Методическая статья

Анализ изоляции отдельных волокон для оценки поведения окислительного миофибра

534 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70637

⸱

31 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Health Promotion Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Juntendo University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает выделение целых отдельных мышечных волокон из окислительного мышечного слоя и установление высокоочищенных миобластных культур, полученных из этих волокон. Оптимизированная процедура надёжно даёт примерно 300–500 целых миоволокон на мышь, что позволяет проводить молекулярные и клеточные анализы на последующих этапах.

Аннотация

Скелетная мышца состоит из многоядерных миоволокна, целостность и функция которых жизненно важны для движения и общего здоровья. При нервно-мышечных заболеваниях мышечные группы могут по-разному поражаться на разных типах и стадиях заболевания, поэтому важно выделить жизнеспособные одиночные волокна от представительных мышц для механистических исследований. Цель этого протокола — обеспечить надёжный метод изоляции высокого количества целых одиночных миоволокон из мышиной мышцы (SOL), которую сложно диссоциировать из-за длины и хрупкости волокна. Оптимизируя концентрацию коллагеназы и время переваривания, протокол минимизирует потерю клетчатки и сохраняет жизнеспособность во время диссоциации. Оптимизированный рабочий процесс значительно снижает остаточное прикрепление тканей к изолированным волокнам, тем самым ограничивая перенос неволокнистых клеток и минимизируя межклеточные загрязнения. Этот метод подходит для анализов с одним волокном, а также для выделения сателлитных клеток и последующего расширения в условиях минимального загрязнения. Используя этот оптимизированный рабочий процесс, мы регулярно получаем ~300–500 целых одиночных миоволокна, полученных из SOL, которые могут быть иммуномаркированы с высокой эффективностью, а также обеспечивают высококачественную популяцию сателлитных клеток с минимальным загрязнением фибробластами. Используя сравнительный анализ с мышцами Extensor Digitorum Longus (EDL), мы подчеркиваем ценность индивидуального, специфического для мышц подхода к оценке терапий в исследованиях нейромышечных заболеваний, позволяющего тестировать кандидаты на фармацевтические вмешательства в небольших, регулируемых экспериментальных окнах.

Введение

Скелетная мышца — самая многочисленная ткань в человеческом организме, составляющая примерно 40–50% от общей массытела 1. Скелетная мышца служит резервуаром энергии в виде гликогена. Во время холодного воздействия он обеспечивает тепло за счёт термогенеза и, что важно, обеспечивает передвижение. Скелетная мышца состоит из многоядерных, постмитотических миофибр. Для поддержания созревания и восстановления мышц новые мионуклеуи генерируются местной стволовой клеткой нашей скелетной мышцы — сателлитной клетой (SC). СК расположены на периферии постнатальных скелетных мышечныхволокон 2,3,4. SC идентифицируются транскрипционным фактором Pax7, который экспрессируется как в спокойном, так и в активированномсостоянии 3,5. При травме или гипертрофической стимуляции СК активируют и повышают регуляцию MyoD, входят в миогенную программу, размножаются и в конечном итоге сливаются с существующими или недавно формирующимися миофибрами для восстановлениямышечной функции 6,7,8. СК разнородны по способности к стволу, эмбриологическому происхождению (сомитические против несомитических), стадии послеродового роста (молодые и старые) и составе мышц (быстрые или медленные)9,10,11.

В зависимости от области тела, скелетная мышца адаптирована под энергетические и функциональные потребности этой области. Эта гетерогенность мышечных волокон возможна благодаря их сократимости и окислительности. Действительно, мышечные волокна состоят из медленно дергающихся окислительных волокон (называемых типами I и IIa) и быстро сжимающихся гликолитических волокон (у грызунов IIb называются IIx)12,13. Эта красивая, функциональная мозаика типов волокон позволяет нам свободно двигаться в повседневной жизни. Например, осанические мышцы, такие как состевая мышца (SOL) и позвоночник-выпрямитель, находятся в состоянии хронической низкоуровневой активации и, следовательно, содержат большое количество медленноокисляющих мышечных волокон типа I и типа IIa. В отличие от этого, короткие, но быстродействующие мышцы, такие как длинный разгибатель пальцев (EDL), в основном состоят из гликолитических волокон типа IIx и типа IIb. Однако состав волокон не является фиксированным; Мышечные волокна — это динамические структуры, способные переключаться с быстрого на медленное и наоборот в зависимости от предъявляемых на них функциональных требований. Различие в сократимости типа клетчатки возможно благодаря содержанию белка миозина. Это основной белок в скелетной мышце, состоящий из изоформ лёгких и тяжёлых цепеймиозина 12,14.

Внутри саркомера (самой маленькой функциональной единицы мышцы, генерирующей силу) головки миозина и актин взаимодействуют, образуя структуру, известную как кроссбридж. Через гидролиз АТФ энергия высвобождается в результате циклического взаимодействия миозина иактина 15,16. Миозиновая тяжёлая цепь (MyHC) является наиболее подходящим маркером для идентификации типаволокна 12,13. В зависимости от изоформы экспрессируемого MyHC скорость сокрачимости мышц может варьироваться. Как уже упоминалось, волокна типа I являются медленно окисляющими, в отличие от волокон типа II. Доминирующие мышечные группы типа I содержат большее количество окислительных ферментов, богатее митохондриями и имеют плотную капиллярную сеть для перфузиимышцы 17,18 (представьте марафонца). Волокна типа I кодируются геном MYH7 13,19. Волокна типа II быстро устают, содержат высокую долю гликолитических ферментов и обладают большей максимальной скоростью укорачивания, что делает их идеальными для коротких всплесков силы или движения (например, пауэрлифтер). Волокна типа II для типов IIa, IIx и IIb (у грызунов) кодируются генами MYH2, MYH1 и MYH4 соответственно20,21. Неудивительно, что любое патофизиологическое нарушение, влияющее на целостность мышц, изменяет состав волокон и приводит к негативному влиянию на мышечную функцию, потенциально снижая качество жизни. На самом деле, многие мышечные дистрофии начинаются либо в сателлитной клеточной (сателлитные опатии), либо в мышечном волокне (происходящие из моторных нейронов или мышечной ткани), и могут вызывать сдвиг в составе типаволокон 22,23,24,25. Например, исследования травмы спинного мозга, постельного режима и космические полёты (микрогравитация) показывают, что длительное бездействие может привести к переходу осаночных мышц с медленного на быстрый фенотипволокна 26,27,28,29,30. Напротив, при мышечной дистрофии Дюшенна, как в человеческой, так и у мышиной моделей (mdx), быстрые гликолитические волокна поражаются в большей степени и с большей тяжестью по сравнению с более медленнымианалогами 31,32,33,34. Аналогично, при лицевой лопаточно-плечевой мышечной дистрофии (ФСХД) наблюдается быстрый к медленный сдвиг при большей доле волокон типа I и меньшей выработке силы в волокнах типаII 24,35,36.

До сих пор неясно, почему определённые типы мышечных волокон избирательно поражены или защищены при различных заболеваниях. Тот факт, что эти паттерны не являются случайными, подчёркивает важность вскрытия основных механизмов, для которых изоляция одного волокна стала мощной и широко используемой техникой. Действительно, с момента первого представления в середине 80-х годовБишоффом 37, этот незаменимый инструмент постоянно совершенствовался и адаптировался, позволяя всё более точно исследовать биологиюмышц 38,39,40. Важно, что изоляция одной волокна поддерживает СК максимально близко к их физиологической нише, обеспечивая адекватный контроль их молекулярной активности. Хотя такие мышечные группы, как сгибатели пальцев (FDB) и EDL, можно извлечь с относительнойлёгкостью (41,42,43), мышца SOL остаётся одной из самых сложных для получения богатой популяции целых волокон. Это связано с его жёсткостью, длиной волокон и уязвимостью к повреждениям. Для решения этой проблемы в настоящем исследовании была оптимизирована методика, которая надёжно обеспечивает высококачественную, жизнеспособную популяцию волокон из печально известной своей трудноизоляции мышцы SOL. В сочетании с выделением волокон EDL этот подход позволяет выращивать волокна и производные клетки (сателлитные клетки, миобласты и миотрубы) из различных мышечных групп. Ключевым является то, что эта платформа позволяет систематически изучать молекулярные факторы, которые могут по-разному способствовать развитию различных мышечных патологий, и предоставляет мощный инструмент для тестирования фармацевтических вмешательств таким образом, чтобы выявлять специфические для типа мышц реакции и, в конечном итоге, поддерживать разработку эффективных методов лечения заболеваний скелетных мышц.

Протокол

Все животные содержались в доме для животных Токийского столичного университета (номера разрешений: A4-4, A5-9, A6-7, A7-018). Все животные содержались в определённых условиях, свободных от патогенов (SPF). Методы обращения с животными и экспериментальные процедуры, применённые в этом исследовании, строго соответствовали рекомендациям Комитета по безопасности и этике Токийского столичного университета.

1. Подготовка реагентов

  1. Надевайте перчатки на протяжении всего курса. В центрифугной трубке объемом 25 мл приготовьте 0,5% раствора коллагеназы типа I в высокоглюкозной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMAX с 1% суспензией пенициллин-стрептомицина-амфотерицина B (AB). После того как коллагеназа хорошо растворена (при необходимости слегка постукивайте по трубке), раствор стерилизуйте, фильтруя через фильтр с низким содержанием белков с уровнем 0,22 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 2,5 мл раствора коллагеназы достаточно для двух солейсов (одной мыши).
  2. Приготовьте 10 мл 5% бычьей сыворотки альбумина (BSA) в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS). Инактивировать при температуре 60 °C в течение 30 минут, затем фильтровать раствор через фильтр с низким уровнем связывания белков с толщиной 0,22 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 5% BSA в растворе PBS можно хранить при 4 °C до 10 дней.

2. Диссекция мышц солевого мозга

  1. Оборудование для раскладки для диссекции мышц (рисунок 1A).
  2. Анестезировать мышей C57BL/6 путём внутрибрюшнической инъекции тройной анестетической смеси (0,5 мл/г массы тела), содержащей 1 мг/мл гидрохлорида медетомидина, 5 мг/мл мидазолама и 5 мг/мл буторфанол тартрат, затем эвтаназии мышей путем вывиха шейки матки.
  3. Сделайте последовательные кожные разрезы на задней конечности и снимите кожу. Удалите поверхностную фасцию.
  4. Отдельте сухожилие подошвенного мышца (PLA) от пучков сухожилий гастрокнемиус (GAS) и солевого сухожилия (SOL). Аккуратно удалите PLA, вытягивая из сухожилия (рисунок 1B).
  5. Перережьте сухожилия GAS и SOL и обнажите мышцы. Вставьте штифт в зазор между проксимальным сухожилием GAS и SOL (рисунок 1C).
  6. Аккуратно сдвигайте иглу к дистальному концу, чтобы отделить мышцы SOL и GAS (рисунок 1D).
  7. Отрежьте сухожильные пучки со стороны GAS (рисунок 1E).
  8. Оставьте SOL на GAS. Аккуратно отрегулируйте положение SOL, чтобы обнажить проксимальное сухожилие, и разрежьте его парой микроножниц (рисунок 1F).
  9. Разместите SOL на столе для вскрытия и удалите оставшееся сухожилие (рисунок 1G).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необязательный; Оставшееся сухожилие не влияет на результат.

3. Пищеварение мышц каблевого мозга

  1. Переместить целый солеус в центрифугную трубку объемом 25 мл, содержащую подготовленный раствор коллагеназы 0,5%. Инкубировать при 37 °C в течение 130 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждые 15–20 минут можно вручную перемешивать образец, чтобы слегка отделить волокна и поддержать активность коллагенази.

4. Изоляция отдельных волокон под стереомикроскопом

  1. Вырежьте две пипетки Пастера, чтобы получить одну с широким отвором, другую с узким отверстием (рисунок 2A). Под огнём стерилизуйте и сглаживайте отверстия, чтобы избежать повреждения мышц во время тритурации.
  2. Чтобы предотвратить склеивание волокон во время изоляции, покрыть пипетки Пастера и три чашки Петри диаметром 50 мм 5% BSA/PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стереомикроскоп (рисунок 2B) использовался на всех этапах изоляции.
  3. После переваривания мышц сбросьте излишки раствора коллагеназы и переложите солевую жидкость в первую чашу с DMEM с 1% AB (рисунок 2C).
  4. Используя ширококалиберную пипетку Пастера, аккуратно промывайте вверх и вниз, чтобы отделить волокна (рисунок 2D).
  5. С узкой пипеткой Пастера перенесите целые одиночные волокна вдоль мышечной длины к второй тарелке. Воспользуйтесь возможностью удалить мусор и/или смятые волокна (рисунок 2E,F).
  6. Перенесите высококачественные (полноразмерные/целые) одиночные волокна в третью чашу для обеспечения чистоты узкоотворительной пипеткой Пастера (рисунок 2G,H).
  7. Соберите волокна в центрифугу с покрытием BSA объемом 25 мл. Аккуратно перемешайте суспензию, затем оставьте её на 5 минут при комнатной температуре, чтобы волокна стекли на дно трубки.
  8. Используя узкоствольную пипетку Пастера, аккуратно сбросьте супернатант, удаляя остатки мусора. Оставьте примерно 500 мкл DMEM с раствором AB 1%. Этот осад содержит высокоочищенную популяцию отдельных мышечных волокон (рисунок 2G,H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод может дать > 300 отдельных волокон, которые затем могут использоваться для извлечения белков и мРНК и последующего анализа.

5. Установка высокоочищенных миобластных культур из волокон солеуса

  1. Разведите матрицу матригеля до 0,1 мг/мл и используйте её для покрытия посевной чаши толщиной 100 мм. Инкубировать блюдо при 37 °C в течение 30–60 минут, пока покрытие равномерно не полимеризуется.
  2. Добавьте равный объём аккутазы в суспензию мышечных волокон и инкубуйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавьте 10 мл среды для роста (состоящую из безглюкозного DMEM, содержащего 30% сыворотки плода бычьего скота, 1% GlutaMAX, 1% экстракта куриного эмбриона, CEE, 1% AB и 0,01 мкг/мл фактора роста основного фибробласта, bFGF)44.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Равное количество аккутазы в данном случае — это 500 мкл, описанное в разделе 4.8. Аккутаза способствует мягкой диссоциации мышечных волокон и способствует высвобождению сателлитных клеток, поддерживая дальнейшее расширение культуры миобластов.
  3. Переложите 10 мл суспензии мышечных волокон, обработанной аккутазой, в чашку с матригелем. Примерно 4 одиночных волокна/см² добавляются в посевную чашу диаметром 100 мм. Убедитесь, что волокна равномерно распределены по всей поварке для культуры.
  4. Через 3 дня в культурной среде можно наблюдать миобластные колонии. Ежедневно заменяйте среды роста, пока миобласты не достигнут необходимой популяции. Обычно к 6-му дню культуры миобластов становятся достаточно сливающимися для экспериментальной фазы (рисунок 3A).
  5. Отдельте миобласты от их исходной культурной тарелки с помощью трипсина и инкубируют образец при 37 °C в течение 2 минут. С помощью гемоцитометра подсчитывайте клетки и семена в зависимости от размера ямки и необходимой слияния клеток для прогрессирования миогена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для тарелки диаметром 100 мм добавьте 1 мл трипсина.

Результаты

Наша методика демонстрирует, что изолированные волокна мышц состевого мышца (SOL) и разгибателя длинного пальца (EDL) могут быть эффективно иммуномаркированы против Pax7 (рисунок 3B). Эти изолированные волокна могут храниться в плавающей культурной среде (состоящей из DMEM + GlutaMAX с 10% лошадиной сывороткой, 1% AB, 0,5% CEE) в течение 3 дней, после чего следует иммуномаркировка (рисунок 3B). Держать плавающие волокна дольше 4 дней не рекомендуется. В описанных условиях плавающих волокон миофибра, как правило, агрегируются после этого времени, что нарушает последующий анализ иммуномаркировки.

Представленная техника может также использоваться для иммуноблотирования по всей миогенной программе (рисунок 3C). Действительно, миобласты, полученные от SOL и EDL, были покрыты в пластины с 24 лунками примерно на 70% слияния. Клетки либо поддерживались в среде роста в течение 1 дня (миобласты), либо индуцированы для дифференцировки в течение двух-четырёх дней (раннеобразующиеся и дифференцированные миотрубы соответственно). Для анализа иммуноблоттинга было загружено пять мкг белка.

Экспрессия MyHC I почти специфически экспрессировалась в мышечных волокнах, полученных от SOL, с минимальной экспрессией в миотублах и незначительной в миобластах (рисунок 3C). MyHC II экспрессировался как в волокнах мышц SOL, так и в EDL. Это выражение отражает SOL, состоящий преимущественно из типов I и IIa, тогда как EDL состоит преимущественно из волокон IIx и IIb. Миобласты не экспрессировали MyHC II, но его экспрессия постепенно увеличивалась во время дифференцировки. Окисляющие белки PGC-1α и COXIV продемонстрировали ожидаемое повышенное выражение в волокнах, полученных из SOL. Кроме того, в изолированных волокнах SOL была обнаружена более высокая экспрессия GLUT4 по сравнению с волокнами EDL. Проблемой, с которой могут столкнуться биологи скелетных мышц, является то, что широко используемые домашние белки и контроли нагрузки, такие как α-тубулин, β-актин, GAPDH и тотальные белковые окраски, включая Ponceau S, не остаются стабильными на миобластах, миотубах и изолированных мышечных волокнах, каждое из которых демонстрирует свою изменчивость. Интенсивность сигнала α-тубулина и β-актина была наивысшей в миотубах, тогда как окрашивание по S-образу Понсо было относительно слабым в миобластах. В отличие от этого, GAPDH показал более выраженную экспрессию в мышечных волокнах EDL. Тем не менее, в зависимости от целей, один из этих домашних белков может быть применим, а также можно исследовать факторы нормализации, такие как тепловой шоковый белок 70 (HSP70).

Рисунок 1
Рисунок 1. Рассечение мышцы калезовой кости. (A) Оборудование, необходимое для вскрытия. 1: микроножницы, 2: тонкие щипцы, 3: ножницы для вскрытия, и 4: штифты для диссекции. (B) Сухожилие PLA было перерезано из пучков сухожилий GAS и SOL (жёлтая стрелка). Дистальное сухожилие PLA (белая стрела) было поднято щипцем. (C) В пространство между проксимальным сухожилием SOL (красная стрелка) и GAS (зелёная стрелка) был вставлен штифт для диссекции. (D) SOL был отделён от GAS с помощью дисекционного штифта. (E) Сухожильные пучки GAS и SOL затем были вырезаны на стороне GAS. (F) Проксимальное сухожилие SOL затем было перерезано микроножницами. (G) Были удалены дополнительные дистальные сухожильные пучки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Изоляция волокон колба. (A) Оборудование, необходимое для изоляции. 1: узкоотворительные и 2: широкоствольные пипетки Пастера. (B) Стереомикроскоп, используемый для изоляции. (C) Коллагеназом переваренная солейс была перенесена в DMEM с 1% AB. (D) Волокна солеуса отделились от мышцы после первых 10 сеансов промывания. (E) Отдельные волокна перенесены во вторую тарелку. (F) Изображение показывает чистые волокна, удаленные от мусора и уменьшенных волокон. (G) Одиночные волокна без мусора передаются на третью тарелку. (H) Целые одиночные волокна хорошо видны. Шкала = 10 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Расширение клеточной культуры и анализ образцов, полученных из EDL и SOL. (A) Через 6 дней после изоляции образцы пролиферационной среды показывают чистую миобластную культуру, полученную из изолированных волокон солеуса. Шкала = 100 мкм. (B) Одиночные волокна, полученные от EDL, сразу или через 3 дня после изоляции, показывают сателлитные клетки, иммуномаркированные Pax7 (зелёный). Отсутствие MyoD (красный) подтверждает, что сателлитные клетки ещё не зафиксировали миогенную активацию. Волокна окрашивались DAPI (синим цветом). Клетки впоследствии наблюдались с помощью флуоресцентного микроскопа. Scale bar = 20 мкм. (C) 5 мкг белка использовалось для иммуноблотирования миобластов, миотуб и образцов, полученных из миофибра. Панели иммуноблоттинга показали экспрессию MyHC I, MyHC II, PGC-1α, COX IV, GLUT4, α-тубулина, β-актина и GAPDH в качестве домашних и нормализующих целей. Окраска Ponceau S использовалась для полного контроля нагрузки белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Первым ключом к выделению большого количества мышечных волокон от сосоле (SOL) является поддержание структурной целостности мышцы во время вскрытия. Если эпимизий SOL разрывается или мышцу сильно тянут, особенно вдоль продольной оси, во время рассечения, изоляционная выходность будет сильно нарушена. Эти ошибки вскрытия обычно легко выявить после. Действительно, после переваривания коллагеназы мышца равномерно уменьшается и образует белую компактную массу. При таких условиях может быть диссоциировано лишь очень небольшое количество жизнеспособных волокон.

Вторым решающим фактором для успешного выделения солея является эффективность пищеварения коллагеназы типа I. Когда коллагеназа работает оптимально, за первые 10 сеансов промывания можно получить примерно 100–200 волокон солеуса. В отличие от этого, при неоптимальном пищеварении даже после первых 20 промываний может выделяться менее 50 волокон. Для получения более высокого выхода волокна требуется более интенсивное промывание и дополнительные циклы промывания. Однако, поскольку волокна SOL чрезвычайно хрупкие, это часто приводит к их усадке во время промывания.

Для формирования чистой культуры первичных миобластов, полученных из SOL, переваривание коллагеназы вновь играет ключевую роль. При эффективном пищеварении меньше волокон остаётся прикреплённым к остаточным тканям, и перенос волокон в культурную среду приводит к минимальному загрязнению фибробластами. В отличие от этого, при плохом переваривании SOL диссоциированные волокна остаются прикреплёнными к остаточным тканям, загрязняя культуру миобластов фибробластами. Исследователям следует искать типичные признаки загрязнения фибробластами в образцах засеянных клеток; к ним относятся гораздо более крупные клетки и обширные цитоскелетные выступы по сравнению с гораздо меньшими веретенообразными сателлитными клетками в приклеенных антеннах, покрытых матригелем. В случае загрязнения исследователи могут подвергать клетки предварительному покрытию, как описано в другомместе 45. Кратковременно SC культивируют в течение 3 дней после изоляции, затем трипсинизируют и кратковременно размещают на коллагеновой посуде. В течение 15–30 минут инкубации фибробласты прилипают, в то время как SC остаются взвешенными и переносятся в свежие покрытые матригелем пластины.

Как упоминалось выше и в соответствии с нашим опытом, волокна SOL длиннее и хрупче, чем волокна из длинного разгибателя пальцев (EDL) и сгибателя пальцев (FDB). Это усложняет передачу волокон с помощью пипеток Пастера. Важно аспирировать волокна вдоль продольной оси, а не тянуть их из середины; в противном случае волокна складываются и сжимаются под нагрузкой. Помимо решающих факторов, напрямую определяющих успех изоляции волокна, для повышения выхода волокна из сосолеса необходимы дополнительные технические шаги. Один из них — покрыть все пипетки, тарелки и трубки Pasteur 5% BSA. Это предотвращает прилипывание свежих диссоциированных мышечных волокон к поверхностям, тем самым предотвращая их складывание и последующее уменьшение. Рекомендуется каждый раз при выделении образцов мышц готовить новые термостерилизированные пипетки Pasteur с покрытием BSA. В качестве альтернативы исследователи могли бы подготовить набор пипеток Pasteur для длительного использования. Если да, стерилизуйте термической стерилизацией каждый раз и свежим слоем BSA перед использованием.

Традиционный протокол изоляции отдельных мышечных волокон был в первую очередь оптимизирован для гликолитических мышц, таких как FDB иEDL 37. Однако окисляющие мышцы, такие как SOL, структурно различаются. Транскриптомные анализы показали, что экспрессия генов, связанная с внеклеточным матриксом (ECM), различается между SOL иEDL 46, включая такие гены, как дистрофин — цитоскелетный связующий белок скелетноймышцы 44. Следовательно, стандартное условие для переваривания мышц EDL с коллагеназой 0,2% (2 мг/мл) в течение 60–90 минут не оптимально для мышц SOL, что приводит к образованию компактных пучков или уменьшения волокон после пищеварения. В этом исследовании мы оптимизировали несколько ключевых шагов для адаптации протокола для окисляющих мышц SOL. Регулировав концентрацию коллагеназы типа I до 0,5% (5 мг/мл), продлевая инкубационный период до 130 минут и минимизируя механические нагрузки при промывании, можно стабильно получить от 300 до 500 целостных волокон от одной мыши. По сравнению с EDL количество волокон и выход образцов SOL остаются меньше (EDL может дать > 500 волокон); тем не менее, количество волокон и, что важно, высокое качество наших волокон, полученных из SOL, надёжны и подходят для дальнейших применений, таких как иммуномаркировка и иммуноблотирование. Хотя наши результаты иммуноблоттинга состояли из объединённых образцов одного волокна, техника, представленная в этом отчёте, способна надёжно извлекать целые отдельные волокна, что делает их пригодными для последующих применений, таких как иммуноблоттинг, протеомика и секвенированиеРНК 47 с разрешением одного волокна. Исследователи в этой области могут использовать этот метод для изучения метаболических и сократительных различий между окислительными и гликолитическими мышечными волокнами.

В целом, этот протокол обеспечивает воспроизводимый и доступный метод выделения целых окислительных волокон от солевой мышцы, расширяя набор инструментов для изучения специфической физиологии и молекулярных механизмов, связанных с типом мышечных волокон.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

Это исследование было поддержано учреждением университетских стипендий для создания инноваций в области науки, технологий (JST, грант No JPMJFS2139 Т.Х.) а также гранты от Японского общества содействия науке (KAKENHI 23H00457 присуждено N.L.F., 20J12849 Y.Mi., 24K22254 Y. Ma). Это исследование также было поддержано грантом Tokyo Metropolitan Government Advanced Research Grant [R2-2] для Y.Ma., N.L.F., и стратегическим исследовательским фондом TMU для инновационного исследовательского проекта [R3] для N.L.F. Благодарим Ясуро Фуруичи за его советы и полезные комментарии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Basic fibroblast growth factorPeprotech450-33
Bovine serum albuminSigmaA9418
Butorphanol tartrateMeiji Yakuka Co., Ltd711-12Название продукта: Vetorphale injection
Chicken Embryo ExtractUS BiologicalC3999
Collagenase type IWorthingtonM9B2717
DAPISigma-AldrichD9542
Fetal bovine serumGibco10437-028
Glucose-free DMEMGibcoA14430-01
GlutaMAXGibco10569
High-glucose DMEM+GlutaMAXGibco10569-010
Horse serumLife technology16050-130
Low-protein binding filterMilliporeSLGVR33RB
MatrigelCorning354230
Medetomidine hydrochlorideKyoritsu Seiyaku Co., Ltd8816Название продукта: Dorbene Injection
MidazolamMaruishi Pharmaceutical Co., Ltd4987211762100Название продукта: Dormicum Injection
Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspensionWako161-23181
Ponceau S stain solutionSigma-Aldrich24-3875-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056
Equipment
Centrifuge tubes (25 mL)IWAKI2362-025
Fluorescence microscopeKeyenceBZ-X810
Pasteur pipettesIWAKI5 3/4 IK-PAS-5P
StereomicroscopeLeicaM165C
Sterilin dishes (100-mm)Thermo Scientific3020-100Упоминается как чаша Петри в рукописи
Антитела для иммуномаркирования
Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-327231:400
Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-110121:400
Mouse Anti-Myosin Heavy ChainR&D SystemsMAB44701:400
Mouse Anti-Pax7DSHBAB-5284281:100
Rabbit Anti-MyoDSanta Cruz Biotechnologysc-7601:100
Антитела для иммуноблоттинга
HRP-conjugated Anti-mouse IgGCytivaNA9311:1000/ лошадиная пероксидаза
HRP-conjugated Anti-Rabbit IgGCytivaNA9341:1000/ лошадиная пероксидаза
Mouse Anti-MyHC ISigmaM84211:1000/ Myosin Heavy Chain I
Mouse Anti-MyHC IISigmaM42761:1000/ Myosin Heavy Chain II
Mouse Anti-PGC-1αSanta Cruz Biotechnologysc-5173801:1000/ Pparg соактиватор 1 альфа
Mouse Anti-α-tubulinCell Signaling Technology#38731:1000/ Альфа тубулин
Rabbit Anti-COXIVCell Signaling Technology#48501:1000/ Цитохром c оксидаза IV
Rabbit Anti-GAPDHCell Signaling Technology#22181:10000/ Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
Rabbit Anti-GLUT4Cell Signaling Technology#22131:1000/ Транспортер глюкозы 4
Rabbit Anti-β-actinProteintech20536-1-AP1:2000/ Немышечный бета-актин

Ссылки

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18–88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9 (2), 493-495 (1961).
  3. Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The skeletal muscle satellite cell: The stem cell that came in from the cold. J Histochem Cytochem. 54 (11), 1177-1191 (2006).
  4. Zammit, P. S., et al. Pax7 and myogenic progression in skeletal muscle satellite cells. J Cell Sci. 119 (9), 1824-1832 (2006).
  5. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  6. Günther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  7. Gnocchi, V. F., White, R. B., Ono, Y., Ellis, J. A., Zammit, P. S. Further characterisation of the molecular signature of quiescent and activated mouse muscle satellite cells. PLoS One. 4 (4), e5205(2009).
  8. Halevy, O., et al. Pattern of Pax7 expression during myogenesis in the posthatch chicken establishes a model for satellite cell differentiation and renewal. Dev Dyn. 231 (3), 489-502 (2004).
  9. Biressi, S., Rando, T. A. Heterogeneity in the muscle satellite cell population. Semin Cell Dev Biol. 21 (8), 845-854 (2010).
  10. Zammit, P. S. All muscle satellite cells are equal, but are some more equal than others. J Cell Sci. 121 (18), 2975-2982 (2008).
  11. Ortuste Quiroga, H. P., Fujimaki, S., Ono, Y. Pax7 reporter mouse models: A pocket guide for satellite cell research. Eur J Transl Myol. 33 (4), (2023).
  12. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  13. Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
  14. Ahmetov, I. I., Vinogradova, O. L., Williams, A. G. Gene polymorphisms and fiber-type composition of human skeletal muscle. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 22 (4), 292-303 (2012).
  15. Guth, L., Samaha, F. J. Qualitative differences between actomyosin ATPase of slow and fast mammalian muscle. Exp Neurol. 25 (1), 138-152 (1969).
  16. Aguilera-Alcala, N., Morales-Reyes, Z., Martin-Lopez, B., Moleon, M., Sanchez-Zapata, J. A. Role of scavengers in providing non-material contributions to people. Ecol Indic. 117, 11(2020).
  17. Sullivan, S. M., Pittman, R. N. Relationship between mitochondrial volume density and capillarity in hamster muscles. Am J Physiol. 252 (1), H149-H155 (1987).
  18. Fujita, N., et al. Changes in lipid metabolism and capillary density of the skeletal muscle following low-intensity exercise training in a rat model of obesity with hyperinsulinemia. PLoS One. 13 (5), e0196895(2018).
  19. Narusawa, M., et al. Slow myosin in developing rat skeletal muscle. J Cell Biol. 104 (3), 447-459 (1987).
  20. Faerman, A., Shani, M. The expression of the regulatory myosin light chain 2 gene during mouse embryogenesis. Development. 118 (3), 919-929 (1993).
  21. Denardi, C., et al. Type 2x-myosin heavy chain is coded by a muscle fiber type-specific and developmentally regulated gene. J Cell Biol. 123 (4), 823-835 (1993).
  22. Ciciliot, S., Rossi, A. C., Dyar, K. A., Blaauw, B., Schiaffino, S. Muscle type and fiber type specificity in muscle wasting. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2191-2199 (2013).
  23. Talbot, J., Maves, L. Skeletal muscle fiber type: Using insights from muscle developmental biology to dissect targets for susceptibility and resistance to muscle disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (4), 518-534 (2016).
  24. Celegato, B., et al. Parallel protein and transcript profiles of FSHD patient muscles correlate to the D4Z4 arrangement and reveal a common impairment of slow to fast fibre differentiation and a general deregulation of MyoD-dependent genes. Proteomics. 6 (19), 5303-5321 (2006).
  25. Ganassi, M., Muntoni, F., Zammit, P. S. Defining and identifying satellite cell-opathies within muscular dystrophies and myopathies. Exp Cell Res. 411 (1), 112906(2022).
  26. Gallagher, P., et al. Effects of 84-days of bedrest and resistance training on single muscle fibre myosin heavy chain distribution in human vastus lateralis and soleus muscles. Acta Physiol Scand. 185 (1), 61-69 (2005).
  27. Grimby, G., Broberg, C., Krotkiewska, I., Krotkiewski, M. Muscle fiber composition in patients with traumatic cord lesion. Scand J Rehabil Med. 8 (1), 37-42 (1976).
  28. Shenkman, B. S. From slow to fast: Hypogravity-induced remodeling of muscle fiber myosin phenotype. Acta Naturae. 8 (4), 47-59 (2016).
  29. Ohira, T., Kawano, F., Goto, K., Ohira, Y. Responses of skeletal muscles to gravitational unloading and/or reloading. J Physiol Sci. 65 (4), 293-310 (2015).
  30. Higashino, K., et al. Early changes in muscle atrophy and muscle fiber type conversion after spinal cord transection and peripheral nerve transection in rats. J Neuroeng Rehabil. 10, 46(2013).
  31. Webster, C., Silberstein, L., Hays, A. P., Blau, H. M. Fast muscle fibers are preferentially affected in Duchenne muscular dystrophy. Cell. 52 (4), 503-513 (1988).
  32. Pedemonte, M., Sandri, C., Schiaffino, S., Minetti, C. Early decrease of IIx myosin heavy chain transcripts in Duchenne muscular dystrophy. Biochem Biophys Res Commun. 255 (2), 466-469 (1999).
  33. Rafael, J. A., et al. Dystrophin and utrophin influence fiber type composition and post-synaptic membrane structure. Hum Mol Genet. 9 (9), 1357-1367 (2000).
  34. Kotelnikova, E., et al. Novel approach to meta-analysis of microarray datasets reveals muscle remodeling-related drug targets and biomarkers in Duchenne muscular dystrophy. PLoS Comput Biol. 8 (2), e1002365(2012).
  35. Banerji, C. R. S., Zammit, P. S. Pathomechanisms and biomarkers in facioscapulohumeral muscular dystrophy: Roles of DUX4 and Pax7. EMBO Mol Med. 13 (8), e13695(2021).
  36. Lassche, S., et al. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neurology. 80 (8), 733-737 (2013).
  37. Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Dev Biol. 115 (1), 129-139 (1986).
  38. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (10), 773-779 (1995).
  39. Collins, C. A., Zammit, P. S. Isolation and grafting of single muscle fibres. Methods Mol Biol. 482, 319-330 (2009).
  40. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system—a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  41. Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods Mol Biol. 946, 431-468 (2013).
  42. Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 248-261 (2020).
  43. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14(2018).
  44. Omairi, S., et al. Regulation of the dystrophin-associated glycoprotein complex composition by the metabolic properties of muscle fibres. Sci Rep. 9 (1), 2770(2019).
  45. Moyle, L. A., Zammit, P. S. Isolation, culture and immunostaining of skeletal muscle fibres to study myogenic progression in satellite cells. Methods Mol Biol. 1210, 63-78 (2014).
  46. Hettige, P., Tahir, U., Nishikawa, K. C., Gage, M. J. Comparative analysis of the transcriptomes of EDL, psoas, and soleus muscles from mice. BMC Genomics. 21 (1), 808(2020).
  47. Blackburn, D. M., Lazure, F., Soleimani, V. D. RNA sequencing of single myofibers from Mus musculus. Bio Protoc. 10 (4), e3525(2020).

Перепечатки и разрешения

Теги

Анализ изоляции отдельных волокон для оценки поведения окислительного миофибра
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.