Трёхмерная модель культуры, поддерживающая развитие вторичного и антрального фолликулов человека in vitro

Краткое содержание

В этом исследовании была установлена трёхмерная (3D) модель культуры, которая поддерживает развитие человеческих фолликулов от вторичной до антральной стадии in vitro. Эта система способствует росту фолликулов и образованию антрумов при сохранении молекулярных особенностей соматических клеток, предоставляя критически важную модель для исследований фолликулогенеза человека.

Аннотация

Фолликулогенез яичников человека — это сложный, строго регулируемый процесс, который сложно изучать непосредственно in vivo. Хотя модели in vitro необходимы для механистических исследований, существующие системы остаются неоптимальными, поскольку не могут воспроизвести пространственно-временную динамику развития фолликулов. В данном исследовании представлена модель 3D-культуры, поддерживающая развитие человеческих фолликулов от вторичной до антральной стадии. Эта модель успешно повторяет ключевые морфологические события in vivo , включая устойчивый рост фолликулов, фазу расширения с выраженным диаметром с 10-го дня и формирование антральной полости около 20-го дня. Важно отметить, что эта прогрессия развития завершилась успешным извлечением жизнеспособных яйцеклетки на стадии зародышевой пузырьки (GV). Кроме того, иммунофлуоресцентный анализ выявил различные паттерны экспрессии гонадотропиновых рецепторов в соматических клетках, что соответствует гранулозе и идентичности тека-клеток. Внутренние клетки, похожие на гранулезу, демонстрировали высокий уровень фолликулостимулирующих гормонов (FSHR), тогда как внешние клетки, похожие на теку, демонстрировали высокую экспрессию лютеинизирующих гормонов (LHR). Эта модель предоставляет ценную платформу для изучения человеческого фолликулогенеза и репродуктивной токсикологии, а также служит ориентиром для оптимизации систем культуры фолликулов in vitro для развития на вторичной и антральной стадиях.

Введение

Физиологический процесс развития фолликулов яичников, от первичной до доовуляционной стадии, является фундаментальным для женской^{фертильности 1}. Этот процесс включает высокоскоординированную серию событий, включая рост/созревание яйцеклетки и пролиферацию/дифференцировку гранулезных^{клеток 2}. Нарушения этих сложных механизмов являются основной причиной бесплодия и дисфункции яичников. Детальное понимание регуляторных сетей, лежащих в основе фолликулогенеза — включая паракринные сигналы, взаимодействие яйцеклетки с соматическими клетками и динамику внеклеточного матрикса — имеет критическое патофизиологическое значение. Однако прямое исследование человеческого фолликулогенеза in vivo остаётся ограниченным этическими и практическими ограничениями, что порождает необходимость надёжных моделей in vitro для разъяснения этих механизмов. Несмотря на достижения, остаётся критически нехватка долгосрочной модели культуры, поддерживающей развитие человеческих фолликулов, особенно от вторичной до антральной стадии.

Хотя культура фолликулов человека в двумерных (2D) или трёхмерных (3D) матрицах имеет продвинутое понимание раннего развития фолликулов ^3,4, такие системы остаются ограниченными в поддержке прогрессии на более поздних стадиях. Примечательно, что достижение человеческого фолликулогенеза in vitro на более поздних стадиях развития остаётся особенно сложным из-за их большого размера фолликулов и увеличенного срока^{созревания 5}. Даже среди ограниченного числа человеческих систем культуры фолликулов in vitro, успешно получивших MII-яйцеклетки, темпы созревания остаются низкими (примерно 20% максимум)6,7,8,9. Возможно, более фундаментальным вызовом является повторное воссоздание перехода вторичного в антральный — критической и структурно сложной фазы, которая ещё не была адекватно смоделирована in vitro.

В этом исследовании была установлена 3D-модель культуры, которая поддерживает in vitro развитие вторичных фолликулов человека в антральные фолликулы с различными структурами полости. Эта модель служит основой для дальнейшего изучения регуляторных механизмов, лежащих в основе развития человеческих фолликулов, и служит ориентиром для будущей оптимизации систем культуры фолликулов, направленных на вторично-антральное развитие.

Протокол

Этот протокол исследования был рассмотрен и утверждён Этическим комитетом Третьей больницы Пекинского университета (Одобрение No M2024151). Все законные опекуны несовершеннолетних, участвующих в исследовании, подписали форму информированного согласия.

Источник ткани
Медуллярная ткань человека яичника, используемая в этом протоколе, была получена у четырёх педиатрических пациентов с диагнозом тератомы яичников (в возрасте 2, 6, 13 и 16 лет), которые пожертвовали ткань яичника для исследовательских целей (Таблица 1). Кора яичника использовалась для криоконсервационных исследований тканей яичников, а оставшаяся медуллярная ткань — для культивирования фолликулов in vitro в этом исследовании. Всего было выделено 33 вторичных фолликула, из которых 16 были отнесены к контрольной группе, а 17 — к группе 3D-культуры.

Подготовка реагентов
Транспортная среда состояла из среды L-15 Лейбовица, дополненной 10% сывороточным заместителем и хранящейся при 4 °C. Полный раствор для пищеварения был подготовлен путём добавления MEMα 0,04 мг/мл либеразы-ДГ, 10 МЕ/мл ДНКазы I и 100 МЕ/мл пенициллин-стрептомицина при -20 °C. Раствор для остановки пищеварения был дополнен DPBS, добавленным 10% заменительным препаратом сыворотки и хранящимся при 4 °C. Полная среда для роста была подготовлена путём добавления MEMα 10% замены сыворотки, 1% инсулинтрансферин-селена, 50 мкг/мл L-аскорбиновой кислоты, 2 мМ пирувата натрия и 100 МЕ/мл пенициллин-стрептомицина. Среда хранилась при 4 °C. Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон человека (ФСГ) был добавлен к конечной концентрации 100 мМЕ/мл при начале культуры, как описано в предыдущем^{исследовании 10}. При визуальном обнаружении раннего образования антрума (около 20-го дня) рекомбинантный лютеинизирующий гормон человека (ЛГ) дополнялся до конечной концентрации 10 мМЕ/мл при изменениях среде. Твердая культурная матрица была подготовлена путём смешивания 70% (v/v) базальной мембраны с 30% (v/v) ледяно-холодной полноценной формой для роста и хранилась на льду на всех этапах обработки.

Переваривание тканей и выделение вторичных фолликулов
Ткань яичников помещалась в транспортную среду и транспортировалась в лабораторию при температуре 4 °C. В стерильных условиях медулла яичника была вскрыта с помощью скальпеля. Ткань была разрезана на тонкие части (~3 × 3 × 1 мм) и далее измельчена на мелкие фрагменты (~0,5 × 0,5 × 1 мм) с помощью рубки для тканей, сохраняя ткань влажной на протяжении всей ткани. Измельчённая ткань была перемещена в чашку диаметром 35 мм, а затем добавлен предварительно подогретый раствор полного пищеварения с дозой 2 мл на 100 мг ткани. Инкубация проводилась при 37 °C в течение 45–80 минут (среднее: 60 ± 15 минут), с аккуратным смешиванием каждые 10 минут. Пищеварение было прекращено, когда микроскопическое исследование выявило ослабление стромальной матрицы и высвобождение отдельных фолликулов (см. рисунок 1). Здоровые вторичные фолликулы (диаметр 100–200 мкм, с ≥ 2 слоями гранулезных клеток и видимой яйцеоцитой) были отобраны под стереомикроскопом с помощью стеклянной пипетки с контролем рта (внутренний диаметр 200 мкм) и дважды промывались предварительно нагретой полной средой для роста.

3D-встраивание и долгосрочная культура
Вставка для клеточной культуры была помещена в 35-мм контейнер, увлажнённую полной ростовой средой объёмом 2 мл и предварительно уравновешенную в инкубаторе (37 °C, 5% CO₂) в течение 2 часов. Выбранные вторичные фолликулы были перенесены в вставку и предварительно культивированы за ночь при тех же условиях. В конце предварительной культуры фолликулы контрольной группы культивировались непосредственно внутри вставки (2D-культура). В отличие от этого, фолликулы, предназначенные для 3D-культурной группы, были подготовлены для вложения в матрикс базальной мембраны, редукционированной фактором роста (общий белок 8~12 мг/мл). Матрица была разморажена на льду и смешана с 30% (v/v) ледяной полноценной средой для роста. Капли 40 мкл смеси помещались в чашу диаметром 35 мм (максимум шесть капель на тарелку), чтобы получить равномерный гелевой слой высотой примерно 1,5 мм. Затем в каждую каплю с помощью стеклянной пипетки с управлением ротом перемещался один вторичный фолликул, аккуратно размещённый в средней и верхней трети капли, чтобы предотвратить её опускание. Тарелку помещали в инкубатор (37 °C, 5% CO₂) на 30 минут для желирования. После затвердевания в чашу аккуратно добавляли 2 мл полного растительного материала для начала длительной культуры.

Поддержание и мониторинг культуры
Изменение среднего измерения на 50% свежим полным раствором (с ФСГ) проводилось каждые 48 часов. Фолликулы ежедневно наблюдались под стереомикроскопом, а их диаметры и морфологические характеристики фиксировались. При визуальном обнаружении раннего образования антрума (около 20-го дня) в среду добавлялся рекомбинантный человеческий ЛГ во время последующих изменений. Культура поддерживалась до 30 дней или до достижения антральной стадии фолликулов (диаметр > 400 мкм с чётко очерченной полостью, заполненной жидкостью).

Посткультурная диссоциация клеток
В конце культуры антральные фолликулы переносились в контейнер с свежим DPBS и механически диссоциировали с помощью стерильного шприца калибра 29. Изолированные комплексы кучевой клетки (КОК) были перенесены в отдельную антенну для дальнейшего анализа. Оставшаяся суспензия гранулозы и текаклеток была перенесена в новую 35-мм тарелку с предварительно нагретой полной растительной средой объёмом 2 мл, аккуратно перемешана для равномерного распределения и инкубирована в течение 48 часов (37 °C, 5% CO₂).

Иммунофлуоресцентный анализ
После культуры клетки фиксировали с помощью 4% параформальдегида в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем образцы были промыты три раза с помощью PBS, пермеабилизированы с 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут, а затем заблокированы на ночь при 4 °C с использованием 1% BSA в PBS. Клетки инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами. Основными антителами были анти-FSHR (кролик, 1:200) и анти-LHR (мыши, 1:100). После инкубации клетки промывались три раза по 15 минут каждая, при этом PBS содержал 1% BSA. Впоследствии их инкубировали флуоресцентными вторичными антителами (против кроликов и мышей, 1:200) в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте. Наконец, клетки прошли три финальных промывки, каждое длилось по 20 минут. Ядра окрашивались DAPI в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем образцы были промыты три раза в течение 5 минут с PBS с содержанием 1% BSA. Визуализация проводилась с использованием системы высокого содержания Operetta CLS в конфокальном режиме. Флуоресцентные сигналы фиксировались с помощью следующих каналов: DAPI (405 нм), Alexa Fluor 488 (LHR) и Alexa Fluor 647 (FSHR), с одинаковыми настройками экспозиции для всех образцов.

Статистический анализ
Сравнение диаметра фолликулов между контрольной группой и 3D-культурной группой на 5, 10 и 15 днях проводилось с помощью независимого t-теста образцов. p-значение < 0,05 считалось статистически значимым. Статистический анализ диаметра фолликула не проводился после 15-го дня, так как почти все фолликулы в контрольной группе не выжили после 15-го дня. Это приводило к недостаточному размеру выборки, что исключало надёжные и значимые сравнения групп. Все статистические анализы проводились с использованием GraphPad Prism (версия 9.0).

Результаты

Разработка 3D-модели культуры, поддерживающей рост человеческих фолликулов на антральной стадии
Одной из главных задач в исследованиях фолликулов яичников является разработка системы культуры in vitro , поддерживающей полное развитие фолликулов, при этом формирование антральных полостей является ключевым этапом. Таким образом, это исследование установило 3D-модель культуры человеческих фолликулов in vitro (рисунок 2

Обсуждение

Успешное поддержание фолликулов яичников человека in vitro через переход от вторичного к антральному является значительным техническим достижением. В этом исследовании 3D-система культуры, обеспечивающая соответствующую биофизическую поддержку и специфические гормональные сигналы, специфичные для стадии, позволила этому прогрессированию. Эти результаты совпадают с недавними данными, подчеркивающими необходимость 3D-культурных систем для воссоздания физиологии тканей. Хотя обычны...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Anti-FSHR	HuaBio	ER1909-08
Anti-LHR	Santa Cruz	sc-293165
Anti-mouse(secondary)	Abcam	AB150113
Anti-rabbit(secondary)	Abcam	AB205718
Basement membrane matrix for organoid culture	MCE	K6004
BSA	Sigma	A1933
Cell culture insert	Millipore	PICMORG50
Culture dish	Corning	430165
DAPI	Beyotime	C1006
DNase I	Thermo	EN0525
DPBS	Gibco	14190144
FSH	Merck	F4021
Incubator	Thermo	Heracell 3111
Insulin-Transferrin-Selenium	Gibco	41400045
L-Ascorbic acid	MCE	HY-B0166
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	11415064
LH	Merck	L6420
Liberase DH	Roche	5401054001
McIlwain Tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd.	MP10180-220
MEMα	Gibco	41061029
Paraformaldehyde	Solarbio	P1110
PBS	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Serum substitute supplement	FUJiFILM Irvine	90194
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270
The high-content imaging system	PerkinElmer	Operetta CLS
Triton X-100	Sigma	X100