Методическая статья

Обнаружение старения с помощью отражённого света в жировой стромальной сосудистой фракции

171 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70588

⸱

5 июня 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet, 2Nordiska Kliniken Stockholm

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе представлена конфокальная микроскопия с отражённым светом для объективного обнаружения активности бета-галактозидазы, ассоциированной с возрастанием (SA-β-gal), в стромальной сосудистой фракции, выделенной из жировой ткани человека. Метод совместим с иммуноцитохимией, включает контроль pH для количественной оценки, а также предлагает более чувствительную и менее субъективную альтернативу традиционному окрашиванию SA-β-gal.

Аннотация

Клеточное старение — это состояние, вызванное стрессом, характеризующееся постоянной остановкой клеточного цикла и развитием особого секреторного профиля, который влияет на функцию тканей и способствует старению и метаболическим заболеваниям. Активность, ассоциированная со старением β-галактозидазой (SA-β-gal), широко используется как маркер стареющих клеток; однако обычные анализы SA-β-gal часто опираются на субъективную визуальную оценку и предоставляют ограниченную количественную информацию. Эти ограничения особенно заметны у первичных популяций человеческих клеток, таких как стромальная сосудистая фракция (SVF), полученная из жировой ткани, содержащая гетерогенную смесь преадипоцитов, иммунных и эндотелиальных клеток. Здесь мы представляем оптимизированный подход конфокальной микроскопии отражённого света для высокоразрешающего количественного обнаружения активности SA-β-гал в клетках SVF человека. Этот протокол позволяет проводить объективный анализ активности SA-β-gal на отдельных клетках, позволяет одновременно проводить иммуноцитохимию для мультиплексного обнаружения дополнительных маркеров старения или линии, а также включает контрольные методы, соответствующие pH. Объединяя эти особенности, этот метод обеспечивает чувствительный, воспроизводимый и количественный подход к изучению клеточного старения в гетерогенных первичных популяциях человеческих клеток. Она предлагает улучшенную альтернативу традиционной окрашиванию SA-β-gal.

Введение

Клеточное старение — это многоаспектный ответ, который может возникать при различных типах стресса, включая повреждение ДНК, истощение теломер и активацию онкогенов. Это приводит к стабильной остановке клеточного цикла вместе с повышенной устойчивостью к апоптозу, отчасти за счёт индукции антиапоптотическихбелков 1,2. Старение связано с улучшением выживаемости клеток в условиях, где сохранение целостности тканей крайне важно, таких как восстановление иподдержание 3,4. Помимо роли в гомеостазе тканей, старение также способствует нормальному развитию, формируя эмбриональный паттерн 5,6 и выступая барьером для образования опухоли, способствуя очищению повреждённых или потенциально злокачественныхклеток 7,8,9. Хотя старение может выполнять полезные функции, многочисленные исследования выявили противоположный аспект, при котором стареющие клетки приобретают провоспалительный секреторный профиль, способный нарушать местный метаболизм, повреждать окружающие ткани и даже поддерживать прогрессированиеопухоли 10,11,12,13.

Старение обнаруживается в различных типах клеток в различных тканях и часто связано со старением, заболеваниями, нарушениями функций тканей или раком. В печени было показано, что старение клеток печени способствует прогрессированию опухоли путём изменения метаболического гомеостаза с помощью секретируемыхфакторов 14,15. Исследования, изучающиегепатоциты 16 или биопсии всейпечени 17, показывают, что старение этих клеток может способствовать метаболическим сопутствующим заболеваниям, таким как стеатозное заболевание печени, связанное с дисфункцией, и стеатогепатит, связанный с дисфункцией. Кроме того, связь между сахарным диабетом 2 типа и старением привлекла значительное внимание за последнее десятилетие, имея доказательства связи старения с осложнениями, связанными с диабетом, в β-клетках поджелудочной железы,гепатоцитах 16 и адипоцитах 18,19,20,21. Эти результаты подчёркивают важность точного выявления стареющих клеток в метаболических тканях, где их накопление и гетерогенность способствуют прогрессированию заболевания и терапевтическомутаргетированию 22.

Изменения сигнальной передачи и экспрессии белков, связанные с старением, часто специфичны для клеток и тканей; однако несколько признаков в целом характерны для стареющих клеток. Одним из наиболее широко используемых маркеров является повышенная ферментативная активность β-галактозидазы при pH 6.0, называемая стареющим β-галактозидазой (SA-β-gal)23. β-галактозидаза — это лизосомная гидролаза, присутствующая во всех клетках и обычно активная при кислотном pH (~4,5–5,0), где способствует деградации гликозилированных субстратов. Определяющей особенностью SA-β-gal является сохранение активности β-галактозидазы при неоптимальных условиях pH. В классическом анализе клетки инкубируются с синтетическим субстратом 5-бромо-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-гал) при pH 6.0, при этом ферментативная активность снижается в большинстве клеток, но остаётся обнаруживаемой в стареющих клетках. Это приводит к образованию нерастворимого синего осадка, который можно визуализироватьмикроскопически.

Хотя этот анализ широко применяется, обнаружение осадка X-гал традиционно основывалось на яркой микроскопии. Обнаружение в ярком поле основано на визуальной идентификации синего осадка, поэтому обладает ограниченной чувствительностью к низкоуровневым сигналам и состояниям раннего старения. В отличие от этого, изображение отражённого света фиксирует оптическую плотность осадка X-гал, что позволяет количественно обнаруживать в более широком динамическом диапазоне. В последнее время были разработаны фторогенные субстраты для повышениячувствительности 25. Однако эти подходы обычно измеряют активность β-галактозидазы при условиях, не соответствующих классическому pH-зависимому определению SA-β-gal. В результате они могут увеличивать интенсивность сигнала, но снижать специфичность старения. В отличие от этого, врожденная непрозрачность осадка X-гал позволяет его обнаруживать с помощью конфокального отражения света, обеспечивая более чувствительное и количественное показание при сохранении исходного ферментного определения SA-β-гал26.

Со временем были выявлены дополнительные признаки старения, включая повышенную экспрессию ингибиторов циклин-зависимых киназ P16 и P21, а также транскрипционного фактора P53, который регулирует остановку клеточного цикла и другие программыстарения 27,28,29,30,31,32,33 . Эти достижения привели к более строгому определению старения, при котором клетки обычно классифицируются на основе совместного наличия нескольких маркеров. На практике, однако, эти маркеры часто измеряются с помощью различных модальностей: ядерные маркеры, такие как P16 и P21, обычно обнаруживают с помощью флуоресцентных методов, тогда как активность SA-β-гал традиционно оценивается с помощью яркой микроскопии. Это разделение ограничило возможность оценивать несколько признаков старения внутри одной клетки. Визуализация отражённого света преодолевает это ограничение, позволяя напрямую интегрировать обнаружение SA-β-gal с флуоресцентными маркерами в рамках единого процесса визуализации, обеспечивая более надёжную и биологически значимую оценку старения в гетерогенных клеточных популяциях.

Хотя Дедик и коллеги рассматривают ряд ограничений традиционной SA-β-gal визуализации, включая улучшенную чувствительность, использование pH-согласованных контрольных систем для объективного порогового измерения и совместимость с иммуноцитохимией, их метод конфокального анализа отраженного света был оптимизирован специально для изолированных зрелыхадипоцитов 26. Однако старение жировой ткани не ограничивается адипоцитами34,35, и дополнительное понимание можно получить, изучая стромальную сосудистую фракцию (SVF). SVF включает преадипоциты, эндотелиальные и фибробластные популяции, а также различные иммунные клетки, все из которых могут подвергаться старению и способствуют ремоделированию жира, воспалению и изменению метаболической сигнализации. Поэтому характеризация старения внутри этого гетерогенного компартмента важна для связи процессов, специфичных для типа клеток, с исходами на уровне тканей и системой.

Здесь мы расширяем обнаружение отражённого света SA-β-gal на клетки SVF, что позволяет применять его на различных типах клеток жировой ткани. Сочетая этот подход с иммуноцитохимией, метод позволяет проводить интегрированный анализ активности SA-β-gal на отдельных клетках наряду с линейными и функциональными маркерами в первичных образцах человека.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с уставом Хельсинкской декларации. Исследование было одобрено региональным этическим комитетом в Стокгольме, DNR 2012/50-31.

1. Подготовка клеток

  1. Используйте стромальные сосудистые фракционные клетки (SVF), выделенные из жировой ткани человека методом переваривания коллагенази.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выход клеток варьируется в зависимости от размера биопсии и состава ткани; однако примерно 1,0 × 106 клеток SVF обычно получается на 10 г жировой ткани.

2. Окрашивание X-gal и подготовка затвора

  1. Фиксировать клетки в 1 мл 2% параформальдегида (PFA) в микроцентрифугной трубке объемом 1,5 мл на 20 минут при комнатной температуре (RT) на коромысле.
  2. Центрифугуйте при 600 × г на 10 минут и удалите супернатант.
  3. Подготовьте раствор для окрашивания X-gal с помощью набора для окрашивания старения β-Galactosidase согласно инструкциям производителя.
  4. Разделите раствор для окрашивания на 3 трубки (по 1 мл каждая) и отрегулируйте pH на 5, 6 и 8 с 1 M HCl и 1 M NaOH. Измеряйте pH с помощью калиброванного pH-метра.
  5. Добавьте раствор X-галона в 0,5 × 106 клеток для поддержания кондиционирования и инкубировать 24 часа при 37 °C безCO2.
  6. Центрифугуйте при 600 × г на 10 минут и удалите супернатант.
  7. Промыйте клетки с помощью PBS (pH 7), центрифугуйте при 600 × г в течение 10 минут и удалите супернатант.
  8. Приготовьте раствор первичного антитела (CD31 [1:200] или контроль IgG [1:333]) в 5% нормальной сыворотке ослина (NDS). Инкубировать клетки ночью при 4 °C.
  9. Промывайте ячейки три раза в PBST (0,1%) по 10 минут на RT на коромысле.
  10. Приготовьте вторичный раствор антител (противомышиный Alexa Fluor 555 [1:500]) и агглютинин зародышей пшеницы (WGA [1:200]) в 5% NDS. Инкубировать 1 час на RT на качалке.
  11. Центрифугуйте при 600 × г в течение 10 минут и удалите вторичный раствор для окрашивания антител.
  12. Промывайте клетки 3 раза в PBST (0,1%) в течение 10 минут на рокере в RT.
  13. Центрифугуйте при 600 × г на 10 минут и удалите супернатант.
  14. Подвесьте клетки в антифейд-маунтанте.
  15. Пипетировать подвеску клетки на микроскопические слайды.
  16. Дайте монтажной среде затвердеть за ночь на RT, чтобы обездвижить клетки.
  17. Добавьте 100 мкл 100% глицерина, нанесите сверху покровитель и запечатайте лаком для ногтей.

3. Микроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения ячеек с помощью конфокального микроскопа, настроенного для обнаружения отраженного света. Отражённый световой сигнал должен собираться на длине волны возбуждения или рядом с ней с помощью производительного делителя или дихроического зеркала. Для всех экспериментов используйте объектив диаметром 30× с силиконовым маслом (числовая апертура 1.05).

  1. Выберите параметр разделителя луча T90/R10 в программном обеспечении микроскопа.
  2. Используйте возбуждение 633 нм и собирайте отражённый свет от 635 до 645 нм.
  3. Получить сигнал Hoechst с помощью возбуждения 405 нм.
  4. Получайте сигнал WGA с помощью возбуждения 488 нм.
  5. Получить сигнал CD31 с помощью возбуждения 555 нм.
  6. Установите размер шага Z на оптимальный для системы (0,74 мкм) и определите стек Z, основанный на мембранном сигнале, чтобы захватить весь объём ячеек.
  7. Получайте изображения с одинаковыми настройками для всех образцов. Сохраняйте файлы в родном формате микроскопа (например, .oir) без сжатия.

4. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализируйте изображения с помощью ImageJ и CellProfiler.

  1. Разделяйте каналы в ImageJ для генерации Z-стеков для каждого канала (405, 488, 555, 633).
  2. Генерируйте суммарные проекции интенсивности с помощью функции Z Project и экспортируйте в 16-битные TIFF-файлы.
  3. Импортировать изображения в CellProfiler (версия 4.2.8) для автоматизированной сегментации ячеек и количественной оценки интенсивности отражённого света на ячейку (Дополнительный рисунок 1 и Дополнительный рисунок 2).
  4. Экспортировать измерения интенсивности в таблицу для дальнейшего анализа.

5. SA-β-галлон набранные очки

  1. Определите порог положительной SA-β-гал как среднюю отражённую интенсивность света при условии pH 8 плюс три стандартных отклонения.
  2. Классифицируйте клетки с условием pH 6 с интенсивностью выше этого порога как положительные по SA-β-гал.

Результаты

Окрашивание человеческих SVF-клеток с помощью отражённого света SA-β-гал дало чёткие и воспроизводимые узоры в трёх условиях с pH-контролем. Окрашивание CD31 было включено для идентификации эндотелиальных клеток внутри SVF, что позволило отличить эти клетки от других популяций. Хотя присутствовало лишь небольшое количество CD31-положительных клеток, маркер подтвердил наличие эндотелиальных клеток и продемонстрировал совместимость метода с гетерогенными первичными образцами.

Состояние pH 5 создавало сильный сигнал в большинстве клеток, что соответствует высокой эндогенной активности бета-галактозидазы при кислотном pH (рисунок 1Aa–Ac). При pH 6 состояние, используемое для оценки активности SA-β-гал, интенсивность окрашивания была снижена по сравнению с pH 5, и только часть клеток показала сигнал выше фона (рисунок 1Ba–Bc). Этот сдвиг как в интенсивности, так и в частоте сигнала соответствует ожидаемой зависимости теста от pH и позволяет идентифицировать клетки с сохраненной активностью SA-β-галактозидазы в субоптимальных условиях. Условие pH 8 создавало минимально отражённый световой сигнал, при этом большинство ячеек находились близко или на фоновых уровнях (рисунок 1Ca–Cc). Это состояние использовалось для определения порога положительного показателя SA-β-гал, указанного красной пунктирной линией на рисунке 1A c,Bc,Cc.

Для количественного анализа порог активности SA-β-гал определялся как средняя отражённая интенсивность света при условии pH 8 плюс три стандартных отклонения. Клетки с состоянием pH 6 и значениями интенсивности, превышающими этот порог, классифицировались как положительные на SA-β-gal. Этот подход обеспечивает объективный, основанный на данных срог, который учитывает фоновый сигнал и минимизирует классификацию ложноположительных результатов.

Для оценки чувствительности к обнаружению и совместимости с иммуноцитохимией было сравнивано изображение отражённого света и яркого поля при всех pH-состояниях. При pH 5 (рисунок 2Aa–Ad) отражённый свет выявил сильные осадки X-гал, тогда как яркое поле — лишь самые заметные отложения. При pH 6 (рисунок 2Ba–Bd) отражённый свет выявил положительные клетки SA-β-gal, которые не были надежно обнаружены ярким полем, где сигнал казался слабым или рассеянным. При pH 8 (рисунок 2Ca–Cd) отражённый свет фиксировал минимальный сигнал, что соответствует низкой ферментативной активности, тогда как яркое поле не выявляло обнаруживаемого осадка. Эти наблюдения показывают, что визуализация отраженного света обеспечивает лучшее обнаружение осадков X-гал, особенно на промежуточных и низких уровнях активности.

Отражённый световой анализ SA-β-галлон также проводился в пластине с 96 лунками (дополнительный рисунок 3). Такая схема приводила к увеличению фонового сигнала за счёт отражения от пластиковой поверхности, что снижало контраст между положительными и отрицательными элементами. Поверхностные несовершенства, такие как царапины, дополнительно увеличивали отражение на фоне (дополнительный рисунок 3, чёрные стрелки). В результате количественный анализ оказался менее надёжным по сравнению с изображением стеклянных покрытий. Если требуется формат пластин, рекомендуется использовать пластины с стеклянным дном для оптимального обнаружения сигнала.

Вместе эти результаты показывают чёткое разделение между сильно положительным условием pH 5, промежуточным сигналом при pH 6 и минимальным фоном при pH 8. Этот паттерн соответствует ожидаемому поведению анализа и поддерживает использование визуализации отражённого света для обнаружения активности SA-β-gal в гетерогенных первичных клеточных популяциях.

figure-results-1
Рисунок 1: обнаружение SA-β-gal, зависящего от pH, в клетках SVF.
WGA (Aa, Ba, Ca) и визуализация отраженного света (Ab, Bb, Cb) фиксируют осадки X-гал при условиях pH 5, 6 и 8. Сигнал самый сильный при pH 5, снижается при pH 6 и минимален при pH 8. Количественная оценка интенсивности отражённого света (Ac, Bc, Cc) показывает распределение активности β-галактозидазы при каждом из этих условий. Каждая точка представляет собой одну ячейку, а красная пунктирная линия указывает порог классификации клеток SA-β-гал-положительных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Сравнение обнаружения отражённого света и яркого поля SA-β-гал в SVF-клетках. Увеличенные изображения клеток SVF, окрашенных X-галом, при pH 5, 6 и 8 показывают окрашивание WGA (Aa, Ba, Ca), окрашивание CD31 (Ab, Bb, Cb) для идентификации эндотелиальных клеток, изображения отраженного света (Ac, Bc, Cc) для обнаружения осадка X-gal и соответствующие яркие изображения (Ad, Bd, Cd). Визуализация отраженного света обнаруживает осадки X-галов в разных условиях, тогда как яркое поле в основном выявляет более интенсивные отложения и обеспечивает ограниченное обнаружение на низких уровнях сигнала. Окрашивание CD31 наблюдается как при pH 5, так и pH 6, что позволяет идентифицировать эндотелиальные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: Обзор конвейера CellProfiler. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Рабочий процесс сегментации ядер и клеток. Репрезентативные изображения (A) ядер, окрашенных по Hoechst, и (B) соответствующих сегментации ядер. (C) Сегментация клетки на основе окрашивания мембраны. (D) Наложение границ ядер и клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Изображение отраженного света SA-β-галлон в пластиковой пластине с 96 лунками. (A) Окрашивание WGA и (B) отражение света SVF-элементов с X-gal окрашиванием в стандартной пластиковой пластине на 96 лунках. Наблюдается повышенный фоновый сигнал по сравнению с изображением на стекле, что соответствует отражению света от пластиковой поверхности, что снижает контраст при обнаружении SA-β-галлон. Поверхностные царапины (чёрные стрелки) дополнительно усиливают фоновый сигнал (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Ассоциированная старением β-галактозидаза — один из самых широко используемых маркеров для идентификации стареющих клеток; однако традиционные методы обнаружения ярких полей ограничены низкой чувствительностью и высокой степенью субъективности. Визуализация отражённого света клеток SVF, окрашенных X-галом, обеспечивает более чувствительный и воспроизводимый подход к измерению активности SA-β-gal на уровне отдельных клеток, при этом оставаясь совместимым с окрашиванием флуоресцентных антител. Оптимизируя этот метод для SVF, активность SA-β-gal может быть обнаружена вместе с клеточно-специфическими маркерами, такими как CD31, что позволяет анализировать гетерогенные первичные популяции клеток без необходимости сортировки клеток.

Для надёжной реализации критически важны несколько технических параметров. Точная калибровка pH раствора для окрашивания X-gal крайне важна, так как небольшие отклонения могут влиять на ферментативную активность и влиять на обнаружение сигнала. pH-метр должен быть откалиброван непосредственно перед использованием стандартных буферов (например, pH 4.0 и pH 7.0), а pH раствора для окрашивания должен быть проверен после подготовки. Кроме того, Z-стек должен захватывать полный объём ячейки, так как неполное покрытие приводит к недооценке интенсивности отражённого света. Параметры визуализации, включая мощность лазера и усиление детектора, должны быть оптимизированы для максимизации сигнала без насыщения и поддерживать их единообразными между образцами.

По сравнению с альтернативными анализами старения, визуализация отражённого света обладает рядом преимуществ. Обнаружение Brightfield SA-β-gal основано на визуальной идентификации осадка, поэтому обладает ограниченной чувствительностью и не совместимо с мультиплексированным анализом. В отличие от этого, визуализация отраженного света обнаруживает оптическую плотность осадка X-гал, сохраняя ферментативное определение SA-β-гал, зависящее от pH. Это позволяет одновременно обнаруживать активность SA-β-гал вместе с флуоресцентными маркерами, что позволяет оценивать старение с помощью множества признаков отдельных клеток.

Несмотря на эти преимущества, метод имеет свои ограничения. Визуализация отражённого света обнаруживает оптическую плотность осадка X-gal, но не может однозначно отличить этот сигнал от других плотных внутриклеточных структур, поэтому условия с pH-контролем необходимы. Условие pH 8 обеспечивает базу для отраженного фонового света и поддерживает различие между конкретными и неспецифическими сигналами. Подход также требует конфокального микроскопа с соответствующими возможностями обнаружения отраженного света, которые могут быть недоступны во всех системах. Кроме того, свойства поверхности изображения могут влиять на качество сигнала: пластины с пластиковым дном увеличивают фон за счёт отражения и снижают контраст, тогда как стеклянные поверхности обеспечивают более надёжное обнаружение.

Этот метод основан на работе Дедика и соавт., которые установили визуализацию отраженного света для обнаружения SA-β-gal у зрелых адипоцитов и расширяют подход на более широкий спектр типовклеток 26. Применение к только что изолированным SVF демонстрирует, что обнаружение отражённого света X-gal преципитата совместимо с различными первичными популяциями человеческих клеток. Возможность комбинировать обнаружение SA-β-gal с маркерами линии, такими как CD31, дополнительно позволяет анализировать определённые субпопуляции внутри гетерогенных тканей.

Хотя вариативность между донорами ожидается в первичных человеческих образцах, цель данного исследования — установить техническую реализацию метода, а не охарактеризовать биологическую вариабельность. Будущие применения на различных биологических образцах или в экспериментальных условиях должны включать соответствующие статистические анализы. Кроме того, валидация в установленных моделях индукции старения и интеграция с ортогональными маркерами старения позволит дополнительно уточнить интерпретацию активности SA-β-gal в сложных популяциях клеток.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Мы благодарим Лив Эйдсмо и Кейру Меликан за предоставление доступа к биопсии человеческих тканей, а также Лену Аппельсвед за помощь в обработке образцов. Это исследование было поддержано грантами KLS от Шведского исследовательского совета (2022-01236), Стратегической исследовательской программы диабета в Каролинском институте (C5471162), Фонда Ново Нордиска (C5475033), стипендии Фонда Валле (C5471234), гранта Aspire Фонда Марка (C5477023), Шведского онкологического общества (22 2420), Стратегической исследовательской программы по стволовым клеткам и регенерации в Каролинском институте (C5472022) и Фонда Кнута и Алисы Валленберг (2020.0118; 2023.0536).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1.5 мл пробиркиBioSphere72.706.200Безопасная пробирка Biosphere 1.5 мл, 250 шт
5 мл пробиркиEppendorf30119401Eppendorf трубки 5,0 мл микротрубки
96-лунковая пластинкаCorning4680Corning 96-лунковая высокосодержательная микропластинка для анализа с плёночным дном
Первичное антитело CD31AbcamAb9498Анти-CD31 антитело клону JC/70A
Конфокальный микроскоп с возможностью отраженного светаEvidentFV-4000
Предметные стеклаEprediaBB02400500A113MNZOПредметные стекла 24 мм х 50 мм, толщина #1.5 (0.13-0.16 мм) 
DPBSGibco14190-136DPBS, без кальция, без магния
Фиксирующий буферSigma Aldrich1.00496.5000Формальдегидный раствор 4%, буферный, pH 6.9 
HClSigma-Aldrich320331-500mLСоляная кислота (37%)
ИнкубаторStuartS130HГибридизационная печь/качалка
Микрологическое стеклоAvantor VWR631-1560Односторонне загартированные слайды, окрашенные концы
Монтажное средствоInvitrogenP36984ProLong glass antifade монтажное средство с максимумом возбуждения/испускания 361/497 нм
Изотипный контроль IgG1 мышиR&D SystemsMAB002
NaOHSigma-AldrichS8045-500GГидроксид натрия ≥ 98%
Нормальная сорная сывороткаJackson ImmunoResearch Labs017-000-121
pH-метрMeterLabR21M002 PHM210 стандартный pH-метр 
Наконечники для пипеток (1000 мкл)Biosphere70.1186.210Фильтрованные наконечники для пипеток 1250мкл
Наконечники для пипеток (200 мкл)Corning4823Фильтрованные наконечники для пипеток 200мкл
Сенильная β-галактозидазный наборCell signaling9860SНабор для окраски сенестической β-галактозидазы
Вторичное антитело, Alexa Fluor 555InvitrogenA31570Донорское антитело к мыши IgG (H+L) с высокой степенью кросс-адсорбции максимум возбуждения/испускания
553/568 нм
Tween-20Fisher Scientific10419000Чистый, Fisher Chemical
Водяная баняRowe ScientificSWB20DСтандартная водяная баня
WGAInvitrogenW11261Аглютинин пшеничных зародышей (WGA) конъюгат Alexa Fluor 488: максимум возбуждения/испускания 495/519 нм

Ссылки

  1. Wang, E. Senescent human fibroblasts resist programmed cell death, and failure to suppress bcl2 is involved. Cancer Res. 55 (10), 2284-2292 (1995).
  2. Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nat Commun. 7 (1), 11190(2016).
  3. Jun, J. -I., Lau, L. F. The matricellular protein CCN1 induces fibroblast senescence and restricts fibrosis in cutaneous wound healing. Nat Cell Biol. 12 (7), 676-685 (2010).
  4. Krizhanovsky, V., et al. Senescence of activated stellate cells limits liver fibrosis. Cell. 134 (4), 657-667 (2008).
  5. Storer, M., et al. Senescence is a developmental mechanism that contributes to embryonic growth and patterning. Cell. 155 (5), 1119-1130 (2013).
  6. Muñoz-Espín, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
  7. Eggert, T., et al. Distinct functions of senescence-associated immune responses in liver tumor surveillance and tumor progression. Cancer Cell. 30 (4), 533-547 (2016).
  8. Feldser, D. M., Greider, C. W. Short telomeres limit tumor progression in vivo by inducing senescence. Cancer Cell. 11 (5), 461-469 (2007).
  9. Xue, W., et al. Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas. Nature. 445 (7128), 656-660 (2007).
  10. Acosta, J. C., et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nat Cell Biol. 15 (8), 978-990 (2013).
  11. Coppé, J. -P., Desprez, P. -Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol Mech Dis. 5 (1), 99-118 (2010).
  12. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. eLife. 4 (1), e12997(2015).
  13. Xu, M., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nat Med. 24 (8), 1246-1256 (2018).
  14. Li, F., et al. FBP1 loss disrupts liver metabolism and promotes tumorigenesis through a hepatic stellate cell senescence secretome. Nat Cell Biol. 22 (6), 728-739 (2020).
  15. Yoshimoto, S., et al. Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome. Nature. 499 (7456), 97-101 (2013).
  16. Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. J Hepatol. 58 (3), 549-556 (2013).
  17. Baboota, R. K., et al. BMP4 and Gremlin 1 regulate hepatic cell senescence during clinical progression of NAFLD/NASH. Nat Metab. 4 (8), 1007-1021 (2022).
  18. Chen, Y. -W., Harris, R. A., Hatahet, Z., Chou, K. Ablation of XP-V gene causes adipose tissue senescence and metabolic abnormalities. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), E4556-E4564 (2015).
  19. Gustafson, B., Nerstedt, A., Spinelli, R., Beguinot, F., Smith, U. Type 2 diabetes, independent of obesity and age, is characterized by senescent and dysfunctional mature human adipose cells. Diabetes. 71 (11), 2372-2383 (2022).
  20. Li, Q., et al. Obesity and hyperinsulinemia drive adipocytes to activate a cell cycle program and senesce. Nat Med. 27 (11), 1941-1953 (2021).
  21. Minamino, T., et al. A crucial role for adipose tissue p53 in the regulation of insulin resistance. Nat Med. 15 (9), 1082-1087 (2009).
  22. Shi, D., et al. Photoactivatable senolysis with single-cell resolution delays aging. Nat Aging. 3 (3), 297-312 (2023).
  23. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  24. Horwitz, J. P., et al. Substrates for cytochemical demonstration of enzyme activity:I. some substituted 3-indolyl-β-D-glycopyranosides1a. J Med Chem. 7 (5), 574-575 (1964).
  25. Lv, X., et al. Molecular engineering development of β-galactosidase-activatable fluorogenic probes for precise senescence tracking in cells, tissues and a mouse model of psoriasis. Sens Actuators B Chem. 444 (1), 138406(2025).
  26. Dedic, B., et al. Senescence detection using reflected light. Aging Cell. 23 (1), e14295(2024).
  27. Alcorta, D. A., et al. Involvement of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16 (INK4a) in replicative senescence of normal human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13742-13747 (1996).
  28. Hara, E., et al. Regulation of p16CDKN2 expression and its implications for cell immortalization and senescence. Mol Cell Biol. 16 (3), 859-867 (1996).
  29. Lin, A. W., et al. Premature senescence involving p53 and p16 is activated in response to constitutive MEK/MAPK mitogenic signaling. Genes Dev. 12 (19), 3008-3019 (1998).
  30. Okamoto, A., et al. Mutations and altered expression of p16INK4 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (23), 11045-11049 (1994).
  31. Serrano, M., Hannon, G. J., Beach, D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature. 366 (6456), 704-707 (1993).
  32. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
  33. Wong, H., Riabowol, K. Differential CDK-inhibitor gene expression in aging human diploid fibroblasts. Exp Gerontol. 31 (3), 311-325 (1996).
  34. Gustafson, B., Nerstedt, A., Smith, U. Reduced subcutaneous adipogenesis in human hypertrophic obesity is linked to senescent precursor cells. Nat Commun. 10 (1), 2757(2019).
  35. Barinda, A. J., et al. Endothelial progeria induces adipose tissue senescence and impairs insulin sensitivity through senescence associated secretory phenotype. Nat Commun. 11 (1), 481(2020).

Перепечатки и разрешения

Теги

Клеточное старениежировая тканьактивность SA-β-galмикроскопия в отраженном светеконфокальная микроскопияанализ единичных клетокиммуноцитохимиямаркеры клеточного происхождения
Обнаружение старения с помощью отражённого света в жировой стромальной сосудистой фракции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.