Цифровая платформа микрофлюидной электропорации для редактирования генома CRISPR с низким входом и трансфекции мРНК в суспензионных Т-клетках и моделях 3D-клеток

Краткое содержание

Этот протокол описывает миниатюрное редактирование генома CRISPR–Cas9 рецептора TCRα/β в первичных Т-клетках человека с использованием «DMF-экции» — цифровой микрофлюидной (DMF) электропорирующей платформы. Метод позволяет параллельно редактировать гены с низким уровнем ввода с высокой жизнеспособностью и дополнительно адаптируется для доставки мРНК в многоклеточные 3D-сфероиды.

Аннотация

Цифровая микрофлюидная (DMF) электропорация обеспечивает точную, малообъёмную генетическую манипуляцию клетками млекопитающих, при этом минимизируя клеточный вклад до 100 раз и сохраняя жизнеспособность. В данном исследовании представлен высокопроизводительный рабочий процесс трансфекции на основе DMF для нокаутирования локуса TRAC с помощью CRISPR в первичных Т-клетках человеческой суспензии и для трансфекции мРНК трёхмерных HEK293T сфероидов. С помощью пространственно отложенных направляющих РНК CRISPR и сборки рибонуклеопротеинов (RNP) на картридже было достигнуто эффективное нарушение локуса TRAC как в популяциях CD4⁺, так и CD8⁺ с использованием всего 10 000 клеток на состояние, при этом жизнеспособность после редактирования превышает 85%. Биофизическая характеристика с использованием анализа, индуцированного потоком и дисперсии Тейлора, показала, что полимерные добавки стабилизируют комплексы Cas9–sgRNA в условиях электропорационного буфера, что способствует воспроизводимому редактированию при объёмах меньше микролитров. Рабочий процесс был дополнительно адаптирован для 3D-приложений путём доставки мРНК EGFP в целостные HEK293T сфероиды, что привело к устойчивой и пространственно равномерной флуоресценции без нарушения роста сфероидов или морфологии. В совокупности эти результаты показывают, что электропорация ДМФ обеспечивает эффективное редактирование генома и доставку мРНК как между суспензионными иммунными клетками, так и многоклеточными сфероидами. Эта платформа предоставляет масштабируемое и малозатратное решение для приложений в терапии CAR-T, функциональной геномике и передовых 3D-клеточных моделях.

Введение

Редактирование генов в первичных человеческих клетках становится всё более центральным как в терапевтической разработке, так и в фундаментальных исследованиях, включая применения в иммуноинженерии, моделировании редких заболеваний и функциональной^{геномике 1}. Хотя электропорация обеспечивает высокоэффективное редактирование генома, традиционные системы на основе кувет обычно требуют до миллионов клеток на каждое состояние, что ограничивает их использование для образцов, полученных пациентами, и редких иммунных^{популяций 2}. Кроме того, эти системы плохо подходят для крупномасштабного рассеивания из-за ограничений по пропускной способности, автоматизации и потреблению^{реагентов 3}.

Микрофлюидная электропорация стала перспективным подходом для редактирования генома с низким^{входом 4}. Однако большинство существующих платформ опираются на архитектуры непрерывного потока, которые включают сложное обращение с жидкостями, ограниченную гибкость в смешивании реагентов и относительно высокие требования к ячейкам по состоянию. В отличие от этого, цифровая микрофлюидика (DMF) позволяет активно управлять дискретными нанолитровыми каплями на планарной электродной решетке, обеспечивая точное управление составом реакции, временем и пространственной локализацией. Этот формат на основе капель типа plug-and-play хорошо подходит для рабочих процессов с низким объёмом и высокой пропускной способностью, где сохранение первичных ячеек и реагентов крайне^{важно 5}.

Недавние исследования продемонстрировали возможность внутриклеточной подачи на основе ДМФ с использованием архитектур электропорации с трёхкапельными элементами, которые генерируют локализованные электрические поля с низким током для эффективной доставки RNP и мРНК при минимизации теплового и электрохимического^{напряжения 6,7,8}. Опираясь на эту основу, была разработана платформа следующего поколения DMF-электропорации под названием «DMF-ection», включающая 48 независимо адресируемых реактивных участков, полную совместимость с автоматизацией и масштабируемое производство^{картриджей 9} (рисунок 1). Картридж DMF состоит из нижней пластины печатной платы и пластиковой верхней пластины, разделённой прокладкой, собранных с помощью защитных защитков в одной правильной ориентации (рисунок 1A). Компоновка 48-плекса организована в восемь идентичных семейств (рисунок 1A–H), каждое из которых содержит шесть независимо адресуемых электропорационных сайтов, поддерживающих до 48 параллельных условий редактирования на картридж (рисунок 1B). Библиотеки направляющих РНК наносятся на поверхность подложки с помощью акустического диспенсера перед сборкой картриджа. Точность позиционирования осадки была подтверждена на всех 48 точках, при этом позиции сброса кластеризовались в пределах субмиллиметрового отклонения от середины электрода (рисунок 1C), что обеспечивает надёжную сборку RNP на картридже. После загрузки элементы и капли жидкого электрода приводятся в действие на картридже, формируя геометрию электропорации трёхкапель (рисунок 1D). После электропорации клетки перегружаются в культивированные пластины для извлечения и дальнейшего анализа, включая проточную цитометрию, секвенирование и микроскопию (рисунок 1E). Эта система обеспечивает высокоэффективное редактирование генома, используя до 100 раз меньше клеток по сравнению со стандартными методами на основе кювета, значительно расширяя доступ к геномной инженерии в приложениях с низким входом и высокой производительностью.

В данном исследовании оценивается эффективность платформы путём доставки нескольких биомолекулярных грузов, включая мРНК и комплексы рибонуклеопротеинов CRISPR–Cas9 (RNP), обеспечивая эффективную трансфекцию и нарушение генов. Помимо первичных Т-клеток, DMF-экция предоставляет обобщённую основу для доставки нуклеиновых кислот в сложные многоклеточные структуры. Трёхмерные (3D) сфероиды и органоидные модели создают значительные барьеры для проникновения реагентов из-за своей архитектуры и хрупкости, а традиционные методы электропорации часто нарушают морфологию или создают гетерогенную доставку. Чтобы оценить, распространяются ли те же миниатюрные принципы электропорации, используемые для редактирования Т-клеток, и на структурированные ткани, рабочий процесс DMF был применён к 3D HEK293T сфероидам. Эти эксперименты показали, что электроувлажнение на основе DMF может мягко позиционировать целые сфероиды внутри трикапельных геометрий и поддерживать равномерную доставку мРНК, сохраняя при этом структуру и рост. Хотя эти результаты выходят за рамки описанного здесь основного протокола Т-клеток, они иллюстрируют более широкое применение программируемой электропорации DMF для новых 3D-клеточных систем, важных для открытия лекарств и моделирования заболеваний.

Протокол

Первичные человеческие Т-клетки, используемые в этом протоколе, были получены у коммерческих поставщиков по информированному согласию донора и в соответствии с применимыми институциональными, этическими и нормативными нормами. Вся обработка биологических материалов, полученных человеком, проводилась в соответствии с институциональными протоколами биобезопасности. Исследователи, внедряющие этот протокол, несут ответственность за то, чтобы их использование первичных человеческих клеток соответствовало требованиям местного институционального контроля (IRB) или этического комитета, применимым нормативам по биобезопасности и соответствующим национальным или региональным законодательным актам, регулирующим использование человеческого биологического материала. В этом исследовании не было связано с использованием клеточного материала, идентифицируемого пациентом.

1. Подготовка и активация первичных человеческих Т-клеток

1. Быстро оттаять первичные человеческие CD3⁺ Т-клетки криоконсервировать в водяной бане при температуре 37 °C. Перенесите клетки в предварительно нагретую базальную Т-клеточную среду и центрифугуйте при 180 × г в течение 10 минут. Сбросьте супернатант и снова взвешайте гранулу в свежем среде.
2. Определите концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью автоматического счётчика ячеек.
3. Ресуспензировать клетки при 1 × 10⁶ клеток/мл в среде культуры Т-клеток с дополнением растворимого тетрамерного антитела CD3/CD28 Т-клеточного активатора (согласно инструкции производителя) и 200 МЕ/мл IL-2. Инкубировать клетки в течение 72 часов при 37 °C, 5% CO₂.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте плотность клеток в диапазоне 0,5–2 × 10⁶ клеток/мл во время активации. Выполнять активацию в пластинах с 96 лунками U-дно для оптимизации контакта и эффективности активации между элементами и активатором.

2. Подготовка направляющих РНК-пятен на субстрате DMF (акустическое обнаружение диспенсера)

1. Восстановить лиофилизированную РНК в воде без нуклеазы до запасной концентрации 100 мкм. В отдельной трубке приготовьте запас поли-L-глутаминовой кислоты (PGA, соль натрия, МВт 15 000–50 000 Да) в воде без нуклеазы. Объедините sgRNA и PGA stock в объёмном соотношении 5:4 (sgRNA: PGA), что даёт итоговую концентрацию sgRNA 55,6 pmol/μL и конечную концентрацию PGA 44,4 мг/мл в воде без нуклеазы. Кратковременно вихрь и центрифуга при 1 000 × г в течение 30 секунд и аликвоты в одноразовых объёмах, а неиспользованные аликвоты хранят при −80 °C до 6 месяцев.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторяющихся циклов замораживания и оттаивания.
2. Добавьте смесь направляющего и PGA на акустическую исходную пластину с низким мертвым объёмом в колодцах, соответствующих желаемой схеме реагирующей площадки.
3. Передайте 40 нл (эквивалентно 2,2 пмоль sgRNA) смеси направляющей-PGA в каждую область обнаружения целей субстрата DMF с помощью калиброванного акустического дозера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: при 55,6 пмоль/мкл 40 нл обеспечивает 2,2 пмоль sgRNA на участок (55,6 × 0,040 = 2,22 пмоль). Высушенные направляющие восстанавливаются при слиянии капель на картридже; Полная подвеска подтверждается стабильной эффективностью редактирования на разных площадках.
4. В биологическом защитном шкафу дайте пятнистым каплям полностью высохнуть на воздухе при комнатной температуре, пока видимая жидкость не останется (примерно 5 минут).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте принудительный поток воздуха или нагрев, так как это может вытеснить или ухудшить направляющую РНК.
5. Соберите патрон DMF.
   1. В биологическом шкафу безопасности выровняйте верхнюю пластину поверх пятнистого подложки, сопоставив асимметричные пластиковые элементы защелкивания верхней пластины с выемками на нижней. Равномерное, одновременное давление вдоль коротких краёв до тех пор, пока не почувствуется явный механический щелчок, подтверждающий полное восприятие фиксирующих элементов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Картридж разработан с одной правильной ориентацией; неправильная сборка не приведёт к защелканию. Держите подложки за края постоянно, чтобы избежать загрязнения или повреждения функциональных поверхностей, а также не скользите подложки друг о друга, так как это может поцарапать поверхностные покрытия.
   2. Контрольная точка: Подтвердите правильную сборку механическим кнопкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет предварительного электрического индикатора целостности покрытия; любые функциональные сбои, вызванные неправильной сборкой, автоматически обнаруживаются и сообщаются в отчете по контролю качества после запуска.
      Точка паузы: храните неиспользованные собранные картриджи в герметичной упаковке с осушителем (пакетами силикагеля) при комнатной температуре до 48 часов.

3. Подготовка клеток

1. Перед каждым применением подготовьте 1 мл полного буфера трансфекции свеже, комбинируя термопорационный буфер, совместимый с DMF, с предоставленным биосовместимым неионным поверхностно-активным веществом в соотношении 20:1 (буфер электропорации: поверхностно-активное вещество), обеспечивая итоговую концентрацию ПАВ 0,05% (v/v). Аккуратно перемешайте и держите на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: DMF-совместимый трансфекционный буфер, используемый здесь, представляет собой низкопроводный, изотонический буфер (проводимость: 3,5 мС/см, осмолальность: 305 мОсм/л). Исследователи, использующие альтернативные буферы, должны проверить совместимость с DMF-приводом и жизнеспособность клеток. Биосовместимый неионный поверхностно-активный материал служит для уменьшения фиксации капель; если предоставленное поверхностно-активное вещество не используется, то подходящая замена.
2. Один раз промывайте активированные Т-клетки с помощью Transfection Buffer (не содержащего ПАВ). Центрифугировать при 180 × г в течение 5 минут, аспирировать супернатант и повторно суспензировать клеточную гранулу в полном трансфексионном буфере (содержащем поверхностно-активное вещество) при 1,0 × 10⁷ клеток/мл при общим объёме 100 мкл на картридж. Держи на льду.
3. Непосредственно перед загрузкой на картридж добавьте нуклеазу Cas9 непосредственно к 100 мкл T-элементной суспензии и смешайте с помощью аккуратного пипетирования; Держи на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для первичных Т-элементов Cas9 заряжается при 42 пмоль на 100 мкл объёма картриджа (0,42 пмоль/мкл). Каждый участок электропорации обрабатывает примерно 1 мкл суспензии ячейки, обеспечивая 0,42 пмоль Cas9 за одну редакцию. Оптимизируйте эту дозировку при адаптации к другим типам иммунных клеток (см. таблицу 1).

Компонент	Итоговая концентрация на редактирование
Cas9	0,42 пмоль в ~1 мкл капли
sgRNA	2,1 пмоль (от точки 40 нл)
PGA	44,4 мг/мл в смеси для спотирования
Поверхностно-активное вещество	0,05% (v/v)
Вход ячейки	~10 000 ячеек

Таблица 1: Сводная таблица конечных концентраций в каждой капле трансфекции.

4. Трансфекция на платформе DMF-ection

1. Используя многоканальную пипетку, впустите 10 мкл смеси T-элемента/Cas9 в каждый из 8 портов загрузки ячеек и 10 мкл полного буфера трансфекции в 16 портов загрузки жидких электродов (как показано на рисунке 1).
2. Установите напряжение на 500 В, длительность импульса на 3 мс и количество импульсов на 2. Инициируйте последовательность электропорации согласно инструкциям платформы.
   1. Контрольная точка: Просмотрите отчёт по QC после пробега сразу после забега. Спорадические отказы (<10% участков) не требуют вмешательства. Если сбои систематические, замените картридж на предоставленную плату контроля качества, проведите проверку состояния системы (~2 минуты) и обратитесь в техническую поддержку, если проблемы сохраняются.

5. Разгрузка и восстановление отредактированных Т-клеток

1. С помощью жидкостного обработчика перенесите электропорированные ячейки из каждого места реакции в 96-колодную U-дно пластину, содержащую 150 мкл предварительно нагретой базальной Т-клеточной среды с добавлением 200 МЕ/мл IL-2.
2. Инкубировать клетки в течение 72 часов при 37 °C, 5% CO₂, чтобы обеспечить смену белков и изменения экспрессии поверхностных рецепторов.

6. Анализ проточной цитометрии нокаутирования TRAC

1. Перенесите клетки на стерильную коническую нижню пластину с 96 лунками, чтобы уменьшить потерю между промывками. Промыйте клетки дважды буфером проточной цитометрии (1× PBS, 2% FBS, 2 мМ EDTA), центрифугировав при 400 × г в течение 5 минут и удаляя супернатант, аккуратно переворачивая коническую нижнюю пластину. Клетки останутся гранулированными в пластине.
2. Приготовьте мастер-микс для поверхностного окрашивания, содержащий антитела анти-CD4, анти-CD8 и анти-TCRα/β в буфере Flow Cytometry в рекомендованных производителя концентрациях. Добавьте 25 мкл главной смеси в каждую скважину и инкубуйте 20 минут при 4 °C, защищённые от света. Постирайте дважды с 1× PBS (без FBS), центрифугируя при 400 × г в течение 5 минут. Суспензировать клетки в 100 мкл по 1× PBS с жизнеспособным красителем при 1:1 000 (v/v) и инкубировать 10 минут при комнатной температуре, защищённой от света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конические нижние пластины эффективны для гранулирования клеток; Проверьте, что клетки хорошо подвешены на всех этапах.
3. Промывайте клетки дважды буфером проточной цитометрии и повторно суспензируйте в 150–200 мкл на образец для сбора.
4. Настройте цитометр с соответствующими лазерными линиями и наборами фильтров для используемых флуорохромов (например, возбуждение 488 нм для красителя жизнеспособности; 405 нм или 488 нм для поверхностных маркеров по мере необходимости). Устанавливайте напряжения с помощью однократных регуляторов компенсации и неокрашенного образца. Соберите минимум 5 000 живых синглет-мероприятий на каждый образец. Гейт последовательно на: рассеивающие синглеты → живые клетки (отрицательный краситель жизнеспособности) → CD4⁺ или CD8⁺ → экспрессии TCRα/β.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При стандартных условиях общее количество живых событий может варьироваться от 5 000 до более чем 10 000 на образец после потерь при промывке и окрашивании, при условии, что клетки успели размножиться.
5. Определите нарушение гена TRAC , измеряя частоту TCRα/β-отрицательных клеток в популяциях CD4⁺ и CD8⁺. Отчёт эффективности knockout как процент TCRα/β-отрицательных ячеек относительно живого синглетного элемента для каждого подмножества.

Результаты

Ожидаемые результаты
Электропорация 10 000 активированных Т-клеток за каждое состояние обычно приводит к >85% эффективности нокаутирования TRAC с >95% жизнеспособностью через 72 часа после трансфекции. Проточная цитометрия показывает явную потерю окрашивания TCRα/β в условиях TRAC-таргетирования по сравнению с нетаргетируемыми sgRNA контролями (NTC) и контролями, не подвергающимися электрическим полям. Если не указано иное, n обозначает независимые DMF-экционные забеги, выполняемые в разные дни. Технические копии из одной партии картриджей усреднялись до статистического анализа и не вносят независимый вклад в n. Все эксперименты с Т-клетками, описанные здесь, проводились с использованием криоконсервированных клеток, полученных от одного здорового донора. Вариативность между донорами на одной платформе также характеризуется⁹.

Улучшенная стабильность рибонуклеопротеинов Cas9–sgRNA при электропорации благодаря добавкам анионных полимеров
Основным требованием к проектированию цифровой микрофлюидики является высокогидрофобная поверхность, которая позволяет каплям свободно скользить во время электроувлажнения. Хотя это свойство важно для движения капель и точного срабатывания, оно создаёт трудности при загрузке реагентов. Для приложений массива скрининга крайне важно, чтобы пользовательские библиотеки полезной нагрузки можно было напрямую размещать на поверхности картриджа. Это позволяет макетам реагентов отражать дизайн библиотеки пользователя и обеспечивает бесшовное выполнение массив экспериментов без дополнительного переноса или ручного вмешательства. Нано-дозирование с акустическим дозатором отлично подходит для этой задачи, так как он может с высокой точностью передавать нанолитровые объёмы по большим массивам на различные поверхности. Однако, когда капли попадают на гидрофобную поверхность картриджа, они часто отскакиваются, слепляются или не распространяются равномерно, что приводит к неравномерному отложению и восстановлению. Эта изменчивость наиболее заметна при промежуточных объёмах капель от 40 нл до 120 нл (рисунок 2A, n = 3 на каждое условие, *** p значение < 0,01), где предполагается, что кинетическая энергия капли достаточно высока, чтобы вызвать отскок, но поверхностная адгезия недостаточна для закрепления жидкости. В результате прямое нанесение на картридж при высоких дозировках полезной нагрузки может быть ненадёжным без дальнейших модификаций. Для смягчения этого эффекта реагенты дополнялись биобезопасным полимером поли-L-глутаминовой кислотой (PGA). PGA — это биоразлагаемый отрицательно заряженный полипептид, широко используемый в фармацевтических формулах как стабилизатор с отличной совместимостью для рабочих процессов с живыми клетками. Предполагается, что заряженный хребет снижает угол контакта капли и способствует более равномерному распространению, снижая отскок и улучшая поверхностную адгезию. При наличии PGA объёмы отложенных флуоресцеина линейно масштабировались по сравнению с поглощением, и дисперсия значительно уменьшалась между картриджами. Статистический анализ подтвердил, что PGA значительно улучшает воспроизводимость при объёмах 40, 90 и 120 нл (***p < 0,001, ****p < 0,0001), тогда как очень мелкие капли (10–20 нл) показали мало различий, так как отскок менее выражен при низких кинетических энергиях.

Далее было оценено добавление полимерных добавок, используемых в процессе DMF, на предмет их влияния на поведение Cas9–sgRNA рибонуклеопротеинов (RNP) в условиях низкого объёма буфера, используемых для электропорации. Для этого была использована технология анализа дисперсии, индуцированной потоком (FIDA). Был выбран FIDA, поскольку он обеспечивает точное измерение гидродинамического радиуса и аффинности связывания в фазе раствора, позволяя количественно оценивать взаимодействия белков и нуклеиновых кислот при тех же буферных условиях, что и в экспериментальных условиях. FIDA показала, что свободная sgRNA обладает гидродинамическим радиусом (Rh) 3,45 ± 0,26 нм, что соответствует небольшому одноцепочечному виду РНК. Титрование с Cas9 дало стабильный комплекс RNP с резусью 15,32 ± 0,46 нм и субнаномолярной аффинностью связывания (KD = 0,70 ± 0,14 нм) (рисунок 2).

Для оценки эффекта стабилизации полимера в направляющую РНК до образования РНК добавляли поли-L-глутаминовую кислоту (PGA). Наличие PGA снизило видимую сродство между Cas9 и sgRNA (K_D = 67,7 ± 9,5 нм) и уменьшило размер комплекса примерно до 10 нм (рисунок 2A, правая панель). Хотя сниженная аффинность указывает на менее тесно связанные комплексы, меньший и более однородный_{R h} указывает на то, что PGA предотвращает формирование увеличенных сборок RNP (рисунок 2B).

Далее стабильность RNP оценивалась в условиях электропорации с помощью дисперсионного анализа Тейлора (рисунок 2C). Без полимера смеси Cas9–sgRNA давали широкие, плохо подогнанные тейлорграммы, указывающие на агрегацию (см. рисунок 2B). В отличие от этого, добавление 0,0025 мг/мл PGA дало чётко определённые монодисперсные дисперсионные профили (R² = 0,999) с R_h ~ 9,6 нм. Эти результаты показывают, что PGA предотвращает агрегацию и улучшает однородность RNP, тем самым поддерживая воспроизводимую нанолитровую электропорацию. Эта стабилизация даёт механистическое обоснование высокой эффективности редактирования, наблюдаемой в экспериментах с Т-клетками на последующих этапах.

Эффективность редактирования, зависящая от дозы, в первичных Т-клетках

Хотя эксперименты FIDA показали, что PGA снижает эффективность сборки RNP, предполагалось, что результаты функционального редактирования страдают меньше, поскольку электропорация обычно проводится с избытком направляющей РНК относительно Cas9. Поэтому объём входа PGA–RNP был оценён с учётом влияния на нокаут-эффективность в первичных человеческих Т-клетках в локусе TRAC (рисунок 2D). На четырёх картриджах эффективность редактирования была стабильно высокой (>75–80%) при входах RNP 40 нл (2,1 пмоль), 20 нл (1,05 пмоль) и 10 нл (0,53 пмоль), с минимальной вариабельностью между подмножествами CD4⁺ и CD8⁺ . Даже при 5 нл (0,26 пмоль) редактирование оставалось устойчивым, хотя наблюдалось небольшое снижение по сравнению с более высокими дозами. При минимальной испытанной дозе (2,5 нл, 0,13 пмоль) эффективность редактирования значительно снизилась, достигнув плато около ~60% TRAC KO. Органы управления подтвердили специфику монтажа: ямы без электропорации (0V) и вне картриджа (OCC) показывали только фоновый вытеснение. Повышенная TCR-отрицательная частота, наблюдаемая в популяции CD8⁺ вне картриджа (OCC), вероятно, отражает донорско-специфическую базовую понижение TCR после активации, независимо от электропорации или редактирования генов, поскольку эти клетки не подвергались воздействию картриджа. В совокупности эти результаты демонстрируют, что DMF-экция обеспечивает эффективное редактирование с помощью CRISPR на входах RNP масштаба нанолитров. Важно отметить, что редактирование было сопоставимо между CD4⁺ и CD8⁺ Т-ячейками, что подчёркивает применимость платформы для всех подмножеств Т-ячеек и позволяет снизить использование RNP более чем на порядок величины без ущерба для эффективности нокаутирования.

Эффективное нарушение генов в первичных CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетках с помощью миниатюрной DMF-экции
Для более глубокой проверки эффективности процесса DMF-экции был оценён нокаут локуса TRAC с помощью CRISPR–Cas9 в первичных человеческих клетках CD4⁺ и CD8⁺ с использованием всего 10 000 активированных клеток на каждое состояние. Были включены три экспериментальные группы: состояние TRAC-таргетирующего направляющего (TRAC KO), нетаргетный контроль (NTC) для учёта неспецифических эффектов доставки RNP и контроль вне картриджа (OCC) для установления базовой экспрессии TCRα/β в необработанных, неманипулируемых клетках. Для идентификации живых синглетов применялась стандартная стратегия гейтинга, за которой следовали подмножества CD4⁺ и CD8⁺, а также экспрессия TCRα/β (рисунок 3A). Высокоэффективное нарушение гена локуса TRAC было достигнуто в обоих подмножествах Т-клеток в 40 независимых электропорациях. В CD4⁺ Т-клетках эффективность выбивания TRAC достигла 88,4 ± 4,9%, по сравнению с 3,2 ± 4,7% в NTC и 9,8 ± 5,1% при OCC. Сопоставимый результат был зафиксирован в CD8⁺ Т-клетках, где TRAC KO достиг 89,8 ± 4,2% против 4,2 ± 7,4% (NTC) и 20,2 ± 4,9% (OCC) (рисунок 3B, слева). Важно, что электропорация не вызывала значительной цитотоксичности в разных условиях. Жизнеспособность превысила 96% во всех группах, при этом не было значимой разницы между условиями TRAC KO (97,1 ± 1%), NTC (96,8 ± 1%) и OCC (97 ± 1%) (рисунок 3B, справа). В совокупности эти данные демонстрируют, что электропорация DMF обеспечивает надёжное, высокоэффективное нарушение TRAC, сохраняя при этом жизнеспособность клеток на нескольких независимых запусках. Первичные человеческие Т-клетки были получены из коммерческих источников с информированного согласия донора и в соответствии с этическими нормами учреждения и поставщиков.

Обработка HEK293T сфероидов с помощью цифровой микрофлюидики
Далее был оценён рабочий процесс цифровой микрофлюидной электропорации для приложений с многоклеточными трёхмерными структурами. Полые HEK293T сфероиды формировались путём посева примерно 100 клеток на каждую скважину в микропластинах с низким уровнем прикрепления и культивирования в течение 24 часов для обеспечения образования сфероидов (рисунок 4A). Сформированные сфероиды затем собирались, подвешивали и загружали на цифровой микрофлюидный картридж для электропорации. После обработки сфероиды были выгружены в пластину с 96 лунками для дальнейшей визуализации и анализа роста.

Для достижения среднего восстановления в один сфероид на скважину после электропорации на патрон намеренно загружалось избыточное количество сфероидов для компенсации потерь материала при обработке и транспортировке. Примерно 192 сфероида были перевзвешены в 100 мкл электропорерационного буфера и загружены на картридж. Каждое семейство реакций получало ~9,3 мкл суспензии, что соответствует ~18 сфероидам, при этом отдельные капли содержали ~1 мкл (1–2 сфероида на каплю). Поскольку примерно половина сфероидов оставалась в порте заряжания во время работы патрона, такая стратегия загрузки приводила к среднему ~1 сфероиду на трикапельную электропорационную точку.

Анализ извлечения сфероидов показал, что 0–1 сфероид обычно разгружается на скважину после электропорации, что соответствует примерно 4–6 сфероидам, извлечённым в каждой группе реакций (рисунок 4B , левая панель). Это восстановление ниже теоретического максимума и отражает потери, возникающие во время промывки, аспирации супернатанта и удержания сфероидов в порте загрузки. Эти потери объясняются малым диаметром сфероида (~100 мкм) и внутренней сложностью поддержания равномерного распределения неодноклеточных структур внутри суспензии. В результате некоторые сфероиды остаются неравномерно распределенными или не входят в трёхкапельную область. Загрузка избыточного количества сфероидов обеспечивала наличие как минимум одного сфероида в большинстве участков электропорации, что позволило проводить последовательный анализ по дальнейшему анализу, что демонстрируется на микроскопе DAPI-окрашённого сфероида в микрофлюидном картридже (рисунок 4B, правая панель). Дальнейшая оптимизация процессов может уменьшить количество сфероидов, необходимых для достижения эквивалентного восстановления. Несмотря на эти потери при обращении, рабочий процесс позволял аккуратно позиционировать целые сфероиды внутри геометрии электропорации трёх капель.

Доставка мРНК EGFP и жизнеспособность в сфероидах HEK293T
Эффективная доставка мРНК EGFP в HEK293T сфероиды была зафиксирована после электропорации (50 нг мРНК GFP на одну сфероидную). Флуоресцентная микроскопия, проведённая через 24 часа после электропорации, выявила устойчивую и пространственно однородную экспрессию GFP во всех электропорированных сфероидах, тогда как флуоресценция не была обнаружена при 0 В или вне картриджа контроля (рисунок 4C, левая панель). Количественный анализ нормированной средней интенсивности флуоресценции (MFI) на область сфероидов подтвердил успешную трансфекцию при обоих тестируемых наборах параметров электропорации (рисунок 4C, средняя панель). В частности, сфероиды, электропорируемые при 500 В, 2 мс, 2 импульса, демонстрировали MFI 6,96 × ^10-5 ± 3,50 × ^10-5, тогда как те, что были электропорированы при 375 В, 6 мс, 1 импульс, показали MFI 5,05 × ^10-5 ± 3,29 × ^10-5. Измеримая флуоресценция не была обнаружена в контрольных условиях (0 ± 0). Оба условия электропорации обеспечивали значительно более высокую флуоресценцию по сравнению с контролями (p < 0,05), при этом статистически значимой разницы между параметрами импульсов не было. Для оценки негативного влияния электропорации на рост сфероидов или структурную целостность измеряли диаметры сфероидов ежедневно в течение 5 дней после обработки. Электропорированные сфероиды демонстрировали кинетику роста, сопоставимую с необработанными контролями, что указывает на то, что трансфекция мРНК не ухудшала жизнеспособность или пролиферативную способность сфероидов (рисунок 4C, правая панель). В совокупности эти результаты демонстрируют, что цифровая микрофлюидная электропорация позволяет эффективно доставлять мРНК в целостные многоклеточные сфероиды, сохраняя при этом структурную целостность и рост, что подтверждает возможность расширения этой платформы на трёхмерные клеточные модели.

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистическая значимость определялась с помощью одностороннего ANOVA с пост-хок коррекцией Тьюки для множественных сравнений, при этом порог значимости составлял p < 0,05. N значений обозначают независимые биологические репликаты (отдельные доноры или независимые картриджи), как указано на рисунке.

Рисунок 1. Архитектура и рабочий процесс платформы электропорации DMF. (A) Фотография патрона DMF. (B) Аннотированная схема собранной схемы картриджа из 48 плексов (центральное изображение), показывающая (A–H) организацию восьми идентичных семейств, каждая из которых содержит шесть независимо адресируемых электропорационных точек, с портами для загрузки жидких электродов, портами загрузки ячеек, анодными, катодными и нано-пятнами областями, помеченными (изображение вставки слева). Ключевые функции, включая порты для загрузки, порты для разгрузки и монтажные кнопки, маркированы. Патрон собирается путём защёлковой посадки обеих пластин в одной правильной ориентации до тех пор, пока не ощущается чёткое механическое зацепление. Правое изображение: карта подачи жидкостного обработчика, показывающая цветные позиции для портов загрузки (красный), порты для разгрузки (розовый) и зоны обнаружения целей (синий). (C) Слева: изображение, показывающее точность позиционирования акустического подачи на всех 48 участках (n = 48), с отображением позиций спуска относительно середины электрода (мм). Плотная кластеризация подтверждает точность осадки субмиллиметров. Справа: репрезентативные фотографии, показывающие правильно центрированное пятно перед регидратацией каплей клетки (сверху) и во время регидратации, когда капля перемещается туда-сюда, где находится направляющая для повторного подвешения (внизу, красная стрелка). (D) Изображение сверху с видом отдельных областей электропорации, показывающее поэтапное движение капель от (i) регидратации полезной нагрузки путём перемещения капли туда-сюда по отложенной направляющей РНК, (ii) перемещения к месту электропорации между анодом и катодом, где капля ячейки соединяется с двумя фланговыми каплями жидкого электрода и получает импульс, и (iii) полный три-дроп перемещается в порт разгрузки перед извлечением жидкостным обработчиком. (E) Схема сквозного рабочего процесса. Направляющая РНК наносится на подложку картриджа с помощью акустического дозера. Ячейки и полезный груз готовятся и загружаются на картридж с помощью автоматического жидкостного обработчика. Электропорация проводится на платформе DMF. Клетки выгружаются в пластину с 96 лунками и переносятся в инкубатор для восстановления. Анализ на последующих этапах проводится с использованием проточной цитометрии, микроскопии, секвенирования следующего поколения или других соответствующих показаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Влияние полимерных добавок на осаждение и сборку RNP. (A) Полимерная добавка улучшает точность акустического осаждения. Поглощение флуоресцеина после осаждения и восстановления на четырёх независимых картриджах, с поли-L-глутаминовой кислотой или без неё. Дисперсия снижалась при промежуточных объёмах (40–120 нл) при наличии PGA. 
(B) Влияние PGA на сборку Cas9–sgRNA. Кривые связи по аффинности FIDA измеряют гидродинамический радиус (Rh) при отсутствии (левая панель) или присутствии (правая панель) PGA. Свободная sgRNA показала резусь 3,45 ± 0,26 нм, тогда как титрование Cas9 дало размер комплекса RNP 15,32 ± 0,46 нм (Kd = 0,70 ± 0,14 нм). Добавление PGA уменьшило размер комплекса и ослабило аффинность связывания в зависимости от концентрации. С добавлением 0,005 мг/мл PGA свободная sgRNA показала резульс 4,31 ± 0,07 нм, а титрование Cas9 дало размер комплекса RNP 10,21 ± 0,38 нм (K)._d = 67,7 ± 9,5 нм). Эксперименты проводились в буфере электропорации с низкой проводимостью с 0,05% плюронным F-68. Флуоресценция была обнаружена на 480 нм с помощью интегрированного светодиодного модуля. Для всех экспериментов использовался постоянно покрытый капилляр (Ø 75 мкм, L = 100 см). Для проверки влияния полианионных полимеров на сборку RNP в анализные смеси с концентрациями 0,0025 мг/мл и 0,005 мг/мл добавляли ПГА. Эти условия были выбраны для моделирования диапазона, используемого в буферах цифровой микрофлюидики, электроувлажнения и электропорации. Для анализа прямого связывания в качестве флуоресцентного индикатора использовалась 10 нМ sgRNA с маркировкой FAM, направленная на локус TRAC. Увеличивающиеся концентрации нуклеазы Cas9 (до 500 нм) были титрированы относительно индикатора в анализе CapMix для создания дисперсионных профилей для формирования комплекса. Все эксперименты проводились при 25 °C, при этом каждая точка потребляла 40 нл индикатора и ~12 мкл анализируемого вещества (Cas9). Эксперименты проводились по следующей последовательности: (1) промывка с фосфорной кислотой 0,1% при 3500 мбар в течение 30 секунд; (2) промывка с помощью буфера на 3 500 мбар в течение 30 секунд; (3) заполнение капилляра анализированным веществом при 3 500 мбар в течение 20 секунд; (4) впрыск индикатора на 50 мбар в течение 10 секунд; (5) мобилизация и измерение с помощью аналита при 400 мбар в течение 180 секунд. Гидродинамические радиусы рассчитывались с использованием извлеченной пиковой ширины при половине максимальной высоты пика и констант диссоциации (K_D) определялись нелинейным регрессионным подходом к модели связывания 1:1. (C) Влияние PGA на стабильность RNP. Профили дисперсии Тейлора комплексов Cas9–sgRNA с PGA и без них, выполненные с использованием 500 нМ Cas9 нуклеазы и 50 нМ FAM-метированной sgRNA. При отсутствии PGA стабильный комплекс не наблюдался, что подтверждается увеличением образования крупных агрегатов и уменьшающимся сигналом из комплекса со временем (слева). Добавление 0,0025 мг/мл PGA дало чётко определённый монодисперсный тейлорграм с минимальной агрегацией, измеряющей R_h ~ 9,6 нм (R² = 0,999, справа). Комплексная стабильность оценивалась при стандартных условиях электропорации (500 нМ Cas9 + 50 нМ sgRNA) с или без 0,0025 мг/мл PGA. Образцы предварительно смешивались и поддерживались при температуре 4 °C в лотке для впуска, а инъекции проводились с интервалом в 10 минут в течение нескольких часов. Эксперименты проводились по следующей последовательности: (1) промывка с фосфорной кислотой 0,1% при 3500 мбар в течение 30 секунд; (2) промывка с помощью буфера на 3 500 мбар в течение 30 секунд; (3) заполнение капилляра аналитом (буфером анализа) при напряжении 3 500 мбар в течение 20 секунд; (4) впрыск индикатора на 50 мбар в течение 10 секунд; (5) мобилизация и измерение с помощью аналита при 400 мбар в течение 180 секунд. Нестабильное формирование комплекса наблюдалось через формирование крупных агрегатов (шипы в Тейлорграме) и снижение сигнала. Стабильные комплексы идентифицировались с помощью хорошо подгонённых, монодисперсных тейлорграмм (R² > 0,99), и R_h Значения извлекались из подгонных профилей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Эффективность и жизнеспособность TCR альфа/бета-нокаут в первичных Т-клетках человека. (A) Репрезентативная стратегия гейтинга потоковой цитометрии для живых синглетов, подмножеств Т-клеток CD4⁺ и CD8⁺, а также экспрессии TCRα/β в контролируемых (нетаргетируемых sgRNA) и экспериментальных (TRAC sgRNA) условиях. Клетки были последовательно ограничены на FSC/SSC, синглетах, жизнеспособности и CD4⁺ или CD8⁺ до оценки экспрессии поверхности TCRα/β. (B) Слева: эффективность выбивания TCRα/β в CD4⁺ и CD8⁺ T-элементах в трёх условиях: TRAC KO, управление без прицеливания (NTC) и управление вне патрона (OCC). CD4⁺: TRAC KO = 88,4 ± 4,9% (n = 40), NTC = 3,2 ± 4,7% (n = 24), OCC = 9,8 ± 5,1% (n = 18). CD8⁺: TRAC KO = 89,8 ± 4,2% (n = 40), NTC = 4,2 ± 7,4% (n = 24), OCC = 20,2 ± 4,9% (n = 18). Справа: Жизнеспособность после электропорации во всех условиях, гейтинг на синглетах. Жизнеспособность: TRAC KO = 97,1 ± 1% (n = 40), NTC = 96,8 ± 1% (n = 24), OCC = 97 ± 1% (n = 18). Отдельные точки данных показаны со средним и SD. n — независимые электропорезационные пробеги по нескольким картриджам и дням. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Эффективная доставка мРНК в сфероиды HEK293T с помощью DMF-экции. (A) Диаграмма рабочего процесса, описывающая процесс формирования сфероидов и проведения трансфекции сфероидов. Сто HEK293T клеток загружаются в специализированную сфероидную микропластину в каждую скважину и культивируются в течение 24 часов для образования сфероидов диаметром 100 мкм. Сфероиды (192) разгружаются и подвешивают обратно в 100 мкл трансфекционного буфера. Эта подвеска с соответствующей полезной нагрузкой загружается на направляющий пятнистый DMF-эксионный патрон с мощностью 9,3 мкл на семейство. После проведения электропорирования образцы выгружаются в пластину с 96 скважиной для дальнейшего анализа. (B) Слева: количество сфероидов, разгружаемых по семейству на картриджах DMF-экцион, по сравнению с вручную пипетированными внекартриджными системами управления. В центре: флуоресцентное изображение три-дропа, где крупный красный квадрат очерчивает три-дроп, а красный овал окружает сфероид. Справа: флуоресцентное изображение с портом загрузки с загруженными сфероидами (синими кругами). (C) Левая панель: яркие изображения целых HEK293T сфероидов до электропорации и флуоресцентные изображения сфероидов через 24 часа после электропорации мРНК EGFP , по сравнению с контролем 0 В и вне картриджа. (D) Верхняя панель: Количественная оценка средней интенсивности флуоресценции, нормализованной до сфероидной площади для двух электропорированных условий (500 В, 2 мс, 2 импульса; 375 В, 6 мс, 1 импульс). Существенной разницы между электропорируемыми условиями нет, но все электропорированные условия существенно отличаются от 0 В и внекартриджных режимов управления (500 В 2 мс 2 импульса: 6,955 × ^10-5 ± 3,502 × ^10-5, 375 В 6 мс 1 импульс: 5,045 × ^10-5 ± 3,294 × ^10-5, 0 В: 0 ± 0, вне патрона управление: 0 ± 0 (*p < 0,05). Изображения обрабатывались с помощью пакета обработки изображений^{FIJI 10}. (500 В, 2 мс, 2 импульса: n = 6; 375 В, 6 мс, 1 импульс: n = 4; Управление вне патрона: n = 3; Контроль 0 В: n = 3). (D) Нижняя панель: диаметр сфероида после электропорации в течение 5 дней в разных условиях. Диаметр измерялся с помощью FIJI по изображениям фазового сокращения, сделанных с увеличением в 20 раз с помощью инвертированного микроскопа. (500 В, 2 мс, 2 импульса: n = 6; 375 В, 6 мс, 1 импульс: n = 4; Управление вне патрона: n = 3; Контроль 0 В: n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Этот протокол описывает миниатюризированный цифровой микрофлюидный электропорация, который обеспечивает эффективную внутриклеточную доставку в первичные Т-клетки человека с помощью каплей масштаба нанолитра. Основным преимуществом этого метода является возможность редактирования генома CRISPR–Cas9 с использованием всего 10 000 клеток за реакцию, что значительно снижает требования к материалам по сравнению с традиционной электропорацией. Архитектура на основе капель поддерживает автоматизацию, обеспечивая воспроизводимую обработку реагентов и сборку реакций на нескольких параллельных участках.

В предыдущих исследованиях прямой бенчмаркинг платформы DMF-ection с широко используемой системой показал, что традиционная нуклеофекция производила менее 2% GFP-положительных Т-клеток при 10 000 ячейках за редактирование, тогда как платформа DMF-ection достигала >90% эффективности трансфекции при тех же условиях с низким входом. Для массивного экрана из 192 условий платформа DMF требовала в 25 раз меньше ячеек и примерно в 50 раз меньше Cas9 за каждое условие по сравнению с обычными^{методами 9}. Эти сравнения подчёркивают материальные преимущества миниатюризированной DMF-электропорации для применения с низким входом и экранирования

Критические шаги и устранение неполадок
Для успеха критически важно выполнить несколько шагов. Точная калибровка акустического обработчика жидкости обеспечивает точное отложение направляющей РНК на подложку картриджа, что необходимо для равномерной сборки RNP. Если выделение непоследовательно или капли не прилипают к субстрату, проверьте, что PGA включен в смесь направляющей и РНК в правильной концентрации (5 мг/мл) и что акустический дозатор откалиброван под конкретную геометрию исходной пластины. Неравномерное пятнистое выделение на промежуточных объёмах (40–120 нл) чаще всего вызвано отскоком капель на гидрофобной поверхности; Небольшое увеличение концентрации PGA или уменьшение высоты дозы могут решить эту проблему.

Поддержание правильной концентрации ячеек до загрузки важно, так как отклонения плотности могут ухудшать образование капель и снижать эффективность редактирования. Если эффективность редактирования опускается ниже 75%, сначала проверьте, что активация Т-клеток была достаточной (подтвердите апрегуляцию CD25 и CD69 с помощью потоковой цитометрии до электропорации), а также подтвердите, что Cas9 и sgRNA были комбинированы непосредственно перед загрузкой, а не заранее.

Полимерные добавки играют важную роль в стабилизации комплексов Cas9–sgRNA в условиях электропорационного^{буфера 11}. Хотя PGA снижает номинальную аффинность связывания, её стабилизирующий эффект улучшает воспроизводимость и предотвращает агрегацию в нанолитровых объёмах. Это является настраиваемым параметром для исследователей, адаптирующих рабочий процесс к другим белокно-РНК-комплексам.

Устранение неполадок
Неудачное каплявое мостовое соединение
Просматривайте инструментальный отчет по контролю качества после каждого эксперимента. Отсутствие обнаруженного тока указывает на неудачное соединение моста — либо из-за недостатка капель, либо из-за отказа в предохранителе, и это автоматически отмечается системой. Поражённые участки нельзя восстановить за один и тот же забег. Если отказы происходят редко (<10%), никаких действий не требуется; Распределяйте репликаты между несколькими картриджами, чтобы минимизировать воздействие. Если сбои систематические, запустите плату контроля качества и проверку состояния системы, а при сохранении проблем свяжитесь с технической поддержкой.

Непоследовательное обнаружение sgRNA
После подачи визуально убедитесь, что все ожидаемые капли присутствуют, расположены внутри границ электродов и свободны от спутниковых капель. Включите PGA в смесь направляющей РНК, чтобы предотвратить полидисперсию. Если нет капель, проверьте отчёт о запуске диспенсера и повторно, если нужно. При плохом образовании мениска поддерживайте минимум 5 мкл на одну яму, коротко вращайте пластину и мягко постукивайте по ровной поверхности. Работайте с льдом и герметизируйте, когда они не используются, чтобы предотвратить испарение.

Снижение эффективности редактирования
Если наблюдается снижение эффективности редактирования, устраняйте неполадки в следующем порядке: (1) проверьте условия доставки с помощью EGFP мРНК перед переходом к RNP; (2) подтвердить, что измеренный ток контроля качества соответствует ожидаемым значениям; (3) титрация плотности клеток, направляющей РНК и концентрации Cas9; (4) подтверждение высокой жизнеспособности ячеек непосредственно перед загрузкой; (5) проверять целостность реагентов и условия хранения; (6) подтвердить, что метод показания соответствует плотности ячейки и целевому объекту.

Адаптация платформы к альтернативным типам ячеек и моделям
Для других типов первичных иммунных клеток, таких как NK-клетки или регуляторные Т-клетки, параметры электропорации потребуют оптимизации. Размер ячейки является важным фактором, определяющим порог электрического поля, необходимого для мембранной проницаемости: меньшие клетки требуют более высокой напряжённости поля, а крупные ячейки проницаемы при низких напряжениях — хорошо задокументированная связь в биофизике электропорации. В качестве отправной точки для типов клеток меньше активированных CD3⁺ T-ячеек следует поддерживать или немного увеличивать напряжение (500–550 В), сохраняя короткую длительность импульса (2–3 мс), чтобы избежать избыточного теплового напряжения. Для больших элементов уменьшайте напряжение до 350–400 В и модулируйте длительность импульса без превышения 10 мс. Кроме того, микрооптимизация на уровне донора является обычной практикой в электропорации, и параметры, валидированные в здоровых донорских клетках, могут не передаваться напрямую в больной или получаемый от пациента материал. Клетки доноров с гематологическими злокачественными опухоликами, хроническими инфекциями или иммунодефицитом часто демонстрируют изменённые биофизические свойства, поэтому эффективность и жизнеспособность редактирования следует переоценивать для каждого нового донора, особенно при работе с нездоровыми или клиническими образцами. Жизнеспособность клетки следует оценивать через 24 и 72 часа после электропорации, а параметры корректироваться итеративно. Дозу Cas9 также может потребовать увеличения на 1,5–2× по сравнению с протоколом Т-клеток, если эффективность доставки RNP снижается.

Для более крупных или плотных 3D-моделей, таких как органоиды диаметром более 200 мкм, прокладка в картридже может потребовать модификации для увеличения размера конструкции и диффузионных барьеров. Пользователям, использующим такие применения, следует рассмотреть возможность предварительной диссоциации внешних клеточных слоёв для улучшения проникновения реагентов или последовательное применение нескольких импульсных условий. Обратитесь к соответствующему автору для получения рекомендаций по адаптации геометрии капель и параметров импульсов для структур за пределами диаметра сфероида 100 мкм, подтвержденного здесь.

Трансляционная значимость
Трансляционный потенциал этого рабочего процесса выходит за рамки простого нокаутирования. Платформа применялась для гомологически направленного восстановления конструкции GFP объемом 4 кб и функционального анти-HER2 CAR в локусе TRAC в первичных Т-клетках, а также для 45-целевого массивного CRISPR-скрина, идентифицирующего новые регуляторы истощения CD4⁺^{Т-клеток 9}. Эти приложения иллюстрируют путь от оптимизации на уровне протокола к функциональному обнаружению в клинически значимых первичных клеточных моделях. Тем не менее, важные ограничения остаются: функциональные результаты, такие как частота нарушения аллели при секвенировании, секреция цитокинов и пришивка in vivo не были оценены в текущем протоколе и представляют собой необходимые следующие шаги для терапевтической трансляции. Кроме того, хотя платформа поддерживает 48 параллельных реакций на картридж, для больших экранов потребуется многокартриджная параллелизация.

Ограничения
Как и с любой миниатюрной платформой, следует учитывать определённые практические ограничения. Нижняя фенотипизация должна быть адаптирована к малому масштабу реакций; Для получения потоковой цитометрии может потребоваться дополнительные этапы концентрации или пулирование реплицированных скважин для достижения достаточного количества событий. Настройки электропорации платформы могут также потребовать оптимизации для типов ячеек с высокой чувствительностью к электрическим полям, и пользователям следует рассматривать опубликованные параметры как отправные точки, а не как универсально фиксированные значения. Наконец, формальное окрашивание жизнеспособности в длительных точках времени после электропорации не проводилось для рабочего процесса сфероидов, представленного здесь; Отслеживание роста на основе диаметра использовалось как суррогатная мера целостности конструкции и представляет собой важное направление для будущей характеристики.

В целом, DMF-экция, невирусный метод трансфекции, обеспечивает мощный и гибкий подход к редактированию генома и доставке мРНК в условиях низкого входа и высокой пропускной способности. Его совместимость с первичными Т-клетками, структурированными 3D-моделями и автоматизированным обращением с жидкостями расширяет возможности в области клеточной терапии, многоуровневого CRISPR-скрининга и миниатюрной функциональной геномики.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Инструментация
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Spheroid protocol
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Spheroid protocol
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Инструментация
DMEM Media	Gibco	10564011	Media Supplement- Spheroid culture
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfection
DropGenie Transfection System	DropGenie		Инструментация
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Инструментация
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media Supplement- Spheroid culture
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Инструментация
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Spheroid protocol
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T cell media supplement
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Peripheral Blood, Cryopreserved, pan CD3+ Helper T Cells, Negatively Selected
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T Cell Activation media
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T Cell Activation media
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Инструментация
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Инструментация
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Media Supplement- Spheroid culture
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Use a at 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Spheroid protocol
Surfactant F	DropGenie		Transfection- use at 1:20 in DMF compatible buffer to make compete Transfection buffer
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Spheroid protocol