Описание случая абсцесса на лбу, вызванного нокардией конкавой у пациента со СПИДом

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол лечения инфекций нокардии у иммунокомпрометированных пациентов, который интегрирует гнойную культуру и MALDI-TOF MS. Этот комбинированный подход позволяет быстро и точно определить вид, способствует таргетной антимикробной терапии и, в конечном итоге, улучшает клинические результаты в этой группе пациентов с высоким риском.

Аннотация

Виды Nocardia являются облигатными аэробными актиномицетами. Нокардиоз человека обычно возникает у иммунокомпрометированных хозяев и чаще всего проявляется первичной гнойной инфекцией лёгких. Гематогенное распространение может привести к экстралегональному воздействию, при этом центральная нервная система является наиболее частым вторичным участком, за ней следуют кожа и подкожные мягкие ткани; перикард, лимфатические узлы и суставы поражаются лишь редко. 50-летний ВИЧ-положительный мужчина был госпитализирован с месячным анамнезом пузырей и экхимозами конечностей. Абсцесс на правом лбу, образовавшийся во время госпитализации, дал гной, который был идентифицирован как Nocardia concava с помощью масс-спектрометрии с помощью матрицной лазерной десорбции/ионизации с временем полёта (MALDI-TOF MS) и подтверждённого секвенированием гена 16S рРНК. Первоначальное лечение включало антиретровирусную терапию, системные глюкокортикоиды и внутривенный иммуноглобулин; Последующая таргетная антимикробная терапия линезолид плюс триметоприм-сульфаметоксазол, проведённая после микробиологического подтверждения, привела к клиническому улучшению и выделению. Насколько нам известно, это первый случай абсцессной инфекции лба, вызванной N. concava , у пациентов с приобретенным иммунодефицитом (СПИД). Заражение человеком, вызванное этим организмом, остаётся крайне редким. Кроме того, место заражения в данном случае не было часто поражённым лёгким или центральной нервной системой, обычно участвующей в нокардиозе, что приводило к атипичным клиническим проявлениям, склонным к пропущенным диагнозам или ошибочным диагнозам. В этом случае точная этиологическая идентификация позволила провести раннюю окончательную диагностику и обеспечить благоприятные клинические результаты. Этот случай подчёркивает важность повышенной бдительности при редких инфекциях нокардии у тяжело ослабленных пациентов. Для необъяснимых абсцессов кожи и мягких тканей крайне важно раннее этиологическое обследование, а таргетная антимикробная терапия на основе восприимчивости к лекарствам может значительно улучшить прогноз.

Введение

Виды Nocardia — это аэробные актиномицеты, широко распространённые в природной среде, обычно обитающие в почве и разлагающихся органических веществ. Хотя они широко распространены в природе, они обычно отсутствуют в человеческом организме и функционируют как оппортунистические патогены. Большинство инфекций возникают через^{ингаляцию 1}. Нокардиоз преимущественно поражает людей с ослабленным иммунитетом, особенно тех, у кого ослабленный клеточно-опосредованный иммунитет, таких как пациенты с злокачественными опухольными заболеваниями, сахарным диабетом, ВИЧ/СПИДом, аутоиммунными заболеваниями, реципиентами трансплантации твердых органов и лицами, проходящими длительное лечение кортикостероидами^. Тем не менее, инфекции могут возникать и у людей без явного иммунодефицита³. Нокардия в основном проникает через дыхательные пути, вызывая заболевания лёгких, а затем может распространяться гематогенно, вызывая внелегочное вовлечение органов. Наиболее частым местом распространения является мозг, за ним следуют кожа и подкожные мягкие ткани; реже это может затрагивать перикард, лимфатические узлы и суставы. Клинически нокардия может вызывать острое или хроническое, локализованное или распространённое гнойное гранулематозное воспаление, поражающее лёгкие, кожу и центральную^{нервную систему 4}.

На сегодняшний день инфекции человека, вызванные N. concava, редко регистрировались. Здесь мы представляем первый задокументированный случай абсцесса на лбу у ВИЧ-положительного пациента, приписываемого N. concava, предоставляя ценные сведения для диагностики и лечения нокардиоза.

Изложение случая:
В нашу больницу был госпитализирован 50-летний мужчина с месячной историей волдырей и пурпурических поражений на конечностях. Более десяти лет до этого ему поставили диагноз ВИЧ, но он не придерживался последовательной антиретровирусной терапии. Примерно за месяц до госпитализации у него развились оральные гематомы и пурпура конечности без идентифицированного триггера, и он сначала проходил лечение в местной больнице с помощью биктарви (биктегравир/эмтрицитабин/тенофовир алафенамид) для антиретровирусной терапии. На основании дальнейших исследований была заподозрена иммунная тромбоцитопения (ИТП), и он получил импульсную терапию метилпреднизолоном и внутривенным иммуноглобулином (IVIG), а также защиту желудка и кальциевые добавки.

Из-за постоянной тромбоцитопении пациент был направлен в наше учреждение для дальнейшего лечения. При госпитализации температура его тела составляла 37,9 °C; он был бодрым, ориентированным и в довольно хорошем общем состоянии. В коже и склерах не было обнаружено icterus. Широко распространённые петехии и экхимозы были отмечены по всему телу, а на правой лобной области присутствовала ощупываемая опухоль. Неконтрастная КТ грудной клетки выявила интерстициальные изменения в нижних долях с двусторонней стороны и парасептальную эмфизему в верхних. УЗИ брюшной полости не выявило значимых отклонений.

Лабораторные анализы, проведённые на следующий день, показали количество тромбоцитов × 10⁹/л (83–303 × 10⁹/л), уровень прокальцитонина 0,11 нг/мл (<0,50 нг/мл) и высокочувствительный C-реактивный белок (CRP) 1,11 мг/л (<6,00 мг/л). Абсолютное количество Т-лимфоцитов хелперов/индуктора (CD3+, CD4+) составляло 15 клеток/мкл (550–1440 клеток/мкл). Количественные полимеразные цепные реакции (ПЦР) обнаружили ДНК вируса Эпштейна-Барра (EBV) при 1,21 × 10⁴ МЕ/мл (0–200 МЕ/мл) и ДНК цитомегаловируса человека (HCMV) при 4,53 × 10⁵ МЕ/мл (0–200 МЕ/мл), оба положительные; Другие обычные анализы крови были беззаботными.

Учитывая подтверждённую виремию HCMV, пациенту начали комбинированную противовирусную терапию с ганцикловиром и фоскарнетом, при этом Биктарви продолжали для подавления ВИЧ. Импульсная доза метилпреднизолон и IVIG поддерживалась для ITP. Из-за постоянной низкой температуры ритуксимаб был назначен на 6-й день больницы, а вориконазол — на 7-й день в качестве профилактики ротоглоточный кандидоз.

При поступлении физический осмотр выявил образование над правой лобной областью (рисунок 1). На 6-й день больницы из этого поражения аспирировали гнойный материал для микробиологической оценки. Прямое окрашивание гноя по Граму показало обильные ветвляющиеся, нитиобразные грамположительные бациллы (рисунок 2). Часть образца была инокулирована на пластины Columbia blood agar и инкубирована при 35 °C в атмосфере, обогащённой CO₂ на 5–10%. После 24 часов инкубации наблюдались белые, приподнятые, сухие, морщинистые, зернистые негемолитические колонии. К пятому дню инкубации колонии приобрели бледно-жёлтую пигментацию (рисунок 3). Модифицированное кислотно-быстрое окрашивание изолята дало частично кислотно-быстрые и частично некислотно-быстрые организмы (рисунок 4).

MALDI-TOF MS с использованием системы Autobio MS2000 идентифицировал организм как N. concava (рисунок 5). Эта идентификация была впоследствии подтверждена секвенированием гена рРНК 16S, которое также классифицировало изолят как N. concava. Было проведено тестирование на антимикробную восприимчивость, результаты которого приведены в таблице 1. Результаты по восприимчивости, интерпретированные согласно рекомендациям CLSI M24 для видов Nocardia, показали восприимчивость ко всем протестируемым препаратам.

На 8-й день больницы, после лабораторного отчёта о большом наличии грамположительных бацилл, вориконазол был прекращён, а также начата комбинированная антимикробная терапия с линезолидом и триметоприм-сульфаметоксазолом. Температура тела пациента постепенно нормализовалась, и наблюдалось клиническое улучшение. На 18-й день больницы пациента выписали в улучшенном состоянии, с назначением на пероральный линезолид и метилпреднизолон для продолжения амбулаторного лечения.

Диагностика, оценка и планирование:
У пациента СПИД с низким абсолютным количеством CD4+ T-хелперов/индукторных клеток, что предрасполагает к оппортунистическим инфекциям. Обнаруживаемая ДНК CMV и EBV указывает на возможную репликацию активного цитомегаловируса и вируса Эпштейна-Барра. При физическом осмотре обнаружили абсцесс на правом лбу и рассеянные петехии/пурпуры. Гной, аспирированный из абсцесса на лбу, дал колонии, идентифицированные как N. concava по методу MALDI-TOF MS.

КТ грудной клетки показала двусторонние изменения в нижних долях интерстициальности; Для исключения нокардиоза лёгких или связанного с ВИЧ/ЦМВ интерстициального заболевания лёгких требуется последующее наблюдение. Абсцесс был разрезан и дренирован, тромбоцитопения контролировались, а пациент был выписан пероральным линезолидом плюс триметоприм-сульфаметоксазолом при нокардиозе.

Поствыписочный мониторинг включает еженедельные оценки крови крови и профили печени/почек для наблюдения за миелосупрессией и воспалительным синдромом восстановления иммунной системы; При появлении лихорадки, новых узлов, кровотечения или неврологических симптомов требуется немедленная повторная госпитализация.

Протокол

Протоколы исследования были утверждены Комитетом по медицинской этике Первой аффилированной больницы Медицинского колледжа Чжэцзянского университета. (Номер ссылки: IIT20240874A).

1. Оценка пациента и первичная оценка

1. Была собрана подробная медицинская история.
   1. За месяц до обращения у пациента появились волдыри и экхимозы конечностей без выявленных факторов, вызывающих осадку.
   2. Впоследствии пациент обратился за помощью в местную больницу, где был назначат Биктарви в качестве антиретровирусной терапии, а также введены тромбопоэтические препараты; тем не менее, гематологического улучшения не было достигнуто.
2. При физическом осмотре пациент находился в состоянии лёгкой температуры. По всей поверхности тела наблюдались разбросанные петехии и экхимозы, а в правой лобной области присутствовала хорошо очерченная маса.
3. Лабораторные исследования
   1. Полный анализ крови (переписка тромбоцитов): цельная кровь (3 мл) была собрана в трубку с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА), аккуратно перевернута 8–10 раз и проанализирована в течение 4 часов после флеботомии.
   2. Анализы белка и прокальцитонина в сыворотке (2–3 мл): кровь (2–3 мл) была втянута в сепараторную трубку сыворотки, свертылась в течение 20–30 минут, центрифугана при 1 500–2 000 × г в течение 10 минут и анализировалась в день сбора.
   3. Потоково-цитометрическая подгруппа лимфоцитов (CD3/4/8/16/19/45/56): Цельная кровь (3 мл) была собрана в ЭДТ-пробирку, аккуратно перевернута 8–10 раз для обеспечения достаточного антикоагулянта и анализирована в течение 24 часов после сбора.
   4. Количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) для ДНК вируса Эпштейна–Барра и цитомегаловируса: цельная кровь (3 мл) была забирана в ЭДТА-пробирку, аккуратно перевернута 8–10 раз, поддерживалась при температуре 2–8 °C и транспортировалась в течение 4 часов после сбора. Плазма отделялась центрифугированием в течение 2–4 часов после флеботомии и хранилась при температуре 4 °C в ожидании анализа.

2. Диагностические процедуры

1. Ультразвуковая аспирация абсцесса правого лба:
   1. После стандартной дезинфекции кожи и стерильного драпирования была введена местная инфильтрационная анестезия с 2% лидокаина. Под наблюдением ультразвукового наблюдения в реальном времени в абсцесс лба был введён шприц объемом 20 мл с прикреплённой иглой, а 4 мл гнойной жидкости аспирировали.
   2. Пациентка оставалась гемодинамически стабильной и не испытывала дискомфорта на протяжении всей процедуры. В послепроцедурный период немедленных осложнений не наблюдалось.
2. Гнойный аспират был отправлен в микробиологическую лабораторию для немедленного окрашивания Gram и последующего выселения в концентрации 5–10% CO₂ при 35 °C.
   1. Для окрашивания Gram сначала возьмите чистый стеклянный стекло, чтобы подготовить бактериальный мазок, затем нанесите его на пламя, затем нанесите кристаллический фиолетовый морилку для первичного окрашивания в течение 1 минуты, после чего промывайте водой.
   2. Затем добавьте йодный раствор в качестве морданта на 1 минуту и смойте водой. Затем обесцвечивайте 95% этанола примерно в течение 20–30 секунд, пока сток не станет бесцветным, и сразу же промывайте водой, чтобы остановить обесцвечивание.
   3. Наконец, окрашивайте раствором сафранина в течение 30–1 минуты, смойте водой, промокните насушку и наблюдайте под микроскопом.
3. Была выбрана петля колоний из пластины кровяного агара и подвергнута модифицированной кислотостойкой окрашиванию.
   1. Для модифицированного кислото-устойчивого окрашивания сначала возьмите чистый стеклянный стекло, чтобы подготовить бактериальный мазок, закрепите его на пламени, затем закройте мазок морилкой карбол-фуксина и нагрейте до поднятия пара без кипения, поддерживайте 3–5 минут, затем промывайте водой.
   2. Затем проведите слабую обесцвечивку водным раствором серной кислоты 1% в течение 30–1 минуты, пока мазок не станет светло-розовым, и прополосните водой.
   3. Наконец, нанесите контрокрашивание раствором метиленового синего в течение 30–1 минуты, промыйте водой, промокните насушку и наблюдайте под микроскопом.
4. Идентификация проводилась с помощью автоматизированной масс-спектрометрической микробной идентификации, и изолят был идентифицирован как N. concava.
   1. Подготовка образца
      1. Подготовка тарелки мишени: Одна чистая колония была собрана бамбуковой палкой и равномерно нанесена на цель мишени MALDI.
      2. Добавление муравьиной кислоты: После сушки мазка на воздухе в каждую цель для лизиса клеток добавляли по 1 мкл муравьиной кислоты.
      3. Добавление матрицы: После полной высыхания пятна немедленно наносили 1 мкл матричного раствора (α-циано-4-гидроксициннамовую кислоту, HCCA), и пластину снова дали высохнуть на воздухе.
   2. Включите питание и настройте программное обеспечение.
      1. Включите питание прибора, вакуумный насос и компьютер и дождитесь, пока вакуум не достигнет рабочего состояния. Запустите программное обеспечение рабочей станции и войдите в систему.
      2. Подтвердите нормальную связь между программным обеспечением и прибором, а также убедитесь, что вакуум, температура и состояние лазера в норме.
   3. Введите информацию в программное обеспечение.
      1. Входит модуль управления целевыми пластинами. Выберите тип целевой пластины, создайте новую партию и введите информацию о образце, включая идентификатор образца, тип, источник и примечания.
      2. Сохраните информацию о целевом номере и выберите соответствующую идентификационную базу данных для сравнения.
   4. Управляйте прибором и собирайте данные.
      1. Поместите засохшую мишенную пластину в приборную камеру и закройте дверцу камеры. Выберите «Запустить целевую пластину » в программном обеспечении и подтвердите идентификатор и её местоположение.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение автоматически завершает лазерное возбуждение, ионный полёт, получение сигналов и генерацию спектра. Доступен мониторинг хода приобретения и качества спектра в реальном времени.
   5. Анализ и идентификация данных
      1. Обработка спектра: программное обеспечение автоматически выполняет сглаживание, коррекцию базовой линии и экстракцию пиков на исходном спектре.
      2. Сравнение с базой данных: Обработанный пиковый спектр сравнивается со стандартной базой данных известных бактерий, встроенной в инструмент.
      3. Интерпретация результатов: Программное обеспечение предоставляет результаты идентификации и оценки на основе сходства сравнения. В целом, балл ≥ 9,0 указывает на достоверную идентификацию на уровне вида; Балл от 6,0 до 8,9 указывает на идентификацию на уровне рода; а балл ниже 6,0 считается ненадёжным.
      4. Отчётность и управление данными: Исходные спектры, результаты идентификации и логи сохраняются автоматически. Данные можно экспортировать, анализировать статистически и интегрировать с LIS.
   6. Процедура отключения
      1. После выполнения всех задач выходите из операционного интерфейса. Переходите в режим ожидания в программном обеспечении, ждите, пока прибор безопасно разгерметизируется, закройте программу и компьютер, и наконец отключите питание прибора и вакуумного насоса.
5. Тестирование на антимикробную чувствительность
   1. Собирайте колонии и измельчайте их шлифовальной стержней или стеклянными шариками в стерильной воде, чтобы получить однородную суспензию, отрегулированную до стандарта мутности Макфарланд 0,5; поскольку нокардия склонна образовывать комки, требуется тщательное шлифование для обеспечения равномерного подвески.
   2. Затем добавьте бактериальную суспензию в каждую яме микроразбавленной пластины, содержащей катионно-скорректированный бульон Мюллера-Хинтона (CAMHB), инокулятируйте 10 мкл на каждую скважину для получения конечного инокуля примерно 1 ×^{10 5}–5 × 10⁵ CFU/mL, одновременно создайте контрольную яму для роста без антибиотиков и отрицательную контрольную яму.
   3. Инкубировать микропластину при 35 ±± 2°C в окружающем воздухе в течение 3–5 дней, при этом крышка пластины оставалась герметичной во время инкубации, чтобы предотвратить высыхание.
   4. После инкубации наблюдайте рост бактерий в каждой яме невооружённым глазом и фиксируйте минимальную концентрацию препарата, полностью подавляющую рост, как минимальную тормозящую концентрацию (MIC).

3. Терапия антибиотиками

1. Сразу после поступления была начата комбинированная противовирусная и иммуносупрессивная терапия: были введены ганцикловир и фоскарнет вместе с продолжением Биктарви для подавления ВИЧ, а также импульсная терапия метилпреднизолоном и внутривенным иммуноглобулином.
2. День 6: Повторяющаяся лёгкая температура побудила добавить ритуксимаб в терапевтическую программу.
3. День 7: Для предотвращения возможной инвазивной грибковой инфекции был введён эмпирический вориконазол.
4. День 8: Микроскопия выявила большое количество грамположительных бацилл; Вориконазол был снят, и антимикробная терапия была немедленно заменена на линезолид плюс триметоприм-сульфаметоксазол. После этого последовала отложка, и клинический статус пациента постепенно улучшался. Он был выписан на 18-й день больницы в стабильном состоянии.

Результаты

50-летний ВИЧ-положительный мужчина проявил генерализованные петехии и экхимозу, а также пероральный герпес. После госпитализации он получил эмпирические противовирусные и тромбопоэтические терапии. Физический осмотр выявил образование на правом лбу. Была проведена ультразвуковая аспирация (рисунок 1) для получения гноя для лабораторного исследования. Результаты окрашивания по граммам показаны на рисунке 2, а результаты кислотостойкого окрашивания — на

Обсуждение

Nocardia — это аэробная, грамположительная бактерия, классифицируемая в тип Actinobacteria, класс Actinobacteridae, подкласс Actinobacteridae, отряд Actinomycetales, подотряд Corynebacterineae, семейство Nocardiaceae и род Nocardia¹⁵. Выявлено более 100 видов, наиболее распространёнными патогенами среди людей и животных являются N. asteroides, N. brasiliensis, N. farcinica и ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5– 10% CO<суб>2 инкубатор	Термо Фишер Сайентифик	20172416507
Кислотно-быстро окрашивающаяся окраска	Басо	20170094
Серия Autof MS	Autobio Diagnostics	https://en.autobio.com.cn/Product/productDetail/fid/63/cid/2/id/145.html
Autof MS2000	Autobio Diagnostics	20182400196
Муравьиная кислота	Autobio Diagnostics	20140009
Gram Stain	BioMé Rieux	20171067
&альфа;-циано-4-гидроксициннамовая кислота	Autobio Diagnostics	20140009