Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
* These authors contributed equally
В исследовании было введено метил-нитросмочевина мышам с C57BL/6 для индуцирования повреждения сетчатки, а затем лечение активаторами и ингибиторами ALDH2 вместе с SIRT1 и модуляторами стресса эндоплазматического ретикулума (ERS). Протокол был направлен на изучение защитного эффекта этих методов на дегенерацию сетчатки и их влияние на метаболизм альдегида.
В этом исследовании изучались защитные эффекты активации альдегиддегидрогеназы 2 (ALDH2) (через Alda-1), ингибирования ALDH2 (через Дайдзин), а также модуляции сиртуина 1 (SIRT1) и эндоплазматического стресса ретикулума (ERS) на повреждение сетчатки, вызванное метил-нитросмочевином (MNU), у мышей C57BL/6. Семьдесят две мыши были случайным образом распределены по восьми группам, включая контрольную группу, группу с MNU и различные комбинации лечения. Мышам вводили внутрибрюшинные инъекции агонистов и ингибиторов, направленных соответственно на ось ALDH2-SIRT1-ERS. Вес тела, толщина слоя сетчатки и биомаркеры метаболизма альдегидов оценивались на второй и четвёртый день после лечения. Введение MNU вызывало дегенерацию сетчатки, что привело к значительному снижению массы тела во всех группах, кроме контрольной группы. Лечение Alda-1 ослабило повреждение сетчатки, а Дайдзин усугубил его. Фармакологическое ингибирование SIRT1 (через EX-527) уменьшило защитное действие Alda-1, а индукция ERS (через TUN) почти полностью устранила его пользу. В то же время активация SIRT1 (через SRT1720) смягчала побочные эффекты Дайдзина, а ингибирование ERS (через 4-PBA) частично смягчало воздействие Дайдзина. Кроме того, MNU повысил уровни маркеров альдегида (малондиалдегид [MDA] и 4-гидрокси-2-ноненал [4-HNE]), при этом Alda-1 восстановил эти уровни, а Daidzin повысил эти уровни. Кроме того, фармакологическая модуляция путей SIRT1/ERS вмешивалась в регуляторное влияние Alda-1 и Daidzin на метаболизм альдегида. В целом, активация ALDH2 защитила структуру сетчатки и регулировала метаболизм альдегида, что подчёркивает критическую роль оси сигнализации ALDH2-SIRT1/ERS в смягчении дегенерации сетчатки.
Дегенерация сетчатки, являющаяся одной из ведущих причин слепоты во всем мире, включает такие состояния, как пигментный ретинит (РП), возрастная макулярная дегенерация (ВМД) и диабетическая ретинопатия (ДР), которые вместе затрагивают миллионы людей и накладывают значительные социально-экономическиенагрузки 1,2,3. Однако в настоящее время в клинической практике не хватает высокоэффективных фармакологических методов для остановки прогрессирования этих ослепляющих заболеваний сетчатки. Патогенез дегенерации сетчатки многофакторен: он включает окислительный стресс, хроническое воспаление и эндоплазматический ретикулярный стресс (ЭРС), который нарушает гомеостаз клеток сетчатки. Эти стрессоры часто вызываются внутренней дисрегуляцией метаболизма (например, дисфункция митохондрий), что в конечном итоге приводит к апоптозу и необратим повреждениюсетчатки 4. Метил-нитросмочевина (MNU), мощный алкилирующий агент ДНК, стал широко используемым химическим индуктором для моделирования дегенерациисетчатки 5. Модель заболевания сетчатки, вызванной MNU, служит ценным инструментом для изучения механизмов заболевания и оценки возможных терапевтических вмешательств. Механистически MNU вызывает окислительный стресс, генерируя реактивные кислородные формы (ROS) и нарушая окислительный баланс, тем самым повреждая мембраны и органеллы фоторецепторов. Это также может влиять на метаболизм альдегида, ухудшая детоксикацию при перекислении липид. Последующее накопление токсичных альдегидов может усугублять окислительное повреждение, усиливая апоптозфоторецепторов 6.
Альдегиддегидрогеназа 2 (ALDH2), митохондриальный фермент, зависящий от NAD+, играет ключевую роль в детоксикации токсичных альдегидов, таких как 4-гидрокси-2-ноненал (4-HNE) и малондиальдегид (MDA), превращая их в менее реактивные карбоновые кислоты, тем самым предотвращая окисляющееповреждение 7. Устойчивая активность ALDH2 имеет решающее значение для поддержания редокс-гомеостаза, а нарушенная функция ALDH2 связана с ускоренным старением и нейродегенеративнымипатологиями 8. Фармакологическая активация ALDH2, особенно через маломолекулярный агонист Alda-1, была показана как цитопротекторная реакция в различныхмоделях 9,10. Сиртуин 1 (SIRT1), никотинамид-адениндинуклеотид + (NAD+)-зависимая деацетилаза, регулирует стрессовые реакции и энергетический метаболизм, модулируя транскрипционные факторы, включая p53 и ядерный фактор каппа B (NF-κB)11. Активация SIRT1 показала перспективы в стимулировании функции митохондрий и выживаемости клеток, при этом исследования связывают её апрегуляцию с уменьшением окислительного повреждения и воспаления при дегенерациисетчатки 12. Эндоплазматический ретикулумный стресс (ГСС), вызванный накоплением неправильно свернутых белков, активирует неразвернутый белковый ответ (УПР), который может превратиться в проапоптотический каскад при хроническом стрессе. ERS связан с дегенерацией сетчатки, способствуя апоптозуфоторецепторов 13. Несмотря на эти данные, специфическое взаимодействие между ALDH2, SIRT1 и ERS в контексте модели дегенерации сетчатки, индуцированной MNU, остаётся плохо изученным. Кроме того, координированные роли этих взаимосвязанных путей требуют дальнейших систематических исследований.
Поэтому текущее исследование было направлено на изучение влияния ключевых компонентов оси ALDH2-SIRT1-ERS — ALDH2 (через Alda-1 или Daidzin), SIRT1 (через SRT1720 или EX527) и ERS (через 4-PBA или TUN) — на повреждения сетчатки, вызванное MNU, у мышей C57BL/6. Используя гистопатологические и биохимические анализы, мы изучили, как таргетирование этой оси влияет на выживаемость фоторецепторов и метаболизм альдегида. Мы выдвинули гипотезу, что координированная активация ALDH2, усиление SIRT1 и подавление ERS синергетически смягчают дегенерацию сетчатки, вызванную MNU, тем самым давая обоснование для нацеливания на эту ось при дегенеративных заболеваниях сетчатки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Этическое заявление
Все экспериментальные протоколы были рассмотрены и утверждены Комитетом по уходу и использованию экспериментальных животных Фуцзунского клинического медицинского колледжа Фуцзянского медицинского университета и проведены в строгом соответствии с Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) о применении животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.
Животные и распределение групп
Всего было получено 72 самца мышей C57BL/6 (8–10 недель, вес тела 20–25 г), соответствующих национальным стандартам по разведению лабораторных животных. Мыши содержались в индивидуально вентилируемых клетках при стандартизированных условиях окружающей среды, включая 12-часовой цикл света и темноты, контролируемую температуру (22 ± 2 °C) и относительную влажность (50% ± 10%), с импровизованным доступом к еде и воде. Для изучения модуляционных эффектов путей ALDH2, SIRT1 и ERS на повреждение сетчатки, вызванное MNU, мыши были случайным образом распределены на восемь экспериментальных групп (n = 9 на группу; n = 5 для группы второго дня; n = 4 для группы четвёртого дня) с использованием компьютерной последовательности рандомизации для минимизации смещения отбора. Графическая аннотация исследования показана на рисунке 1.
Подготовка и схемы обработки реагентов
Экспериментальные реагенты, использованные в этом исследовании, были перечислены в Таблице материалов с подробной информацией о приготовлении и дозировке следующим образом. (1) MNU (50 мг/кг): 100 мг MNU растворили в 2 мл обычного физиологического раствора для получения раствора 50 мг/мл. Затем 1,4 мл этого раствора разбавляли 5,6 мл обычного физиологического раствора до конечной концентрации 10 мг/мл для введения животным. (2) Alda-1 (10 мг/кг): 50 мг порошка Alda-1 растворили в 1 мл диметилсульфоксида (DMSO) для получения раствора 50 мг/мл, который разбавлялся 24 мл обычного физиологического раствора до конечной концентрации 2 мг/мл. (3) Дайдзин (10 мг/кг): 50 мг порошка Дайдзина растворили в 1 мл ДМСО для получения раствора 50 мг/мл, который затем разводили с 24 мл обычного физиологического раствора до конечной концентрации 2 мг/мл. (4) EX-527 (10 мг/кг): 5 мг порошка EX-527 растворялось в 0,1 мл DMSO для приготовления раствора 50 мг/мл, который разбавлялся 2,4 мл обычного физиологического раствора до конечной концентрации 2 мг/мл. (5) SRT1720 (10 мг/кг): 5 мг порошка SRT1720 растворили в 0,1 мл DMSO и хорошо перемешивали. Затем добавляли 400 мкл PEG300, 50 мкл Tween-80 и 450 мкл обычного физиологического раствора для приготовления рабочего раствора 2 мг/мл. (6) TUN (10 мг/кг): 5 мг порошка TUN растворили в 0,1 мл DMSO для получения раствора 50 мг/мл, который затем разбавлялся с 2,4 мл обычного физиологического раствора до конечной концентрации 2 мг/мл. (7) 4-фенилбутират (4-PBA; 10 мг/кг): 2 мг порошка 4-PBA растворялись в 1 мл обычного физиологического раствора для получения раствора 2 мг/мл. Все вышеуказанные объемы введения составляли 5 × млн миллилитров (где M = масса тела животного в кг). После этого мыши были разделены на восемь групп по следующим протоколам лечения:
Контрольная группа: Одна внутрибрюшинная инъекция нормального физиологического раствора.
Группа MNU: Одна интрабрюшинеальная инъекция MNU.
Группа MNU + Alda-1: Внутрибрюшинная инъекция Alda-1, затем однократный прием MNU через 2 часа. Затем Alda-1 вводили внутрибрюшинно один раз в день.
Группа MNU + Дайдзин: Внутрибрюшинная инъекция Дайдзина, затем однократная инъекция MNU через 2 часа. Дайдзин затем вводили внутрибрюшинно один раз в день.
Группа MNU + Alda-1 + EX-527: Внутрибрюшинная инъекция Alda-1, затем EX-527 через час и MNU через 1 час (однократное введение). Затем Alda-1 вводили внутрибрюшинно один раз в день.
MNU + Alda-1 + группа TUN: Внутрибрюшная инъекция Alda-1, затем TUN через час и MNU через 1 час. Затем Alda-1 вводили внутрибрюшинно один раз в день.
МНУ + Дайдзин + SRT1720 группа: Внутрибрюшинная инъекция Дайдзина, затем SRT1720 инъекция через час и инъекция МНУ через 1 час. Дайдзин затем вводили внутрибрюшинно один раз в день.
МНУ + Дайдзин + группа 4-ПБА: Внутрибрюшинная инъекция Дайдзина, затем 4-ПБА через 1 час и инъекция МНС через 1 час. Дайдзин затем вводили внутрибрюшинно один раз в день.
Мониторинг массы тела
Системная токсичность и физиологические эффекты, связанные с лечением, отслеживались путём ежедневной регистрации массы тела каждой мыши в течение четырёх последовательных дней после введения MNU. Весы измерялись с помощью точных цифровых весов с точностью ±0,1 г, а также были задокументированы данные для отслеживания тенденций потери или набора веса в разных группах, что служило косвенными индикаторами толерантности к лечению и системного стресса.
Исследование гистопатологии сетчатки
На втором и четвёртом днях после эксперимента мышей эвтаназии вывихнули шейки матки после анестезии с помощью инъекции внутрибрюшного (и.п.) пентобарбитала натрия при дозе 50–60 мг/кг массы тела, строго соблюдая институциональные рекомендации по эвтаназии. Глаза, особенно левый, сразу же были энуклеированы. Перед энуклеацией на носовом лимбе был сделан небольшой разрез для обозначения ориентации. Затем шары погружались в 4% параформальдегид (PFA) в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS, pH 7,4) в течение 24 часов при 4 °C для фиксации. Затем фиксированные глаза были обезвожены с помощью серии градированного этанола (70%, 80%, 95% и 100%), очищенных в ксилоле и помещаемых в парафиновые блоки для гистологической обработки. Во время вложения ориентация стандартизировалась путём размещения отмеченной носовой стороны вниз.
Серийные срезы (толщиной 5 мкм) были подготовлены с помощью вращающегося микротома через головку зрительного нерва (ONH) для обеспечения репрезентативного отбора образцов центральной области сетчатки. В частности, срезы были разрезаны от верхней стороны к отмеченной носовой точке, чтобы все секции проходили через ONH. Затем секции монтировались на положительно заряженные стеклянные стеклянные затворы. Окрашивание гематоксилином и эозином (HE) проводилось согласно стандартным протоколам. Морфология сетчатки была оценена световой микроскопией при увеличении 400× Измерения систематически проводились с височной сетчатки на заранее определённых расстояниях от ONH: 200, 400, 600, 800, 1000 и 1200 мкм. В каждом месте измерялись общая толщина сетчатки, длина внутреннего и внешнего сегментов (IS/OS), толщина внешнего ядерного слоя (ONL), толщина наружного плексиформного слоя (OPL) и внутреннего ядерного слоя (INL).
Для обеспечения объективности и минимизации смещения измерений был внедрён строгий протокол контроля качества. В частности, каждая из восьми экспериментальных групп была разделена на пять или четыре подгруппы (например, подгруппа 1, 2, 3, 4, 5). Пять или четыре независимых наблюдателя, ослеплённых к распределению групп, были назначены для измерения одной и той же соответствующей подгруппы во всех экспериментальных группах (например, наблюдатель A всегда измерял подгруппу 1 из каждой группы). В каждой точке измерения были сделаны три измерения в пределах ~5 мкм (например, при 200 мкм, 195 мкм и 205 мкм) и усредненные для минимизации технической ошибки. Количественные измерения проводились с помощью программного обеспечения ImageJ (версия 1.54g), а среднее значение толщины для каждой точки рассчитывалось для обеспечения воспроизводимости.
Маркеры метаболизма альдегида
Для оценки окислительного стресса и метаболизма альдегидов были проанализированы образцы сыворотки на уровень MDA и 4-HNE, которые являются ключевыми биомаркерами перекисления липидов и альдегидного стресса. В частности, все мыши были анестезиированы через внутрибрюшинную (i.p.) инъекцию пентобарбитала натрия при дозе 50–60 мг/кг массы тела. После глубокой анестезии мышей проводилась эвтаназия с вывихом шейки матки. Сразу после эвтаназии глазные яблоки были энуклеированы, и быстро собрали ретробульбарную кровь. Образцам давали свертиться при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего центрифугировали при 3 000 × г в течение 10 минут. Сывороточная фракция аккуратно передавалась в микроцентрифугные пробирки без ферментов и хранилась при -80 °C до дальнейшего анализа. Уровни MDA в сыворотке измерялись с помощью коммерчески доступных наборов для ферментно-связанного иммуноанализа (ELISA) в соответствии с протоколами производителя. Кратко: стандарты и образцы добавлялись к предварительно покрытым микропластинам, инкубировали с помощью специфических первичных антител, промывались для удаления несвязанных материалов и реагировали с вторичными антителами, конъюгированными пероксидазой хрена (HRP). Затем был добавлен субстрат тетраметилбензидина (TMB), и реакция завершалась серной кислотой. Значения оптической плотности (OD) считывались на 450 нм с помощью считывателя микропластин, а концентрации MDA/4-HNE определялись путём сравнения OD с стандартными кривыми, полученными с использованием известных концентраций анализируемых веществ.
Статистический анализ
Все данные были представлены как среднее ± стандартная ошибка (SE). Учитывая малый размер выборки (n = 5 для группы второго дня; n = 4 для группы четвёртого дня), были использованы статистические методы тестирования Bootstrap. В частности, метод редискретизации Bootstrap (1000 итераций с заменой) использовался для оценки 95% доверительных интервалов (CI) для средних групп и сравнения различий между группами. Для каждого результата (например, вес, толщина сетчатки, уровни MDA/4-HNE) выборки Bootstrap были взяты из исходного набора данных, и среднее значение рассчитывалось для каждого повторного отбора. 95% ДИ был получен из2,5-го и 97,5-го процентилей распределения bootstrap. Значимость оценивалась косвенно с помощью следующего подхода, изучая доверительный интервал. Если CI результатов Bootstrap не содержал нуля, это обычно указывало на значительность разницы (при сравнении средних между двумя или более группами). Фигурки создавались с помощью программного обеспечения Graphpad (версия 5.01).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Изменения массы тела
До проведения эксперимента не было значимых различий в массе тела между группами. На второй день после эксперимента, за исключением контрольной группы, где наблюдалось увеличение массы тела с 17,0 ± 0,5 г до 17,4 ± 0,4 г, масса мышей во всех остальных группах значительно снизилась. В частности, мыши группы MNU снизились с 17,4 ± 0,3 г до 16,2 ± 0,2 г, группа MNU + Alda-1 с 17,3 ± 0,3 г до 16,7 ± 0,4 г, группа MNU + Дайдзин с 17,3 ± 0,3 г до 16,2 ±...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Предыдущие исследования предполагали, что агонисты ALDH2 могут оказывать защитный эффект против дегенерации сетчатки, вызванной MNU14. Однако вмешательство ингибитора, а также возможные пути последствий, такие как SIRT1 и ERS, не были подробно изучены. Были проведены исследования, указывающие на участие SIRT1 и ERS в моделях дегенерации сетчатки, включая светоиндуцированную дегенерацию сетчатки и генетически модифицированных мышей с дегенерациейс...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявили о возможных конфликтах интересов относительно исследования, авторства или публикации этой статьи.
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (No 82301245), Совместного фонда инноваций в области науки и техники провинции Фуцзянь (No 2024Y9653), Фонда естественных наук провинции Фуцзянь (No 2024J011148) и Фонда постдокторских наук Фучжоуской общей больницы (номер гранта: 48678).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4HNE Kit | Elabscience,China | E-EL-0128 | Для измерения уровня 4HNE в сыворотке |
| 4-Фениловойбутировой кислоты (4-ПБА) | MCE, US | HY-A0281 | Реагент для ингибирования ERS |
| Alda-1 | MCE, US | HY-18936 | Активатор ALDH2 для исследований |
| Дайдзин | MCE, US | HY-N0018 | Ингибитор ALDH2 для исследований |
| Флуоресцеина натрия | Гуанчжоу | N/A | Используется для полученных с помощью системы флюоресцеиновой ангиографии. Ангиографические изображения анализировались на наличие утечек, неперфузированных участков или изменений в морфологии сосудов сетчатки. |
| Программное обеспечение ImageJ | National Institutes of Health, USA | Версия 1.53t | |
| MDA Kit | Beyotime, China | S0131S | Для измерения уровня МДА в сыворотке |
| N-Нитрозо-N-метилмочевины (MNU) | MCE, US | HY-34758 | Алкилирующий агент ДНК для вызывания дегенерации сетчатки |
| Параформальдегид | Sigma-Aldrich, US | 30525-89-4 | Используется для разрезов ткани сетчатки |
| Прецизионная электронная весы | Electronic scale, China | SF-400 | ЁМКОСТЬ: 5000 г & acute; 1 г/177ozX0.10z, используется для регистрации массы тела каждого мыша |
| Prism | GraphPad | Версия 5.01 | Статистическое программное обеспечение для анализа |
| Ротаторный микротом | LEICA, Германия | RM2016 | Используется для приготовления разрезов сетчатки |
| Селисистат (EX-527) | MCE, US | HY-15452 | Ингибитор SIRT1 для исследований |
| Пентобарбитал натрия | Sigma-Aldrich, US | 1.93248 | Используется для анестезии для последующих исследований путем внутрибрюшного (IP) введения |
| SRT1720 | MCE, US | HY-10532 | Активатор SIRT1 для исследований |
| Сумианксин | Jilin Shengda Animal Pharmaceutical Co | N/A | Используется для анестезии для последующих исследований путем внутрибрюшного (IP) введения |
| Туникамицин (TUN) | MCE, US | HY-A0098 | Реагент для индуцирования ERS |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно