Методическая статья

Сборка и использование системы гнотобиотического роста растений для исследований взаимодействия растений и микробов в зерновых

54 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70607

⸱

26 июня 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, North Carolina State University, 2Department of Biological and Agricultural Engineering, North Carolina State University, 3Medialab-Matadero, Matadero Madrid

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает сборку и использование новой системы роста гнотобиотических растений растений, разработанной для размещения зерновых и валидированной в пшенице и кукурузе. Эта гнотобиотическая система растений позволяет контролировать эксперименты между растениями и микробами, обеспечивая стерильные условия роста, управление орошением и совместимость с различными почвенными субстратами.

Аннотация

Разработка микробных сельскохозяйственных добавок, которые стабильно работают в поле, требует понимания молекулярных механизмов взаимодействия растений и микробов. Изучение этих основных механизмов взаимодействия требует способности выращивать растения в контролируемых и гнотобиотических условиях (то есть все микроорганизмы, взаимодействующие с растением, известны, будь то без микробов, определённые микробные сообщества или естественные сообщества). Существующие в настоящее время гнотобиотические системы растений не подходят для изучения крупных сельскохозяйственных растений, таких как зерновые. Кроме того, большинство этих систем не способны управлять орошением. Здесь мы представляем GNOVA — новую гнотобиотическую систему, предназначенную для размещения зерновых растений, способных управлять орошением. Эта новая система представляет собой доступную платформу, состоящую из 3D-печатной базы и коммерчески доступных материалов. Этот протокол предоставляет пошаговое руководство по сборке системы и настройке эксперимента. Кроме того, мы предлагаем сравнение производительности GNOVA с системой гнотобиотических мешков. GNOVA продлил рост растений с двух недель в системе мешков до 17 недель для пшеницы и 4 недель для кукурузы. Уровень всходства обеих культур внутри GNOVA также вырос с 66% до 100% для пшеницы и с 75% до 100% для кукурузы. Пшеница, выращиваемая внутри GNOVA, развила культиваторы, которые отсутствовали у растений того же возраста в системе мешков. Свежий вес кукурузы, выращенной в GNOVA, был на 594% выше, чем в системе мешков. Кроме того, высота побегов и длина корней кукурузы были на 89% и 57% выше в системе GNOVA соответственно, чем в мешках. Система GNOVA расширяет набор инструментов, доступных учёным для изучения взаимодействия растений и микробиоты за пределами стадии рассады у зерновых, обеспечивая увеличение пространства для роста и управление орошением.

Введение

Сельскохозяйственные процедуры на основе микробов вызвали значительный интерес за последние десятилетия благодаря своему потенциалу повысить продуктивность сельскохозяйственных культур за счёт роста растений и устойчивости к экологическим стрессам. В то же время молекулярные механизмы действия этих биостимуляторов остаются плохо изученными, что может способствовать их непоследовательным результатам в почвах, местах и условиях окружающейсреды 1,2. Для повышения эффективности существующих методов лечения на основе микроорганизмов и развития новых технологий требуется более глубокое понимание молекулярных механизмов взаимодействия растений имикробов 3,4. Однако разбор этих механизмов остаётся сложным из-за сложности природных микробных сообществ 5,6. Чтобы выявить микробные эффекторы и взаимодействия, обеспечивающие пользу для растений, мы можем снизить сложность природных систем, используя синтетические микробные сообщества (SynCom) в системах роста, позволяющих контролировать условия окружающей среды и микробное сообщество. Гнотобиология, исследование хозяев, связанных с очерченными микробнымисообществами 7, позволяет исследователям сравнивать хозяев, свободных от микробов, с теми, что колонизированы известными микробными сообществами, чтобы связать функцию микробов с фенотипом8 растений.

Ранние гнотобиотические системы строились с использованием стеклянных пробирок9, 10, 11, 12 ибанки 13. С тех пор мы наблюдаем стремительное расширение новых систем для гнотобиотического изучения растений. Наиболее распространённые сегодня системы включают использование чашекПетри 14, пробирок15, 16, стеклянныхбанок 17, пурпурныхкоробок 18, герметичных мешков19, гидропоники20, FlowPot и GnotoPot21, микрофлюидныхсистем 22 и EcoFABs23. Несмотря на этот прогресс, большинство систем либо оптимизированы для съёмки22, либо для сбораэкссудата 17,20, либо предназначены для малых моделейвидов 14,18,21. Многие из них — это закрытые системы, ограничивающие контроль орошения и продолжительность экспериментов. Эти ограничения создают трудности при изучении крупных сельскохозяйственных культур, таких как зерновые, которые требуют дополнительного пространства, воздушного потока и управления водой.

Осознавая необходимость системы, способной поддерживать более крупные растения и более длительные исследования, недавно был разработан EcoFAB 3.0 для расширения гнотобиотического культивирования на более крупныерастения 24. EcoFAB 3.0 обеспечивает больший объём корней и пространственного пространства, что поддерживает рост сорго bicolor до 4 недель, а также позволяет собирать экссудат и визуализироватькорни 24. Несмотря на то, что эта новая система является многообещающим примером расширения гнотобиотических систем на сельскохозяйственные культуры, остаётся необходимость в доступной и универсальной платформе, которая легко внедряется в лабораториях и совместима с широким спектром экспериментальных рабочих процессов. По этой причине мы разработали GNOVA (GNotobiotic system for Versatile Plant Applications) — систему, предназначенную для выращивания зерновых культур в гнотобиотических условиях. Здесь мы предлагаем подробный протокол сборки и эксплуатации GNOVA и демонстрируем его характеристики относительно гнотобиотической системы мешков, которая регулярно используется в нашей лаборатории. С развитием этой новой системы мы улучшили возможности выращивания пшеницы и кукурузы в стерильных условиях, обеспечив большее пространство для роста и встроенное орошение по сравнению с прежними закрытыми системами. Показатели GNOVA сопоставимы с EcoFAB 3.0, что расширяет набор инструментов для вскрытия взаимодействий растений и микробиома в немодельных зерновых культурах. Кроме того, универсальность и адаптивность растительных гнотобиотиков повышаются благодаря простому дизайну GNOVA, использованию коммерчески доступных материалов и доступным 3D-объектным файлам, что позволяет исследователям менять материалы и дизайн для корректировки своих исследовательских и бюджетных потребностей.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы для 3D-печати основания можно найти в дополнительных материалах и открыто доступны в Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc). Для скорости и экономии мы рекомендуем печатать оптом у местных коммерческих поставщиков услуг 3D-печати.

1. Сборка гнотобиотической системы

  1. Инициируйте сборку потенциометра (выполните один раз перед повторным экспериментальным использованием).
    1. Закройте дно горшка, наместив круг из нержавеющей стальной сетки на один конец поликарбонатной трубки и закрепив круг с помощью хомута для шланга (рисунок 1A).
    2. Сверлите отверстия для орошения, создав отверстие для орошения диаметром 1/4 дюйма (6,35 мм) на расстоянии 1,5 см от верхнего края открытого конца поликарбонатной трубки. Просверлите два отверстия длиной 1/8 дюйма (3,18 мм) в 3 см от первого отверстия, при этом один отрез — в 1 см от края, другой — в 2 см от верхнего отверстия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости дополнительные линии трубок можно добавить по верхнему краю горшка, выполняя те же шаги.
    3. Установите ирригационную трубку, вставив короткий участок силиконовой трубки через отверстие 1/4 дюйма.
    4. Закрепите трубку, протянув стяжку через два отверстия диаметром 1/8 дюйма (рисунок 1B). Вставьте мужской люр с установкой 1 в силиконовую трубку, выходящую за пределы потенциометра (рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шип шланга штуцера 1 должен быть открыт.
    5. Подготовьте бочки для шприцев, наполнив пустой ствол стекловатой и закрыв его конец небольшим кусочком алюминиевой фольги (рисунок 1C).
    6. Прикрепите короткий кусок силиконовой трубки к концу люэра на стволе шприца (рисунок 1C).
    7. Подготовьте два одинаковых шприцовых бочек. Прикрепите один из подготовленных стволов шприца к открытому барбу шланга фитинга 1 на трубке, выходящей из потенциометра (рисунок 1D).
    8. Пауза: собранные горшки можно хранить для последующего экспериментального использования.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Сборка потенциометра. A) Дно потенциометра закрыто проволочной сеткой и хомутом для шланга. (B) Орошальный порт на верхнем краю горшка. (C) Ирригационная линия заканчивается открытым шлангом Фитинга 1 с подготовленным стволом для шприца. (D) Собранный горшок с закрытой линейкой орошения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Подготовка кастрюли к эксперименту (проводите перед каждым новым экспериментом)
    1. Выстилайте дно банки двумя заранее вырезанными кругами из стеклопластиковой трубки (рисунок 2A).
    2. Подготовьте почвенный субстрат, смешав две части глины с одной частью песка. Добавьте в горшок 840 мл субстрата.
    3. Закройте посуды пластиковой крышкой и закрепите скотчем (рисунок 2B).
    4. Автоклав наполнял горшки при сухом цикле при 121 °C в течение 30 минут. Дайте остыть на ночь с помощью пластиковых крышек на кастрюлях. Повторное автоклав в сухом цикле при 121 °C в течение 30 минут. Дайте полностью остыть. Держите потенциометры закрытыми пластиковой крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать и другие почвенные субстраты, но необходимое количество на горшок следует оптимизировать заранее. GNOVA также был протестирован с 800 мл 100% глины и 1 л 100% песка. Другие почвенные субстраты могут требовать больше циклов автоклава или других настроек для полной стерилизации.
      ВНИМАНИЕ: При снятии потенциоза из автоклава необходимо быть осторожным, так как материал будет горячим, а хомуты шланга могут ослабнуть. Убедитесь, что хомуты шланга плотно плотно закреплены после охлаждения, прежде чем брать потенциометры.
    5. Вставьте охлаждённые потенциометры в 3D-печатную базу. Поставьте горшок, наполненный почвой, внутрь 3D-печатной основы. Держите горшок за основание, а не за открывающиеся колонны, так как они самые хрупкие.
    6. Пропустите ирригационную трубку через одно из нижних отверстий 3D-печатной базы (рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не наносите автоклав на 3D-печатную опорную основу, так как это может расплавить изделие. Эксперименты с температурой выше 60 °C могут потребовать альтернативного термостойкого филамента (см. Таблицу материалов).
    7. После автоклавирования держите потенциометры при комнатной температуре и не снимайте пластиковую крышку или подготовленный шприц до финальной настройки эксперимента.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Иллюстрация подготовленного горшка. (A) Дно горшка выстлано стеклопластиковой трубкой. (B) Верхняя часть кастрюли закрыта пластиковой крышкой. (C) Пустой горшок, помещённый внутрь финальной 3D-печатной основы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Подготовка стеклянного цилиндра (проводится перед каждым новым экспериментом)
    1. Накройте один конец стеклянного цилиндра заранее вырезанным фильтром DW4 и закрепите его виниловой лентой (рисунок 3A).
    2. Поверните стеклянный цилиндр к другому открытому концу и прикрепите хлопковое кольцо внутри трубки на расстоянии 14 см от края. Закрепите хлопковое кольцо хирургической лентой (рисунок 3B).
    3. Закройте нижнюю часть цилиндра стерилизационной пленкой с помощью двух резинок (рисунок 3B).
    4. Автоклав подготовленных стеклянных цилиндров пропустите в сухом цикле при 121 °C в течение 30 минут перед использованием. После автоклава храните стерильные стеклянные цилиндры при комнатной температуре до необходимости, не снимая обёртку.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Стеклянный цилиндр. (A) Верхняя часть стеклянного цилиндра, закрытая фильтрующей средой DW4 и виниловой лентой. (B) Нижний конец стеклянного цилиндра оснащён хлопковым кольцом и закрыт стерилизационной пленкой и резинками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Подготовка фильтра для орошения (проводится перед каждым поливом, за исключением шагов 1.4.4–1.4.6, которые следует выполнять только один раз)
    1. Собрать держатель фильтра, разместив мембрану фильтра PES (рисунок 4A.4) между держателем фильтра (рисунок 4A.5) и диском фильтра (рисунок 4A.3).
    2. Ориентируйте гладкую сторону мембраны фильтра в направлении выхода, чтобы она обращена к верхней части держателя фильтра (рисунок 4A.1).
    3. Установите уплотнительное кольцо (рисунок 4A.2) в верхнюю часть держателя фильтра (рисунок 4A.1). Прикрепите крышку фильтра к держателю фильтра. Только ручные затяжки.
    4. Подключите разъёмы. Вставьте мужской скольжение фитинга 2 в верхний порт держателя фильтра.
    5. Прикрепите короткий кусок силиконовой трубки к концу шланга на фильтре (рисунок 4B). Вставьте мужской люр фитинга 1 в конец другого подготовленного ствола шприца из шага 1.1.6 (рисунок 4B).
    6. Подключите фильтр к фитингу шланга на подготовленном стволе шприца.
    7. Автоклавировать собранные фильтры в сухом цикле при 121 °C в течение 30 минут. Затягивайте фильтры после охлаждения и перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется подготовить все необходимые фильтры и разместить их в закрытом полипропиленовой коробке. После автоклава орошальные фильтры можно поддерживать стерильными при комнатной температуре до использования, если не извлечь подготовленный шприц.

figure-protocol-4
Рисунок 4: Сборка держателя фильтра. (A) Разобранный деталь держателя фильтра: 1. Верхняя часть держателя фильтра, 2. Уплотнительное кольцо, 3. Диск фильтра, 4. Фильтрующая мембрана и 5. Держатель фильтра. (B) Собранный держатель фильтра с соответствующим подготовленным стволом для шприца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

2. Подготовка эксперимента

  1. Подготовьте и стерилизуйте растворы и материалы как минимум за день до начала эксперимента.
    1. Подготовьте 0,5X растительную среду для растений Murashige и Skoog согласно инструкциям производителя. Автоклав в жидком цикле при 121 °C в течение 30 минут.
    2. Автоклав разобранный дозатор крышки бутылки на сухом цикле при 121 °C в течение 30 минут. Автоклав 1 л деионизированной воды в жидком цикле при 121 °C в течение 30 минут.
    3. Стеклянная чашка Петри Автоклава, стаканы на 500 мл, чайные сита и пинцеты на сухом цикле при 121 °C по 30 минут в день заранее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если не указано иное, следующие шаги следует выполнять в ламинарной вытяжке с использованием асептической техники.
  2. Стерилизуйте семена поверхностно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол стерилизации поверхностных семян будет зависеть от используемого вида растения. Гнотобиотическая система была протестирована как с пшеницей, так и с кукурузой с использованием следующих протоколов стерилизации семян.
    ВНИМАНИЕ: При работе с отбеливателем и гипохлоритом натрия носите лабораторный халат, перчатки и защитные очки, так как эти химикаты могут раздражать или коррозировать кожу и глаза. Этанол горючий; Не используйте открытый огонь.
    1. Стерилизация семянпшеницы 25
      1. Наполните две стаканы 150 мл этанола 95% v/v, одну стакану 150 мл неразбавленного бытового отбеливателя и две стаканы 150 мл воды.
      2. Положите семена пшеницы в чайное сито. Аккуратно перемешайте чайное сито с семенами в одном из стаканов с 95% этанолом v/v в течение одной минуты.
      3. Перенесите семена на новое чайное сито. Аккуратно перемешайте чайные сита с семенами в отбеливателе в течение 10 минут.
      4. Перенесите семена на новое чайное сито. Аккуратно перемешайте чайные ситечки с семенами в другой стакане с 95% этанолом v/v.
      5. Аккуратно перемешайте чайные сита с семенами в стерильной деионизированной воде в течение 30 секунд. Аккуратно перемешайте чайные ситечки с семенами в другой стакан стерильной деионизированной водой в течение 2 минут. Положите стерильные семена в пустую стерильную чашку Петри.
    2. Стерилизация семянкукурузы 26
      1. Положите семена кукурузы в коническую трубку объёмом 50 мл. Заполните коническую трубку 70% этанолом V/V. Аккуратно переверните коническую трубку на 3 минуты.
      2. Декантуйте 70% этанола и заполните коническую трубку семенами 2% натриевым гипохлоритом. Аккуратно переверните коническую трубку на 3 минуты.
      3. Декантировать 2% гипохлорита натрия и промыть семена стерильной деионизированной водой. Поливайте и промывайте семена водой четыре раза. Положите семена кукурузы в стерильную чашку Петри.
  3. При необходимости добавляйте микробный инокулюм в среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При оптимизации и тесте на стерильность гнотобиотической системы микробный инокулюм не применялся.
  4. Соберите дозаторы крышки для бутылок и прикрепите их к бутылкам с носителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку это открытая система, мы рекомендуем иметь контейнер для сбора проточной среды. Мы обнаружили, что использование противня хорошо работает и позволяет легко двигаться, но требует частого опорожнения.
  5. Снимите пластиковую крышку из кастрюли и налейте в неё 378 мл среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это соответствует примерно 70% заполненного водой порового пространства (WFPS), что следует корректировать при использовании других почвенных субстратов. Используйте 360 мл для глины и 358 мл для песка.
    1. Посейте стерилизованное семя на нужную глубину с помощью стерильных пинцетов.
    2. Сейте пшеницу на глубине 1/2 дюйма, а кукурузу — на глубину 1 дюйм. В качестве альтернативы посейте стерильные ранее проросшие саженцы в GNOVA. Используйте предварительно проросшие семена для тестирования роста кукурузы.
    3. Замените пластиковую крышку сверху потенциометра.

3. Окончательная сборка и экспериментальная эксплуатация

  1. Перенесите горшок и стеклянный цилиндр в камеру роста. Держите стеклянный цилиндр так, чтобы дно было обращено вниз, близко к посуде.
  2. Быстро снимите пластиковую крышку из кастрюли и стерилизационную плёнку из стеклянного цилиндра. Опустите стеклянный цилиндр сверху, установив его на выступ 3D-печатной основы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пламя (например, портативная горелка Бунзена) также может быть размещено рядом с горшком во время окончательной сборки системы роста, чтобы дополнительно снизить риск загрязнения.
    ВНИМАНИЕ: При работе с открытым огнём убедитесь, что поблизости нет других горючих материалов. Следите за положением пламени относительно тела, чтобы избежать ожоговой.
  3. Выращивайте растения от 4 до 17 недель, в зависимости от вида, используя специфические условия роста.
  4. Пшеницу выращивайте при дневной и ночной температуре 22 °C/16 °C, а кукурузу — при 27 °C/23 °C. Фотопериод для обоих станций составляет 12 часов только при люминесцентном освещении.

4. Орошение

  1. Прикрепите длинную силиконовую трубку к дозатору крышки бутылки.
  2. Поддерживайте стерильность при поливе с помощью переносного пламени. Если портативное пламя невозможно, проводите орошение с помощью отбеливателя для поддержания стерильности.
  3. Орошение с помощью переносного пламени.
    ВНИМАНИЕ: Осторожно работайте с открытым огнём, чтобы предотвратить телесные повреждения и повреждения объекта.
    1. Поставьте пламя рядом с ирригационной линией. Снимите ствол шприца с линии орошения и держатель фильтра. Держите все концы трубок в зоне пламени.
    2. Подключите держатель фильтра к линии орошения. Соедините два ствола шприца друг с другом. Соедините другую длинную силиконовую трубку на верхнем дозаторе бутылки с нижним портом держателя фильтра.
    3. Раздайте 150 мл 0,5X медиа Murashige и Skoog. Разделите два шприцовых ствола.
    4. Отсоедините силиконовую трубку от держателя фильтра и замените её на один цилиндр для шприца.
  4. Орошение с использованием 10% отбеливателя
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать эту стратегию орошения в крупных экспериментах (n > 50) для увеличения пропускной способности при поливе.
    ВНИМАНИЕ: При работе с отбеливателем надевайте лабораторный халат, перчатки и защитные очки.
    1. Налейте 10% раствора отбеливателя V/V в две маленькие пластиковые стаканы и поставьте их рядом с линейкой орошения. Снимите ствол шприца с линии орошения и держатель фильтра.
    2. Погружайте все концы трубок в 10% раствор отбеливателя до необходимости. Стряхните лишний раствор отбеливателя. Подключите держатель фильтра к линии орошения горшка.
    3. Подключите другую длинную силиконовую трубку дозатора на крыше бутылки к нижнему порту держателя фильтра.
    4. Раздайте 150 мл 0,5X медиа Murashige и Skoog. Отсоедините силиконовую трубку от держателя фильтра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объём орошения составляет 120 мл для песка и 360 мл для глины.
    5. Замените фильтр в ирригационной линии на ствол для шприца после того, как сбросите лишний отбеливатель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если объём орошения изменится, учтите примерно 20 мл среды для подготовки линии орошения.
  5. Поливайте горшки раз в неделю. Корректируйте объём и частоту орошения в зависимости от цели эксперимента и используемого почвенного субстрата. Если используется 100% песок, увеличите частоту орошения до двух раз в неделю.

5. Сбор урожая

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол сбора был выполнен во время тестирования и оптимизации гнотобиотической системы. Протокол сбора должен быть изменён с учётом конкретных целей исследований и объёма обрабатываемых образцов.

  1. Подготовьте и стерилизуйте все растворы и материалы как минимум за день до сбора урожая.
    1. Автоклав 4 л деионизированной воды и 500 мл 0,145 M NaCl в жидком цикле при 121 °C в течение 30 минут в день заранее.
    2. Автоклавные ножницы и пинцеты на сухом цикле при 121 °C в течение 30 минут в день заранее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если не указано иное, следующие шаги следует выполнять в ламинарной вытяжке с использованием асептической техники. Если стерильность не требуется для сбора образцов, все эти этапы можно выполнять вне ламинарного вытяжки.
  2. Перенесите гнотобиотические системы из камеры роста в лабораторию и установите их рядом с ламинарной вытяжкой.
  3. Снимите стеклянный цилиндр из потенциометра и быстро поставьте его в ламинарный капюшон. Достаньте горшок из 3D-напечатанной основы.
  4. Держите растение у основания и высыпляйте почвенный субстрат в контейнер. Аккуратно стряхните крупные комки почвенного субстрата с корней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы почвенного субстрата могут быть собраны и обработаны в соответствии с конкретной целью исследования на этом этапе сбора урожая. Кратко описанный здесь протокол использовался для проверки стерильности почв.
  5. Сбор почвы для подсчёта бактерий впочве 27 с использованием последовательного пятна с одной пластиной28.
    1. Заполните скважины плиты с 96 лунками 270 мкл 0,145 М NaCl. Оставьте первый ряд пустым. Добавьте 1 г почвенного субстрата в коническую трубку объёмом 15 мл с 9 мл 0,145 М NaCl.
    2. Вихрь на максимальной скорости в течение 5 минут. Перенесите 30 мкл образца в пустую скважину пластины с 96 лунками.
    3. Подготовьте семь последовательных разбажений каждого образца, вводя 30 мкл каждого образца в снизу с 270 мкл раствора NaCl.
    4. Хорошо перемешивайте, поднимая и опуская пипеты между каждым переносом.
    5. Подготовьте последовательное разбавление по одной пластине каждого образца, нанеся 10 мкл каждого последовательного разбавления на одну пластину R2A.
    6. Наклоните пластины, чтобы распределить капли. Инкубировать тарелки при комнатной температуре.
    7. Подсчитайте единицы формирования колоний (CFU) и рассчитывайте CFU/g почвы.
  6. Отделяйте побеги от корней стерильными ножницами. Зафиксируйте свежий массовый вес для выстрела.
  7. Очистите корни, аккуратно встряхивая их в стакане с деионизированной водой. Промокните, высушите корни и зафиксируйте свежий вес.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно собрать и обработать надземные и подземные материалы по методологии, наиболее подходящей для следующего анализа.

Результаты

Мы разработали GNOVA — новую гнотобиотическую систему растений, которая обеспечивает стерильную и контролируемую среду, необходимую для изучения взаимодействия растений и микробов. Эта новая система обеспечивает 24,4 дюйма (62 см) вертикального пространства для побегов и горшок объёмом 1,3 л, совместимый с несколькими почвенными подложками. Полностью собранная система имеет высоту около 3 футов (92,4 см) и ширину 4,57 дюйма (11,6 см) (рисунок 5A–C). По сравнению с другими системами, она обладает наибольшей вертикальной пропускной способностью роста побегов и второй по величине корневой камерой (дополнительная таблица 1). GNOVA требует всего 0,0135м ² площади поверхности в камере роста, что делает эту систему компактной и маневренной. Эта система может использоваться в камерах роста с высотой 1,22 м. Все компоненты этой системы, кроме 3D-печатной основы, являются автоклавируемыми и совместимы с автоклавами размерами 24 дюйма × 24 дюйма × 36 дюймов (ширина × длина × высота; 61 см × 61 см × 91 см). Это упрощает экспериментальную установку, избегая ручной стерилизации отдельных деталей. Кроме того, большинство компонентов этой системы многоразовимы, что удерживает стоимость использования за эксперимент примерно на уровне 6 долларов США после первоначальной стоимости установки в 54 доллара за единицу (Дополнительная таблица 2). Экологические условия внутри GNOVA определялись путем отслеживания температуры и относительной влажности системы на недельном кукурузном растении в течение трёх дней. Температура внутри GNOVA в среднем была на +1,3 °C выше, чем в камере роста (дополнительный рисунок 1). Разница температуры внутри системы и камеры была большей в световом цикле (средняя +2,5 °C), чем в тёмном цикле (средняя +0,4 °C). Относительная влажность внутри GNOVA составляла в среднем 63%, по сравнению с 34% в камере роста.

figure-results-1
Рисунок 5: Рендеры системы GNOVA. (A) 3D-модель окончательного проектирования опорного основания (B) Сечение 3D-модели опорной базы (C) Поперечное сечение 3D-модели полностью собранной GNOVA Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Для обеспечения стерильности системы мы провели четырёхнедельный эксперимент с неорошаемыми и орошаемыми системами без растений. Загрязнение стеклянного цилиндра определялось методом отбора проб выше и ниже хлопкового кольца с помощью прямой мазочной пластины. Не было обнаружено обнаруживаемого микробного роста выше трёх колоний (то есть одна колония на треть площади пробы) выше хлопкового кольца как для неорошаемых (n=4), так и для орошаемых образцов (n=6) (дополнительный рисунок 2A). Ниже хлопкового кольца наблюдался рост в одной неорошаемой реплике, тогда как в орошаемых системах рост не был выявлен (дополнительный рисунок 2B). Это указывает на низкий риск загрязнения стеклянного барабана, поскольку микробный рост, наблюдаемый лишь в ограниченных реплицах ниже хлопкового кольца, которое не контактирует с растением. Загрязнение почвы оценивалось путём нанесения последовательных разбавлений на пластины R2A (дополнительный рисунок 2C). Значительного микробного роста не было обнаружено ни в одном из этих случаев, за исключением одного орошаемого репликата с неоценённым количеством единиц формирования колоний при серийных разбавлениях (то есть < 30 колоний). В дополнение к тестам стерильности мы провели сравнение производительности пшеницы и кукурузы, выращенных в рамках GNOVA, с нашим стандартным протоколом гнотобиотиков продолжительностью две недели в системемешков 19. Чтобы понять влияние малого размера и отсутствия орошения на производительность растений, мы расширили периоды роста в мешке, чтобы соответствовать тем, что внутри GNOVA. Хотя первоначальное содержание воды в почве при установке обеих систем было совпадало, GNOVA получала еженедельное удобрение, тогда как мешки — нет. Для всех сравнений мы используем систему мешков в качестве ориентира, так как это была первоначальная гнотобиотическая система нашей лаборатории. Пшеница и кукуруза достигли 100% прорастания внутри GNOVA, тогда как в системе мешков пшеница достигла лишь 67% (n = 3), а кукуруза — 75% (n = 8) (рисунок 6).

figure-results-2
Рисунок 6: Прорастание пшеницы (n = 3) и кукурузы (n = 8) в системе GNOVA (фиолетовая) и мешковая система (зелёная). Результат прорастания каждой реплики представлен точками на оси y либо как «Нет прорастания» или «Прорастает» для каждой гнотобиотической системы. Полоски отражают скорость прорастания (%) каждого вида растений в различных системах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Также был проведён тест роста пшеницы и кукурузы для определения максимального жизнеспособного периода роста и производительности растений внутри GNOVA. Хотя наш стандартный протокол для мешков предусматривает только две недели роста, мы продлили период роста внутри пакетов более двух недель для лучшего сравнения между двумя системами. Через две недели пшеница, выращенная внутри GNOVA (n=3), уже достигла стадии роста Zadock (GS) 13 (рисунок 7A), тогда как в мешке она оставалась на уровне GS11. На пятой неделе установки достигли GS21 в системах GNOVA, что подтверждается появлением культиваторов (рисунок 7B). В отличие от этого, в системах с мешками отсутствовали румпильные механизмы, а установки остались в GS13. Задержка роста и отсутствие фенологических изменений в системе мешков привели к прекращению деятельности растений в этой системе на шестой неделе. Пшеничные растения продолжали расти ещё пять недель внутри GNOVA, где наблюдалось увеличение количества листьев и биомассы (рисунок 7C). Хотя биомасса пшеницы визуально увеличивалась через 12 недель роста внутри GNOVA, растения также начали показывать больше хлоротических листьев, а объем стеклянного цилиндра заполнялся биомасой растений (рисунок 7D). Пшеница выращивалась ещё две недели после этого (рисунок 7E,F). Однако визуального увеличения биомассы не наблюдалось, поэтому тест роста был прекращён на 17-й неделе роста. Рост кукурузы также оценивался внутри GNOVA в течение четырёх недель и сравнивался с кукурузой, выращенной в мешках (рисунок 8A,B). В этом эксперименте семена кукурузы были стерилизованы и предварительно проращены перед посевом внутри GNOVA или в системе мешков. Вес свежих побегов и корней кукурузы значительно различался между двумя системами (двухобразный t-тест, p-значение < 0,05, дополнительная таблица 3). Кукуруза, выращенная в GNOVA, имела свежие побеги и корни в среднем весом 11,2 г и 5,7 г соответственно (рисунок 8C,D). В отличие от этого, побеги и корни кукурузы, выращенные в мешке, имели свежий вес 1,29 г и 1,15 г соответственно. В целом, свежая биомасса кукурузы, выращенной в GNOVA, увеличилась на 593% по сравнению с кукурузой, выращенной в системе мешков. Кроме того, длина побегов и корней внутри GNOVA была значительно больше, чем в мешках, на 89% и 57% соответственно (рисунок 8E,F).

figure-results-3
Рисунок 7: Рост пшеницы в прототипе GNOVA. (A) Пшеница через две недели на стадии роста Zadock (GS) 13. (B) Сравнение пшеницы после пяти недель роста в мешке и GNOVA. Тиллеры присутствуют внутри GNOVA (GS21) и отсутствуют в мешке (GS13). (C) Увеличение биомассы пшеницы через 10 недель роста. (D) Увеличение биомассы пшеницы через 13 недель роста с появлением хлоротических листьев. (E) Дальнейшее увеличение биомассы пшеницы на 15 недель роста. F) Биомасса пшеницы занимает большую часть доступного объёма роста в течение 17 недель роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 8: Рост кукурузы внутри прототипа GNOVA (фиолетовый) по сравнению с системой мешков (зелёный). Слитки показывают средние значения ± стандартной ошибке (n=4) (A) кукурузы, выращенной в течение четырёх недель в системе GNOVA и пакетов. (B) Сравнение размеров собранных растений, выращиваемых в GNOVA и системе мешков. (C) Свежий вес для выстрела (Mean±SE). (D) Свежий вес корня (Mean±SE). (E) Длина стрельбы (Средняя±SE). F) Длина корня (Mean±SE). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: Временная динамика относительной влажности и температуры, измеряемая внутри GNOVA (фиолетовый) и камеры роста (оранжевый). Данные записывались с интервалом в пять минут в течение трёх дней. Данные внутри GNOVA были собраны на семинедельном растении кукурузы. Участки, оттенённые светло-голубым цветом, соответствуют ночным периодам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Микробный рост в результате теста на стерильность GNOVA без орошения растений (контроль) и орошения (орошение ). (A) Образцы стеклянного цилиндра над хлопковым кольцом. (B) Образцы стеклянного цилиндра под хлопковым кольцом. (C) Серийное разбавление образцов почвы с одной пластиной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 1: Сравнение характеристик GNOVA с другими существующими растительными гнотобиотиками (EcoFAB, пурпурные коробки, пакеты, FlowPot и GnotoPot, а также EcoFAB 3.0). Системы сравниваются по ключевым параметрам, важным для экспериментального проектирования, таким как высота растений, объем корней и управление орошением. Информация была собрана из опубликованной литературы и доступных описаний систем; Если данные явно не были представлены, указываются оценки. † Лучшее приближение, если оно не указано в литературе; ‡ Систему не нужно разбирать или перемещать в ламинарную вытяжку для выполнения задачи; * Возможно с модификациями системы; Категории стоимости определяются так: низкая (< 30 долларов США за единицу), средняя (30-100 долларов США за единицу), высокая (> 100 долларов США за единицу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 2: Список материалов (BOM) и ориентировочные затраты на сборку и эксплуатацию одного агрегата GNOVA. Материалы классифицируются как многоразовые или одноразовые компоненты, с соответствующими единичными затратами, необходимым количеством на систему и общей стоимостью на систему. Многоразовые компоненты вносят вклад в первоначальную стоимость установки, а одноразовые материалы представляют собой расходную стоимость на эксперимент. * рассчитывается на основе согласованных оптовых цен для экономичных тарифов; ** необходимое количество зависит от продолжительности эксперимента, используемого почвенного субстрата и цели исследования. Ценность четырёхнедельного эксперимента с еженедельным графиком орошения с использованием глино-песчаной смеси; † Приблизительная стоимость необходимого количества материала на одну систему; ‡ Цена на питательный раствор и почвенный субстрат не учитывается, так как это зависит от цели эксперимента.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 3: Полученные p-значения двухобразного t-теста для роста кукурузы измеряли переменные, выращенные внутри GNOVA и системы мешков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Представленная здесь гнотобиотическая система растений, GNOVA, предоставляет доступный и универсальный инструмент для изучения взаимодействия растений и микробов в зерновых культурах. Ключевые характеристики включают повышенную способность роста и встроенное орошение, что позволяет вырастить зерновые за пределы стадии рассады в стерильных условиях. Производительность этой системы сопоставима с EcoFAB 3.0 и обеспечивает доступную альтернативную гнотобиотическую систему растений. Система состоит из коммерчески доступных компонентов, отобранных по стоимости, простоте и совместимости с автоклавами среднего размера, что облегчает внедрение в лабораториях. Сборка и эксплуатация просты и не требуют специализированного оборудования, что снижает барьеры для реализации. GNOVA может быть адаптирован для выполнения различных исследовательских целей благодаря своей совместимости с широким спектром почвенных субстратов, протоколами стерилизации семян, микробными инокулянтами (без микробов, SynCom или естественным сообществами) и разнообразным анализами на последующих этапах.

Минимальное загрязнение крайне важно в экспериментах с гнотобиотическими растениями, чтобы убедиться, что наблюдаемые эффекты можно было бы объяснить интересующими микроорганизмами, а не загрязнителями. Простая работа GNOVA снижает риск загрязнения. Строгое соблюдение асептической техники и следующие ключевые рекомендации обеспечат сохранение стерильности. Во время подготовки эксперимента мы рекомендуем дезинфекцировать ламинарную вытяжку между микробными инокулянтами, чтобы минимизировать перекрёстное загрязнение обработок. Порядок проведения обработок также может снизить перекрёстное загрязнение. Применение средств без микробов перед любыми живыми микробными процедурами — идеально. Чужеродные микробы также могут проникать через семена. Поэтому протоколы стерилизации поверхностных семян следует оптимизировать для каждого вида растения или источника семян с целью баланса стерильности ипрорастания 26. Протоколы стерилизации для немодельных зерновых, таких каксорго 24,ячмень 29, свитчграсс и овёс23 , могут быть легко внедрены в GNOVA. Если стерилизация негативно влияет на прорастание, вместо этого можно использовать заранее проросшие семена. Орошение является основным источником загрязнения в гнотобиотических системах. Самым важным моментом в этом процессе является крепление фильтров к линий орошения. Концы трубок ирригационных линий и фильтров должны оставаться стерильными в этом процессе. Пламенная стерилизация требует ловкости и может быть трудоёмкой, особенно в крупных экспериментах (n >50). Поэтому альтернативный метод на основе отбеливателя рекомендуется для крупных экспериментов или когда стерилизация пламенем непрактична. Также рекомендуется поддерживать дополнительные стерильные фильтры и иметь отбеливатель или этанол во время полива на случай загрязнения при обработке материалов системы. Кроме того, для контроля стерильности и выявления загрязнителей настоятельно рекомендуется включение установок контроля загрязнений (то есть отсутствие завода, отсутствие обработки микроорганизмов и ирригация).

Чтобы преодолеть риск загрязнения орошения, самые ранние гнотобиотические системы растений были полностью закрыты и не имели возможности орошения, что ограничивало продолжительность экспериментов. Кукурузу выращивали гнотобиотическим методом в мешках19,30, стеклянных трубках и чашкахПетри 15 — в течение двух–четырёх недель. Для пополнения воды и питательных веществ во время роста растений альтернативные системы, такие как EcoFAB23, FlowPot и GnotoPot21, позволили орошение путём частичного разборки внутри ламинарных вытяжек. Это ограничивало их размер и совместимость с более крупными растениями. Поскольку линии орошения легко доступны вне GNOVA, разборка не требуется, и система не ограничена размерами ламинарных вытяжк. Это не только обеспечивает непрерывное поступление питательных веществ и воды, но и увеличивает доступное пространство для роста. Уменьшенное пространство побегов может уменьшить фотосинтетическую способность и способствовать задержке24, а ограничение объёма корней может привести к связыванию корней и снижению поглощения воды и питательныхвеществ 31. Сочетание небольшого пространства для роста и отсутствия орошения в системе мешков может объяснить снижение биомассы и отсутствие фенологического прогрессирования кукурузы и пшеницы по сравнению с системой GNOVA. Эта новая система позволила гнотобиотический рост кукурузы на длительность, сопоставимую с сорго в EcoFAB 3.024. Кроме того, он превышает гнотобиотический рост пшеницы в течение четырёх недель в гидропонной системе (20) в более репрезентативной почвенной системе. Помимо физических ограничений, гнотобиотические системы часто зависят от ограниченного потока воздуха для поддержания стерильности. Ограниченный поток воздуха может привести к повышению температуры и влажности, а также к снижению скорости газообмена, что может повлиять на физиологиюрастений 32. Улучшенный рост был отмечен в системах с улучшенным воздушным потоком, таких как пурпурные коробки с фильтрамиHEPA 33, которые работают аналогично фильтру DW4, используемому в GNOVA. Аналогично, EcoFAB 3.0 демонстрировал повышенную температуру и относительную влажность, но всё ещё считался надёжной платформой для гнотобиотического ростасорго 24. Это свидетельствует о том, что, несмотря на физические и экологические ограничения в гнотобиотических системах сохраняются, достижения в проектировании систем, представленные здесь, всё же обеспечивают лучшие условия для более эффективной поддержки гнотобиотического роста зерновых.

Простота модификации — ещё одна ключевая особенность GNOVA. Модульность дизайна позволяет пользователям вносить изменения в отдельные детали, чтобы лучше соответствовать их исследовательским потребностям и бюджету. Эта система совместима с любым почвенным субстратом, включая природные. Изменения объёма установки, концентрации питательного раствора, а также объёма и частоты орошения должны основываться на физико-химических свойствах почвы, поскольку они напрямую влияют на доступность и распределение питательных веществи воды 34. Засуху можно вызвать, отслеживая вес всей системы GNOVA и определяя содержание воды в почвегравиметрически. 35. Корневые эксудаты можно собирать разрушительно, инкубируя собранные растения в сверхчистой воде36 или промывая систему для получения нестерильных выщелачивателей37. Если требуются стерильные эксудаты, потенциометр GNOVA и 3D-печатная опорная база могут быть модифицированы с добавлением встроенной функции сбора экссудата, аналогичной той, что была в дизайне EcoFAB 3.024. Учёные, заинтересованные в изучении приоритетныхэффектов 38 на сборку микробных сообществ, могут установить дополнительные линии орошения вокруг горшка. Это позволяет последующее применение микробных инокулянтов, сохраняя стерильность основной ирригационной линии. Условия окружающей среды можно контролировать, устанавливая в GNOVA дезинфицированные беспроводные датчики температуры и относительной влажности. Альтернативно, замена стеклянного цилиндра на поликарбонатную камеру и сверление отбора проб24 позволит измерять окружающую среду и отбор проб газов. Это может позволить количественно оценивать газы и летучие соединения, такие какCO2,O2 и этилен, с потенциалом влиять на производительностьзавода 33. Поток воздуха в систему также можно увеличить, убрав хлопковое кольцо из стеклянного цилиндра. Однако любая из этих модификаций может увеличить риск загрязнения и пока не подтверждена или оптимизирована в GNOVA.

Несмотря на преимущества и универсальность GNOVA, следует учитывать некоторые ограничения. Следует отметить, что эта система лучше всего подходит для использования в контролируемых камерах роста, так как неконтролируемые условия в теплице или поле могут повлиять на её эффективность. Хотя пшеница могла расти в системе в течение 17 недель, признаки стресса наблюдались примерно через 12 недель роста. Поэтому пшеницу не следует выращивать дольше 12 недель. Кроме того, поддержание стерильности подтверждалось только четырьмя еженедельными орошениями в течение четырёхнедельного периода роста; Более длительные эксперименты несут повышенный риск заражения. Хотя у GNOVA увеличена ёмкость корня, рестрикция корней всё ещё возможна, и временная оценка морфологии корней может помочь определить оптимальные сроки роста, минимизирующие связывание корней. Кроме того, некоторые модификации системы, такие как замена стеклянного цилиндра на поликарбонатный, могут увеличить стоимость установки до более чем 100 долларов США за единицу. В настоящее время GNOVA допускает только деструктивное отбор проб в конечной точке, что увеличивает требования к трудозатратам и репликации для временных исследований микробной динамики, паттернов эксудации или мониторинга стерильности. Наконец, поддержание стерильности во время установки, орошения и сбора урожая требует много времени, и даже упрощённые системы, такие как GNOVA, требуют целенаправленных усилий, что увеличивает общие эксплуатационные расходы. В совокупности эти ограничения следует учитывать при внедрении этой системы. Кроме того, при планировании экспериментов и интерпретации результатов необходимо учитывать экологические ограничения, вызванные ростом гнотобиотических организмов, поскольку они могут влиять на физиологию растений и, в свою очередь, на связанный с ним микробиом.

GNOVA предоставляет универсальную гнотобиотическую платформу, совместимую с зерновыми культурами. Система позволяет восстанавливать почти целые корневые системы, подходящие для инструментов анализа корневой архитектуры, таких как RhizoVision explorer39 и ARIA40, что позволяет характеризуть морфологию корней в ответ на различные микробные инокулянты и условия окружающей среды. В сочетании с SynCom и мультиомическими анализами GNOVA облегчает выявление механистических связей между микробными эффекторами и реакцией растений. Более крупные синкомы (>100 членов) в сочетании с метагеномныманализом 41,42,43 могут использоваться для изучения закономерностей совместного появления и выявления микробов, имеющих экологическое значение при различных условиях 5,44. В отличие от этого, меньшие SynCom (<50 штаммов) в сочетании с метатранскриптомическими45,46, метапротеомными 19,47,48 иметаболомикой 49,50,51 позволяют детально охарактеризовать функциональный ответ как у растений, так и умикроорганизмов 44. Вместе эти возможности позиционируют GNOVA как ценный инструмент для выявления ключевых микробных признаков, способных ускорить разработку новых биоинокулянтов, повышающих устойчивость сельскохозяйственных систем.

Раскрытие информации

Все авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Это исследование было профинансировано Фондом Novo Nordisk (INTERACT, номер гранта: NNF19SA0059360) и Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США под номером 2022-67013-36672.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Powerconnect cordless drill & 100-Piece KitBlack+DeckerBDC120VA1001/4" and 1/8" drill bits needed. 
Vinyl tape, yellow, 1" wide x 36 yards 3M471Consumable material
Sterling Rubber bands size #32  (2 rubber bands per system)AmazonB001I1QO00Consumable material. 
Wheat seedCultivar used in this experiment: Catawba
Fiberglass pipe wrap insulation, 3 " widex 1/2 " thick  (2 pre-cut circles per system)Lowe's28930Cut into 2 7/8 " (7.3 cm) diam circles. Consumable material. For high throughput production of circles roll out the wrap insulation and use the open edge of the pot to cut the circle by placing the pot on top of the insulation wrap and applying pressure and twisting. 
DW4 Filter media, Pre-cut to 15" x 75 yards  (1 cut circle per system)Class Biological Clean, LtdNACut into 6.3 " (16.02 cm) diam circles. CBC has other pre-cut or standard roll sizes that can be purchased instead if desired.  Consumable material. cut a template of the circle in cardboard and use it to draw circles throughout the area of the DW4 media and cut with scissors.
Silicon tubing, Versilon SPX-50 High-strength, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" wall thicknessSaint-GobainABX00007Cut into two long pieces ( 16" // 40.64 cm) and three short pieces (2.5" // 6.35 cm) 
Sodium hypoclorite 5% available chlorine in aqueous solutionVWRJT9416-1Dilute to 2% v/v and use for maize sterilization protocol
Murashige & Skoog medium, micro and macro elements. 25 LResearch Products InternationalM10200-25.0Diluted to 0.5x strength
Ethanol, 100%, Deacon LabsFisher scientific04-355-451Diluted to 95% v/v
Syringe 3 mL, luer lock unsterile  (2 per system)Fisher scientific14-817-117Discard plunger and only keep the barrel, fill with glass wool and cap with foil.
Glass beakers, 250 mL VWR470191-150Five are needed for wheat seed sterilization
Maize seedGenotype used in this experiment: Mexico 21–22 B73XMo17
Aluminum baking tray 18" x 26" AmazonB01FIK54LQMake sure it fits the dimensions of your flow hood
Sodium ChlorideFisher scientificBP358-1Prepare 0.145 M solution.
3D printed base, polylactic acid (PLA) filament used (1 per system)ProtolabsNAPrinting and editable files can be found in supplemental materials. Files available at Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc. DO NOT AUTOCLAVE if PLA was used as filament to produce the base. PLA will melt above 150 °C and can get deformed above 60 °C. It is recommended that the integrity of the PLA 3D printed base is tested if it is to be used at temperatures above 40 °C. For higher heat resistance materials such as PETG (Polyethylene Terephthalate Glycol) or PC (polycarbonate) can be used instead; this will increase the cost of the part and might still not be autoclaveable. 3D printing of the base prototypes were accomplished in a personal printer with build volumes of of 256 × 256 × 256 mm (length × width × height). For speed and cost efficiency we recommend printing in bulk at local commercial 3D-printing service providers. 
Male luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polypropelene  (2 per system)Cole-ParmerEW-50114-69Refered as fitting 1 in the protocol
Male slip luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polyproylene  (1 per system)Cole-ParmerEW-50114-63Refered as fitting 2 in the protocol
201 Stainless steel worm gear hose clamps, 1 1/2" -3 1/2" clamping diameter (1 per system)Grainger5CZF2Refered as hose clamps in protocol
Airstream Gen 3 Laminar flow cabinet with simple switch, dimensions 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 " ESCO Lifesciences2120707Refered as laminar flow hood in protocol. Any laminar flow hood with similar dimensions works. Modifications might be needed in smaller flow hoods. 
Play sand, Quikrete Premium. 50 lbThe Home Depot1001709466Refered as sand in protocol
304 Stainless steel woven wire, 120 mesh (1 per system)AmazonB09KRS5F7TRefered as stainless steel wire mesh in article. Cut into 4.7" (11.9 cm) diameter circles. For high troughput or circle production, cut a template of the circle in cardboard and use it to draw circles throughout the area woven mesh of the woven mesh and cut with scissors. 
Clay (Montmorillonite), OIL-DRI Loose Sorbent, 50 lb Wt, not scentedGrainger44Z111Refered in protocol as clay. Consumable material.
Clear hurricane candle shade chimney tube without a bottom 4" OD x 30" length (1 per system)WCG InternationalHST0430Refered in protocol as glass cylinder
Clear plastic cap, 3" (7.6 cm) diam  (1 per system)ClearTec PackagingPCC3.000Refered in protocol as plastic cap
Clear Polycarbonate tubing, 3" OD x 2 7/8" ID x 1/16' wall thickness x 12" length  (1 per system)ePlasticsPCTUB3.000X2.875Refered in protocol as pot. Can request company to cut to other desired lengths.
Cleanroom sterlization wrap, 6" x 6" (1 per system)Fisher scientific17-101-102Refered in protocol as sterilization wrap. Consumable material.
Dissecting forceps, Medium serrated tip 4 1/2" lengthVWR82027-398Refered in protocol as tweezers.
Tea strainersAmazonB0FRMRZWZYThree are needed for wheat seed sterilization
Clorox bleach with 5.7% available chlorineThe Home Depot

Ссылки

  1. Batista, B. D., Singh, B. K. Realities and hopes in the application of microbial tools in agriculture. Microbial Biotechnology. , (2021).
  2. Parnell, J. J., et al. From the Lab to the Farm: An Industrial Perspective of Plant Beneficial Microorganisms. Frontiers in Plant Science. , (2016).
  3. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLOS Biology. , (2017).
  4. Compant, S., et al. Harnessing the plant microbiome for sustainable crop production. Nature Reviews Microbiology. , (2025).
  5. Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing Causality: Opportunities of Synthetic Communities for Plant Microbiome Research. Cell Host and Microbe. , (2017).
  6. Liu, Y. X., Qin, Y., Bai, Y. Reductionist synthetic community approaches in root microbiome research. Current Opinion in Microbiology. , (2019).
  7. Basic, M., Bleich, A. Gnotobiotics: Past, present and future. Laboratory Animals. , (2019).
  8. Williams, S. C. P. Gnotobiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2014).
  9. Bennett, R. A., Lynch, J. M. Bacterial Growth and Development in the Rhizosphere of Gnotobiotic Cereal Plants. Microbiology. , (1981).
  10. Lindberg, T., Granhall, U. Acetylene reduction in gnotobiotic cultures with rhizosphere bacteria and wheat. Plant and Soil. , (1986).
  11. Maplestone, P. A., Campbell, R. Colonization of roots of wheat seedlings by bacilli proposed as biocontrol agents against take-all. Soil Biology and Biochemistry. , (1989).
  12. Simons, M. Gnotobiotic System for Studying Rhizosphere Colonization by Plant Growth-Promoting Pseudomonas Bacteria. MPMI. , (1996).
  13. Walley, F. L., Germida, J. J. Response of spring wheat to interactions between Pseudomonas species and Glomus clarum NT4. Biology and Fertility of Soils. , (1997).
  14. Ma, K. W., Ordon, J., Schulze-Lefert, P. Gnotobiotic Plant Systems for Reconstitution and Functional Studies of the Root Microbiota. Current Protocols. , (2022).
  15. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2017).
  16. Hsu, P. C. L., O’Callaghan, M., Condron, L., Hurst, M. R. H. Use of a gnotobiotic plant assay for assessing root colonization and mineral phosphate solubilization. Plant and Soil. , (2018).
  17. McLaughlin, S., et al. A Versatile Glass Jar System for Semihydroponic Root Exudate Profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
  18. Miebach, M., et al. Litterbox—A gnotobiotic Zeolite-Clay System to Investigate Arabidopsis–Microbe Interactions. Microorganisms. , (2020).
  19. Salvato, F., et al. Evaluation of Protein Extraction Methods for Metaproteomic Analyses of Root-Associated Microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. , (2022).
  20. Kawasaki, A., et al. A sterile hydroponic system for characterising root exudates. Plant Methods. , (2018).
  21. Kremer, J. M., et al. Peat-based gnotobiotic plant growth systems for Arabidopsis microbiome research. Nature Protocols. , (2021).
  22. Nezhad, A. S. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a Chip. , (2014).
  23. Gao, J., et al. Ecosystem Fabrication protocols for plant-microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  24. Gupta, K., et al. EcoFAB 3.0: a sterile system for studying sorghum. Frontiers in Plant Science. , (2024).
  25. Verma, S. K., et al. Exploring Endophytic Communities of Plants. Seed Endophytes: Biology and Biotechnology. , Springer. Cham. (2019).
  26. Parnell, J. J., et al. Effective Seed Sterilization Methods Require Optimization Across Maize Genotypes. Phytobiomes Journal. , (2024).
  27. Lee, J., Kim, H. S., Jo, H. Y., Kwon, M. J. Revisiting soil bacterial counting methods. PLOS One. , (2021).
  28. Thomas, P., et al. Optimization of single plate-serial dilution spotting method. Biotechnology Reports. , (2015).
  29. Munkager, V., et al. AgNO3 Sterilizes Grains of Barley without Inhibiting Germination. Plants. , (2020).
  30. Wagner, M. R., et al. Microbe-dependent heterosis in maize. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2021).
  31. Poorter, H., et al. Pot size matters: effects of rooting volume on plant growth. Functional Plant Biology. , (2012).
  32. Ferrante, A., Mariani, L. Agronomic management for enhancing plant tolerance to abiotic stresses. Horticulturae. , (2018).
  33. Vollmer, R., et al. Effect of Gas Exchange Rate and Vessel Type on plant growth. Plants. , (2024).
  34. Cardoso, E. J. B. N., et al. Soil health: suitable indicators for assessment. Scientia Agricola. , (2013).
  35. Sinclair, T. R., Ludlow, M. M. Influence of soil water supply on plant water balance. Australian Journal of Plant Physiology. , (1986).
  36. Döll, S., Koller, H., van Dam, N. M. Protocol for collecting root exudates from soil grown plants. Rhizosphere. , (2024).
  37. Williams, A., et al. Comparing root exudate collection techniques. Soil Biology and Biochemistry. , (2021).
  38. Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains. Nature Ecology and Evolution. , (2019).
  39. Seethepalli, A., et al. RhizoVision Explorer: software for root image analysis. AoB Plants. , (2021).
  40. Pace, J., et al. Analysis of maize seedling roots using ARIA. PLOS One. , (2014).
  41. Jensen, T. B. N., et al. High-throughput DNA extraction and metagenome preparation. PLOS One. , (2024).
  42. Romero-Salas, E. A., Ibarra-Sánchez, C. L. Isolation of Metagenomic DNA from Plant Roots. Plant Microbiome Engineering. , Springer. New York. (2025).
  43. Su, P., et al. Recovery of metagenome-assembled genomes from rice phyllosphere. Scientific Data. , (2022).
  44. Northen, T. R., et al. Community standards for synthetic communities in plant–microbiota research. Nature Microbiology. , (2024).
  45. Poursalavati, A., Javaran, V. J., Laforest-Lapointe, I., Fall, M. L. Soil Metatranscriptomics: improved RNA extraction method. Phytobiomes Journal. , (2023).
  46. Vannier, N., et al. Genome-resolved metatranscriptomics reveals conserved root colonization determinants. Nature Communications. , (2023).
  47. Zheng, L., et al. Extraction of Proteins from Soil. Metaproteomics: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2024).
  48. Zheng, L., et al. Comparative physiological and proteomic response to phosphate deficiency. Journal of Proteomics. , (2023).
  49. Rieusset, L., et al. Cross-metabolomic approach in wheat–Pseudomonas interaction. Metabolites. , (2021).
  50. Zhang, Y., et al. Metabolite-mediated responses of phyllosphere microbiota. Microbiology Spectrum. , (2023).
  51. Swenson, T. L., Northen, T. R. Untargeted Soil Metabolomics. Microbial Metabolomics: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

232232SynComs
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи