в 3–5 мл среды LB, содержащие соответствующие антибиотики. Инкубировать ночь (12–16 часов) при 37 °C с встряхиванием.
2. Собирайте клетки центрифугированием при 2 000 × г в течение 10 минут. Отбросьте супернатант.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные гранулы могут храниться при −20 °C перед обработкой.
3. Добавьте 250 мкл буфера ресуспензии (Buffer P1 с RNase A) в гранулу. Полностью подвесьте с помощью вихря или пипетирования.
4. Добавьте 250 мкл буфера лизиса (буфер P2). Смешивайте, аккуратно переворачивая трубку 4–6 раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте интенсивного смешивания, чтобы предотвратить сдвиг геномной ДНК.
5. Добавьте 350 мкл нейтрализационного буфера (буфер N3). Сразу же тщательно перемешайте с помощью инверсии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Должен образоваться белый осадок, что указывает на успешную нейтрализацию.

3. Сборка фильтрационного блока

1. Поместите колонки связывания ДНК в слой держателя столбов стойки.
2. Разместите крышки колонок в специально отведённые прорези, чтобы закрепить их во время центрифуга.
3. Разместите столбцы уточнения/фильтрации в слое фильтра непосредственно над столбцами связки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если фильтрующие колонки недоступны, центрифугайте лизат в микротрубках и перенесите супернатант в связывающие колонны.

4. Клиренс лизатов и связывание ДНК

1. Перенесите нейтрализированный лизат из шага 2.5 в фильтрационные колонны.
2. Поместите собранную стойку в ротор с поворотной пластиной.
   ВНИМАНИЕ: Обеспечивайте правильную балансировку, используя стойку для противовесов равной массы и идентичной конфигурации.
3. Центрифуга при 2 000 × г в течение 1 минуты при комнатной температуре.
4. Снимите решётку из центрифуги.
5. Удалите и уберите слой фильтрующего столбца.

5. Стирка

1. Сбросьте поток из резервуара в контейнер для отходов. Соберите стойку с колоннами для крепления.
2. Добавьте 500–700 мкл буфера для мытья в каждую колонку с помощью многоканальной пипетки.
3. Центрифуга при 2 000 × г в течение 1 минуты.
4. Сбросьте поток из резервуара.
5. Повторяйте промывку, добавляя буфер для стирки в каждую колонку и центрифугая при 2000 × г в течение 1 минуты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Колонны могут храниться при комнатной температуре или при 4 °C после стирки.

6. Сушка и элюция

1. Снимите крепящие колонки с стойки и перенесите их в трубки для сбора объёмом 2 мл.
2. Центрифугуйте при >10 000 × г на 1 минуту, чтобы высушить мембрану.
3. Переведите колонки на чистые трубки объёмом 1,5 мл.
4. Добавьте 50 мкл буфера элюции или воды непосредственно к мембране. Инкубировать 1 минуту при комнатной температуре.
5. Центрифугу при >10 000 × г в течение 1 минуты для элюции ДНК.

7. Необязательно: совместное осаждение с диоксидом титана

1. Смешайте буфер лизиса с порошком диоксида титана в соотношении объёма к массе 2:1.
2. Добавьте 250 мкл суспензии диоксида титана в лизат. Смешивайте по инверсии.
3. Добавьте 350 мкл нейтрализационного буфера и тщательно перемешайте.
4. Центрифуга при 2 000 × г в течение 1 минуты.
5. Собирайте супернатант, не тревожа осадок.
6. Перенесите супернатант в колонну связывания.

Результаты

Вариации стойк
Мы разработали четыре версии стеллажей, подходящих для широкого спектра моделей центрифуг, что позволяет использовать ресурсы, доступные в различных лабораторных условиях, и учитывая предпочтения пользователей. Все стойки имеют формат с 24 лунками, но в зависимости от версии включают дополнительные места для колонн. Подробные размеры и совместимость приведены в Дополнительном файле 2. Изображение собранной стойки в высоком разрешении приведено на дополнительной рисунке S1.

Базовая стойковая версия (рисунок 1) — самая продуктивная конфигурация. Он состоит из четырёх частей и имеет размеры 88 × 130 × 77 мм. Он позволяет одновременно использовать до 48 столбцов при использовании столбцов с заглавными буквами или до 116 столбцов при использовании столбцов без заглавных букв. Компоненты стойки разработаны для удобства использования и минимизации нежелательных эффектов при центрифугировании. Спин-колонки вставляются в слой колонны, который имеет канавки для вставки колпаков; Эти же канавки могут вместить колонны без крышек. Слой колонн лежит на резервуаре. Дренажное отверстие колонн расположено над вырезом водохранилища, что помогает уменьшить брызги между соседними колоннами. Жидкость стекает через отверстие внизу отверстия в резервуар. Ёмкость резервуара составляет примерно 100 мл, вмещая две ступени промывки с большой нагрузкой на колонну. Фильтрующий столбец можно размещать над столбцовым слоем при необходимости, при этом фильтрующие столбцы находятся выше и в контакте с колонками связи. Крышка герметизирует слой, содержащий фильтр или ограничивающие колонны, ограничивая поток воздуха при вращении центрифуги. Базовая стойковая версия совместима с роторами ковша A-2-DWP (например, Eppendorf 5804), ротором 1770 (например, HETTICH Rotina 380) или аналогичными системами.

Версия с мини-стойкой (рисунок 2) подходит для широкого спектра роторов центрифуг. Он состоит из трёх частей и имеет минимальные размеры 82,5 × 128 × 58 мм (с фильтрующей колонкой). Он позволяет использовать до 48 столбцов с заголовками или до 90 столбцов без них. Геометрия этой версии схожа с базовой стойкой, но внешние ряды расположений столбцов удалены и заменены канавками для колпачков колонок. Ёмкость резервуара варьируется в зависимости от печатной версии. Самый маленький резервуар (20 мл) вмещает одну ступень промывки примерно на 30 колонн; Более крупные резервуары обеспечивают большую пропускную способность. Слой колонки фильтра имеет округлые края, обеспечивающие движение роторного ковша в меньших центрифугах. Версия с мини-стойкой совместима с роторами UC-124 (например, Accumax iFuge UC02) или аналогичными системами. При использовании без слоя фильтрующего столба стойка совместима с роторами ковша A-2-MTP (например, Eppendorf 5430) или их аналогами.

Версия без резервуара (без покрытия) (рисунок 3) подходит для пользователей с ограниченным опытом 3D-печати, так как резервуар заменяется внешним контейнером, например, коробкой для наконечника пипетки. Эта версия состоит из трёх частей и имеет размеры 79 × 115 × 61,5 мм. Он позволяет использовать до 48 колонок с крышками или до 78 столбцов без них. Геометрия похожа на предыдущие версии, но отсутствует интегрированного резервуара. Вместо этого для сбора отходов используется подходящий контейнер. Слои колонн и фильтра имеют меньше мест для сидения, а фильтрующий слой включает конические сиденья для предотвращения помех с движением ротора. Основание спроектировано так, чтобы помещаться в стандартные контейнеры и может быть стабилизировано с помощью боковых прокладок. Совместимость зависит от выбранного контейнера, но включает роторы ковша A-2-DWP (например, Eppendorf 5804), роторы 1770 (например, HETTICH Rotina 380) и роторы ковша UC-124 (например, Accumax iFuge UC02).

Версия с крышкой (рисунок 4) — самая простая конфигурация, и она используется вместе с плитами глубоких скважин объемом 5 мл или 10 мл на 24 колодца. Он состоит из одного компонента размерами 73 × 109 × 4 мм и позволяет использовать до 48 колонок. Эта версия совместима с любым ротором центрифуга, поддерживающим соответствующий формат пластин.

Урожайность и чистота
Экстракция ДНК проводилась на культурах E. coli с использованием стандартного ручного протокола микроцентрифуг и метода на основе стойки. Спектрофотометрический анализ показал, что качество ДНК, извлеченной с помощью стеллажей, сопоставимо с тем, что получается стандартным методом. Типичные коэффициенты A260/A280 варьировались от 1,8 до 1,9 для обоих подходов. Общий выход плазмид (мкг) не показал значимой разницы между традиционным методом и экстракцией с использованием реечных конфигураций (рисунок 5); сырые данные приведены в дополнительном файле 2. Плазмидная конформация также сохранялась, с аналогичным распределением расслабленных, линеаризованных и суперспиральных форм (рисунок 6).

Анализ перекрёстного загрязнения
Для оценки возможного перекрёстного загрязнения был проведён шахматный эксперимент. Колонны поочерёдно загружались раствором бромида этидия высокой концентрации (имитируя ДНК с высоким титрам) и водой. После центрифугирования при давлении 2 000 × г распределение красителя ограничивалось отходной зоной непосредственно под загруженными колоннами, и видимого сигнала не было обнаружено ни в соседних скважинах, ни на кончиках соседних колонн (см. рисунок 7). Эти наблюдения показывают, что конструкция стойки снижает вероятность разбрызгивания и переселения между колонками в проверенных условиях.

Для дальнейшей оценки загрязнения была проведена ПЦР в реальном времени с использованием ампликона в качестве загрязнителя (см. Дополнительный файл 2). Усиление фиксировалось только в элюатах из столбцов, к которым был добавлен ампликон (рисунок 8). В испытанных условиях перекрёстное загрязнение не было обнаружено; однако производительность может варьироваться в зависимости от рабочего процесса и типа выборки.

Рисунок 1: Базовая версия схемы сборки стойки. Взрывающийся CAD-вид показывает (A) крышку, (B) слой фильтрующего столбца, (C) слоя держателя столбцов и (D) базового резервуара. Стеллаж состоит из четырёх частей размерами 88 × 130 × 77 мм и позволяет одновременно использовать до 48 колонок с крышками или до 116 колонок без них. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Мини-версия схемы сборки стойки. Взрывной CAD-вид, показывающий (A) слой фильтра-колонны, (B) слой держателя столбцов и (C) базовый резервуар. Эта версия геометрически похожа на базовую, но два боковых ряда сиденья колонн убраны и заменены канавками для колпаков. Он состоит из трёх частей, имеет минимальные размеры 82,5 × 128 × 58 мм (с фильтрующей колонкой) и позволяет использовать до 48 колонок с колпачками или до 90 колонок без них. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой рисунка.

Рисунок 3: Схема сборки стойки без резервуара (без резервуара). Вид взорванного CAD, показывающий (A) слой столбца фильтра, (B) слой держателя столбцов, (C) основание и (D) коробку с кончиком пипетки. В этой версии интегрированный резервуар заменяется внешним контейнером, таким как коробка с наконечниками пипетки. Он состоит из трёх частей, имеет размеры 79 × 115 × 61,5 мм и позволяет использовать до 48 колонок с колпачками или до 78 колонок без них. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Кап-версия 24-колодных стоек .Вид сверху (слева) и сниз (справа). Это самая простая стойковая версия, используемая вместе с глубокими пластинами на 5 мл или 10 мл на 24 колодца. Он состоит из одной части размерами 73 × 109 × 4 мм и позволяет использовать до 48 колонок с колпачками или без. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Сравнение выхода и чистоты ДНК. Спектрофотометрический анализ выхода плазмид (мкг/мл). Статистически значимой разницы в общем выходе плазмид между традиционным методом и экстракцией с использованием реечных конфигураций не наблюдалось. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Сравнение качества ДНК. Формы ДНК визуализировались с помощью агарозного гелевого электрофореза. Расслабленные, линеаризованные и суперспиральные формы ДНК схожи между стандартной ручной экстракцией и экстракцией на основе стойки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Оценка перекрёстного загрязнения. Вид резервуара после центрифугирования, показывающий отдельные бассейны отходов без перекрытия. Колонны были загружены раствором бромида этидия высокой концентрации (имитируя ДНК с высоким титрам) и водой. После центрифугирования красителя не наблюдалось в соседних «водных» скважинах или на концах соседних колонн, что свидетельствует о снижении брызг и переселения между колоннами в проверенных условиях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8: Анализ перекрёстного загрязнения с помощью количественной ПЦР . Кривые усиления для образцов с загрязнителем показаны красным, а образцы только с водой — зелёным. Амплификация была обнаружена только в образцах, содержащих загрязняющий агент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: 3D-файлы моделей для проектирования стоек. Этот набор содержит STL-файлы для всех конфигураций рэков, включая базовую версию с рэком, мини-стойку (с несколькими вариантами высоты резервуара), версию без резервуара и версию с крышкой. Отдельные компоненты (например, базовый резервуар, слой держателя столбца, слой фильтра и крышка) предоставляются для 3D-печати. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Подтверждающие данные и методы. Этот набор содержит таблицу совместимости центрифуг, подробную процедуру теста на перекрёстное загрязнение, наборы данных по исходной ДНК и выходные файлы ПЦР-инструментов, связанные с анализом загрязнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная рисунок S1: базовая версия для стойки (полностью собранная). Изображение высокого разрешения полностью собранной базовой конфигурации стойки, иллюстрирующее общую структуру и расположение компонентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Этот протокол устраняет «разрыв пропускной способности» во многих лабораториях молекулярной биологии. Хотя фильтрующие пластины с 96 лунками быстрее, они могут обладать более низкой способностью связывания или снижением конечных концентраций по сравнению с отдельными спиновыми^{колонками 14}. Адаптируя стандартные спин-колонки к формату пластино-ротор, этот метод сочетает высокий выход колонок с скоростью рабочих процессов на основе пластин.

Стойки наиболее выгодны при обработке более чем 12 образцов. Главной инновацией протокола является использование 24-колодцевых стоек, которые упрощают и ускоряют экстракцию нуклеиновых кислот из колонок за счёт использования общего резервуара для утилизации супернатантных и промывочных растворов. При использовании стеллажей время, необходимое для выполнения этих шагов для 14–116 образцов, сопоставимо с временем, необходимым для 2–12 образцов. Кроме того, усилия оператора снижаются, поскольку повторяющиеся этапы, такие как удаление отдельных трубок, перенос колонок, выброс растворов для промывки и открытие крышек, минимизированы. Поскольку исходные компоненты комплекта (растворы и спиновые колонны) остаются без изменений, ожидается сопоставимое качество ДНК, которое подтверждается представленными результатами.

3D-печать 24-колодных стеллажей возможна на стандартном оборудовании, но для базовых и мини-версий может потребоваться опыт. Версии без резервуара и с крышкой проще и могут производиться с минимальным опытом печати. Ключевым аспектом моделирования сплавленного осаждения является образование микрозазоров между слоями, что может снижать водонепроницаемость при центрифугировании. Испытания показали, что 100% заполнение, толщина стенки резервуара 7 мм и высота слоя 0,1 мм обеспечивают достаточную водонепроницаемость. Нагрев печатного стола и нанесение сглаживания поверхности дополнительно улучшили качество герметизации. В отличие от этого, методы постпечатки с использованием эпоксидных смол или органических растворителей оказались неэффективными, так как деформация при центрифугировании приводила к трещинам и протечкам. Недостаточная толщина стенок также может привести к разрушению конструкции и потере водонепроницаемости, что потенциально может привести к дисбалансу центрифуг. Поэтому рекомендуется предварительное тестирование печатных компонентов.

Четыре реечные версии подходят для широкого спектра центрифуг с ковшовыми роторами, позволяя пользователям выбирать конфигурацию, которая лучше всего соответствует их оборудованию и требованиям к пропускной способности. Базовая стойковая версия обеспечивает максимальную пропускную способность, но требует больших центрифуг и более высокого качества печати. Мини-версия снижает требования к размеру центрифуг, но также снижает пропускную способность. Версия без резервуара упрощает изготовление и совместима с широко доступными контейнерами, такими как коробки для наконечников пипеток, хотя совместимость зависит от геометрии контейнера. Версия с кап-рэком — самая простая конфигурация, но не может использоваться с фильтрующими колонками.

Фильтрующие колонки, не связывающие нуклеиновые кислоты, могут быть менее доступны, чем стандартные связывающие^{столбцы 9}. В их отсутствие могут потребоваться дополнительные этапы уточнения, что увеличивает общее время обработки. В качестве альтернативы могут использоваться фильтрующие наконечники пипетки (1000 мкл) или протокол диоксида титана.

Стеллажи для экстракции функционируют как механическое дополнение к стандартным рабочим процессам экстракции^{ДНК 9} и не изменяют состав буфера или химию колонок (за исключением варианта с диоксидом титана). Соответственно, существенного влияния на качество ДНК не ожидается, что соответствует электрофорезу агарозного геля и сравнению выходов, показывающим схожие формы и количества плазмид по сравнению со стандартным методом.

Хотя использование общего резервуара для отходов создаёт потенциальный риск перекрёстного загрязнения, в проверенных условиях это не наблюдалось. Ключевой конструктивной особенностью является «дымоходная» геометрия выходов колонн, которая обеспечивает разделение между концами колонн и поверхностью отходной жидкости. Для сохранения этого разделения резервуар не следует переполнять, и рекомендуется опустошать его после каждого полного протока.

Одним из ограничений метода является максимальная скорость вращающихся роторов (обычно 2 000 × г). Хотя эта скорость достаточна для этапов связки и промывания, эта скорость недостаточна для полного сушения мембраной. Поэтому требуется последний высокоскоростной этап центрифугирования в микроцентрифуге с фиксированным углом. Несмотря на этот дополнительный шаг, общая экономия времени остаётся значительной для партий более 24 образцов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
3D Printer Filament	NIT, Russia	-	Рекомендуется PETG или PLA
Buffer N3	Qiagen, Netherlands	19064
Buffer P1	Qiagen, Netherlands	19051
Buffer P2	Qiagen, Netherlands	19052
Creality Ender-3 S1 Pro	Creality, China
Elution Buffer	Qiagen, Netherlands	19086
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf, Germany	22626001	Фиксированный угловой ротор
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf, Germany	22625080	Косой ротор с корзиной
Ethidium Bromide	Biolabmix, Russia	EtBr-10
Frit of 1000 μL Filter Pipette Tip	GenFollower, China	E-FTB1000	Часть фильтров колонок
Miniprep Without Filter Barrier Spin Column	JVLAB, China	-	Часть фильтров колонок
Phenol Red	Lenreactiv, Russia	200125
PrusaSlicer	Prusa Research, Czech Republic
QIAprep 2.0 Spin Miniprep Columns	Qiagen, Netherlands	27115
RNase A	Qiagen, Netherlands	19101
Wash Buffer	Qiagen, Netherlands	19065