Методическая статья

Стандартизированная ex vivo модель оромукозного свинообразного образования для оценки потоков пептидов

378 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70935

⸱

9 июня 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1UCD School of Veterinary Medicine and UCD Conway Institute, University College Dublin, 2UCD School of Mechanical and Materials Engineering, University College Dublin

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает платформу скрининга, использующую только что выделенную слизистую эпителиальную ткань свинов для оценки проникновения пептидов. Метод интегрирует проникновение GLP-1RA в присутствии усилителя пермеации из растворов, камер Hilltop и пленок в диффузионных клетках Франца, а также 3D-печатных вставок, сопровождаемых гистологической оценкой слизисты.

Аннотация

Оромукозное введение препаратов в пленках, таблетках, леденцах и других дозировочных формах обеспечивает удобный системный способ введения для детей и пожилых пациентов, а также для тех, кто не может легко глотать капсулы или таблетки. Разработка буккальных и сублингвальных пептидных формул требует доклинических моделей, соответствующих некератинизированным оромукозным эпителиальным структурам человека, среди которых свиньи и собаки наиболее подходящи. Мы взяли свежие свинообразистые оромукозные ткани из скотобойни. Слизистые были рассечени с подлежащей гладкой мускулатуры с помощью контролируемого нагрева, а затем установлены либо в диффузионные клетки Франца, либо в новые малообъёмные 3D-печатные вставки, отверженные смолой. Комбинации усилителя пептид-проницаемость были добавлены на сторону донора, а проникшие молекулы были взяты с приёмной стороны и количественно измерены с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (uHPLC). Для вставок значения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) закреплённых слизистой были измерены с помощью электродов EVOM для палочек для еды. Тканевая гистология была изучена после инкубации как в диффузионных клетках Франца, так и в 3D-вставках. Оптимальная концентрация усилителя проницаемости выбиралась при увеличении проникновения водными смесями пептида и энхансера. Пептидная проникновение достигала 4,3% за 3 часа в трёхмерных (3D) вставках и 1,7% в моделях камеры Hilltop, при этом последние имитировали прямую экспозицию с буккальной плёнки. Слой за слоем были разработаны полимерные слизистые пленки, содержащие комбинации пептид-энхансеров, которые были нанесены на слизистую ткань для исследований проникновения с использованием диффузионных камер. Экс виво пептидная проницательность через слизистую слизистую свитью достигла 2% при воздействии оптимальной комбинации гликодоксихолата (GDC), включённой в буккальные пленки. Эти экс виво скрининговые исследования открывают путь к последующей фармакокинетической оценке препаратов с пептидным содержанием пленки, вводимых через оромукозный путь у свиней и людей.

Введение

Щечные и сублингвальные оромукозы являются привлекательными путями перорального введения лекарств, поскольку они обеспечивают прямой доступ к участкам и позволяют избежать первичного метаболизма печени, что потенциально повышает биодоступность и приемлемость пациента по сравнению с другими методами, включаяпероральный 1,2. Пептиды обычно вводят инъекцией, предпочитая пероральное введение из-за плохого проникновения через кишечный эпителий, из-за их высокой молекулярной массы, гидрофильности и восприимчивости к ферментативномуразложению 3. FDA одобрило 102 пептида для терапевтических применений, из которых ~450 терапевтических пептидов оцениваются в доклинических или клиническихиспытаниях 4. К ним относятся пероральные таблетки, сформулированные с усилителями проникновения (например, семаглутид, Rybelsus)5, а также оромукозные платформы (Minirin Melt и Nocdurna сублингвальный десмопрессин ацетат), разработанные с использованием технологии перорально разлагающейся таблетки Catalent Zydis (ODT)6. Несмотря на обширные исследования щечной проницаемости лекарств, показатели проницаемости молекул демонстрируют низкую воспроизводимость и ограниченную сопоставимость висследованиях 7,8. Эти несоответствия в основном связаны с вариациями в экспериментальных животных моделях и различиями в обращении и приготовлении изолированной слизистой щечнойслизистой 9.

Экс виво тесты проницаемости с использованием изолированных слизистой слизистой слизистой в организме является ценным инструментом для прогнозирования проницаемости малых молекул в организме in vivo и для доклинического скрининга компонентов формул, релевантных для лекарственныхформ 10,11,12; однако их использование в пептидном скрининге ограничено, поскольку базальная проницаемость незначительна. В последние годы свининая щёчная слизистая стала предпочтительным моделем, поскольку её некератинизированная структура и физиологические и биохимические характеристики очень похожи начеловеческие 13. Образцы щёчной клетки от собак ещё менее доступны по сравнению со свиной тканью из бойней, хотя оба источника не являютсякератинизированными 14. Сохраняется значительная вариабельность толщины эпителия и методов обработки. Стандартизация подготовки оромукозального и подязычного образования крайне важна. Переменные, такие как кратко- и долгосрочные условия хранения, толщина ткани и поддержание жизнеспособности во время экспериментов, влияют на результаты проницаемости экс виво 8. Сохранение тканей имеет решающее значение, поскольку как структурная целостность, так и метаболическая активность слизистой напрямую влияют на диффузионныепрофили 12,15. Потеря барьерной функции может привести к искусственно повышенной частоте проницаемостилекарств 16,17. Помимо хранения, метод вскрытия слизистой свиной щечной слизи для установки в камеры проникновения вносит дополнительную вариабельность. Различия в удалении подслизистой соединительной ткани, будь то механическими, химическими или тепловыми средствами, могут изменятьпроницаемость 18. Хотя некоторые отчёты предполагают, что тепловое разделение для изоляции эпителия от гладкой мускулатуры сохраняетпроницаемость 19, консенсуса нет. В настоящее время не существует универсально признанного метода вскрытия и оценки целостности изолированной слизистой щечнойслизистой 20. Маркированный гидрофильный сахар изотиоцианат-декстран (FITC декстран 4000, FD-4) обычно используется как маркер целостности слизистой свёрной щечной слизи, поскольку только малые молекулы менее ~500 Da могут пассивно проникать в ткань. В отличие от этого, целая слизистая ограничивает транспорт FD-4, и перенос с донора на приемник ниже 0,6% обычно считается приемлемым в течение 2-4 часа 21,22. Кроме того, окрашивание тканей гематоксилином и эозином обеспечивает простую оценку морфологииэпителия 23.

В этой работе мы разработали стандартизированный протокол обработки слизистой оболочки изолированной священной свисток, предназначенный для оптимизации целостности и проницаемости слизистой в течение определённого периода. Наши цели заключались в создании экспериментальной основы для вскрытия эпителиальной ткани свиной свьючной свистоки и повышении надёжности экс-виво оценки проницаемости пептидов в оромукозах, установленных в диффузионных камерах и вставках. Сначала мы провели визуальный анализ, чтобы определить безповрежденную слизистую слизистую слизистую из бойни. Мы оптимизировали методы обработки тканей, толщину слизистой и методы поддержания целостности тканей во время экспериментов. Используя стабильный низкоэффективный аналог рецептора пептида-1 (GLP-1 RA) в качестве инструментальной молекулы, мы провели исследования пептидной проницательности при наличии и отсутствии усилителя проникновения желчной соли — натрия гликодоксихолата (GDC) — на слизистой бучной слизи, установленной в диффузионных клетках Франца, и индивидуальных самодельных 3D-печатных вставках типа transwell. GDC и GLP-1 RA были представлены для слизистой оболочки из растворов, камер Hilltop и полимерных двухслойных пленок с слизисто-клеем. Мы использовали показатели проницаемости, тканевую гистологию и трансэпителиальное/эндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) в качестве основных конечных точек оценки.

Протокол

Свиные щёки, использованные в этом исследовании, были собраны на местной бойне; поэтому этическое одобрение не требовалось.

1. Выделение, подготовка и хранение свиного щечного эпителия

  1. Собрать ткани щёк свиней из местной бойни и транспортировать их в лабораторию в течение 90 минут в ледяной фосфатной буферной физиологической растворе (PBS, pH 7.4). В течение следующих 60 минут подготовьте ткани по ранее описаннойметодологии 19,24, с незначительными изменениями для различных участков оромукоз, как показано на рисунке 1.
  2. С помощью скальпеля отдельте слизистую слизистую от подстилающей ткани и трижды промывайте ткань с помощью фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Убрать слизистые с повреждением визуальной поверхности.
  3. Погрузите целую слизистое в PBS при 65 °C на 3 минуты и отдельте эпителий и оставшуюся соединительную ткань от гладкой мышцы с помощью пинцета часовщика размера 5. Этот метод также применим для выделения слизистой под языка и эпителиального образования.
  4. Аккуратно высушите расчленённые оромукозы на целлюлозной фильтровой бумаге и проведите исследования пермеации (предпочтительный вариант) или заморозьте максимум 4 недели.
  5. Для процесса заморозки после отделения погрузите оромомукозу на 2 часа в криопротектор 85%глицерина 25, с аккуратным встряхиванием. Высоковязкий глицерин заменяет межклеточную воду, чтобы предотвратить образование кристаллов воды, которые могут повредить структуру тканей.
  6. После этого периода заменяйте глицерин на свежий PBS и 10% глицерила. Заморозьте слизистые образцы при -20 °C или -70 °C, в зависимости от необходимого времени хранения. Проведите процедуру заморозки с контролируемой скоростью ~-1 °C·min-1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводятся с использованием как минимум трёх образцов тканей с щёк разных животных.

2. Экс виво исследование проникновения в слизистой слизи, установленное в диффузионных клетках Франца, и использование камер Hilltop для представления GLP-1 RA и GDC

ПРИМЕЧАНИЕ: Исследования проницаемости ex vivo проводятся изначально на свежей изолированной слизистой свитки с использованием диффузионных клеток Франца (FDC).

  1. Размещуйте расчленённую слизистую ткань в камеры (окна 1,2 см2), показанные на рисунке 2 , и уравновесьте 30 минут с PBS, pH 6,8 (со стороны донора, объём 1 мл) и PBS, pH 7,4 (со стороны приемника, объём 10 мл).
  2. После 30 минут равновесия замените донорский раствор PBS (pH 6,8) на 1 мл PBS с соотношением 1:1 GLP-1RA (25 мг/мл) и GDC (25 мг/мл).
  3. Продолжайте перемешивать камеру ствольной коробки с 10 мл pH PBS 7.4, поддерживайте при 37 °C при 300 об/мин. Отбирайте 1 мл из приёмного отсека каждые 60 минут в течение 180 минут. Возьмите тройные образцы из донорских отсеков в начале и в конце эксперимента. После каждого отбора пробы пополняйте камеры 1 мл PBS.
  4. В конце эксперимента храните ткань в 10% формалине для гистологии или гомогенизуйте для количественной оценки оставшегося в ткани пептида GLP-1RA.
  5. Аналогично, выполните проницаемость GLP-1RA с помощью камер Hilltop (HTC).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель использования HTC — подтвердить эффект GDC на GLP-1 RA в растворе на оромукозную проницательность, прежде чем формировать двухслойную буккальную пленку. HTC — это камера, построенная из Kraton G-2705, биосовместимого блок-сополимера стирол-этилен-бутилен-стирол (SEBS), с внешним диаметром 19 мм, содержащей прокладку Webril (диаметром 12,7 мм), состоящую из 100% нетканых хлопковых волокон, которая служит абсорбирающим антипригарным материалом для нанесенияраствора 26.
  6. Аналогично, оцените ex vivo проницаемость GLP-1RA и GDC (соотношение 1:1), загруженных в слизистые двуслойные пленки, помещая пленки в донорские камеры FDC или в 3D-вставки, как описано для HTC.
  7. Для подтверждения целостности свиной буккальной эпителиальной ткани используйте FD-4 (0,05 мМ) в качестве флуоресцентного флюкс-маркера и добавляйте его на сторону донора для оценки протечки через ткань.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани с утечкой исключаются из расчёта проницаемости.
  8. После трёхчасового эксперимента количественно оцените накопленный поток GLP-1 RA с помощью анализа uHPLC образцов 200 мкл, взятых из базолатерального компартмента в тройном виде. Повторите все эксперименты с проницательностью три раза. Количественно определить накопленный поток GLP-1RA по калибровочной кривой, сгенерированной из заданных концентраций GLP-1RA.

3. Подготовка буккальных пленок, зафиксированных с помощью GLP-1RA и GDC

ПРИМЕЧАНИЕ: Буккальные двухслойные пленки с слизисто-клеем и подложкой изготавливаются с использованием растворительного литья с полуавтоматическимпокрытием 27.

  1. Подготовьте двухслойную плёнку для захвата GLP-1RA с использованием HPMC и PVP-K90 в качестве полимеров для формирования пленки, а также слизисто-адгезивного компонента Na-CMC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу 1 для состава слизистого и подкладного слоя буккальной плёнки. GDC интегрирован с пептидом GLP-1 RA в модельные пленки в низких количествах мг, чтобы увидеть его влияние на проникновение пептида через слизистую слизистую свитью в камерах.
  2. Подготовьте слизистый слой, растворив полимеры, формирующие пленку, 45 мг HPMC, 10 мг Na-CMC и 25 мг PVP-K90 в деионизированной воде с 3% глицерина при 400 об/мин в течение 10 минут с помощью магнитной горячей плитки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: HPMC растворим при комнатной температуре, тогда как PVP-K90 требует нагрева при 40 °C в течение 30 минут для растворения.
  3. Добавьте 2 мг Aerosil 200 F при перемешивании, затем добавляйте GLP-1 RA. Затем добавьте GDC и распределите его на 600 об/мин в течение 30 минут.
  4. Ультразвуковой анализ готового полимерного раствора в течение 90 минут с помощью ультразвуковой ванны для удаления пузырьков.
  5. Отливайте пленки на подкладку полиэтилентерефталата (ПЭТ) и покрывайте докторским лезвием, установленным на 2600 мкм при скорости 2 мм/с. Сушите пленки в духовке с горячим воздухом при 40 °C в течение ~1 часа.
  6. Для подкладного слоя растворите 5% этилцеллюлозы (EC) и 5% пропиленглицерина (PG) в гидроалкогольной воде (этанол:вода), затем растворённую суспензию нанесите на ПЭТ-вкладыш. Наконец, нарежьте высушенные плёнки на квадраты размером 1 см × 1 см, упакуйте в алюминиевые саше и храните при температуре 4 °C.

4. Печать индивидуальной 3D-вставки, имитирующей трансвелл

ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-печатные кастомные вставки изготавливаются по ранее описанному методу с незначительнымиизменениями 28.

  1. Кратко, спроектируйте 3D-модель с помощью программного обеспечения с автоматизированным проектированием (CAD).
  2. Сохраняйте размеры 3D-вставки такими же, как у основного цилиндрического корпуса (донорской камеры), с максимальной площадью поверхности 1659,06мм 2 мм и общими внешними размерами 25,20 мм по оси x, 14,50 мм по оси y и 21,63 мм по оси z.
  3. Кроме того, спроектировать съёмное круглое кольцо для поддержки эпителиальной ткани. Внешний диаметр кольца составляет примерно 19,90 мм, а внутренний — 17,93 мм, что соответствует размерам основного цилиндрического корпуса, и может помещаться в пластины с 12 лунками Трансвелла (см. рисунок 3).
  4. Изготавливайте все компоненты с помощью настольного стереолитографии (SLA) 3D-принтера с ультрафиолет-отверждаемой прозрачной смолой. Все размеры приблизительные и могут быть скорректированы по мере необходимости для обеспечения правильной посадки трансвеллов и экспериментальной совместимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения удаления нереагируемых мономеров и потенциальных вымываемых веществ все детали прошли стандартизированный протокол постобработки, включая 10-минутную промывку в чистом изопропиловом спирте 99% (IPA), а затем ультрафиолетовое отверждение в соответствии с требованиями производителя, то есть 1 минута при окружающей температуре в Form Cure 2. Файл стереолитографии (STL) для проектирования 3D-моделей можно найти в https://doi.org/10.5281/zenodo.19368577 или дополнительных файлах (Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2).

5. Проникновение через слизистую слизу, установленное в 3D-вставках

ПРИМЕЧАНИЕ: Ex vivo проницаемость GLP-1RA и GDC, включённых в слизистые двухслойные буккальные пленки, также может быть оценена с помощью малообъёмных, специально разработанных 3D-вставок, имитирующих Transwell (Рисунок 2) в качестве альтернативы FDC. Это связано с тем, что приёмная сторона FDC объемом 10 мл разбавляет пептид, что затрудняет чувствительность к обнаружению uHPLC. Поэтому конструкция FDC не является экономически выгодной или практичной для пептидных потоков, поскольку требует постоянного обнаружения с помощью ферментно-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA) или радиоиммунного анализа (RIA).

  1. Изготавливайте/печатайте вставки в ультрафиолет-отверждаемой смоле с помощью настольного SLA 3D-принтера28 и монтируете их в 12-луночные тканевые культивные пластины.
  2. Разместить слизистую слизистую свисток свинины на окне 1,4см² между апикальной и базолатеральной камерами, измерить базовое трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) с помощью вольтомметра EVOM 2 с электродами STX2, размещёнными на стороне донора и приёмника вставок. TEER рассчитывается по закону Ома.
  3. После размещения плёнки (1,0 × 1,0см 2) на верхнюю часть ткани пипетка введёт 0,5 мл PBS (pH 6,8) в апикальную камеру и 1,5 мл PBS (pH 7,4) в базолатеральную камеру.
  4. Собирайте образцы (0,2 мл) со сторон приёмника с интервалом в 1 час в течение 3 часов и заменяйте на равные объёмы свежего буфера.
  5. Количественно оценить флюсируемый GLP-1 RA пептид с помощью uHPLC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Адсорбция GLP-1RA с помощью 3D-вставок не наблюдается после 3 часов, как показано на дополнительном рисунке 1 и дополнительном файле 3.
  6. Измерьте трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) с помощью вольтомметра EVOM 2 с электродами STX2 с интервалом в 1 час в течение 3 час. TEER рассчитывается по закону Ома.
  7. Для подтверждения целостности свиной букальнай и подязычной эпителиальной ткани используйте FD-4 (0,05 мМ) в качестве флуоресцентного маркера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводятся в трёх экземплярах, а результаты представляют собой среднее ± SD для трёх наборов данных.

6. обнаружение GLP-1 RA с помощью uHPLC

  1. Количественно определить количество GLP-1 RA, проникающего в оромукозу, установленные в FDC и вставках, из донорских растворов, HTC и пленок с помощью uHPLC с использованием колонки CSH C18 (130 Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 50 мм) с подвижной фазой 0,1% TFA в ацетонитриле (элюэнт A) и 0,1% TFA в воде (элуент B), градиентное элюирование в течение 8 минут при 30 °C, при объёме инжекции 20 мкл и расходе 0,7 мл/мин, а также обнаружение ультрафиолета на 214 нм (время удержания: ~4,2 мин).
  2. Проведите исследование линейности.
    1. Разработать исследование линейности для оценки аналитической реакции оптимизированных условий uHPLC с использованием калибровочных стандартов GLP-1 в диапазоне 2,5–20,0 мкг·мл⁻1.
    2. Подготовьте калибровочные стандарты (n = 6–8 уровней) отдельно и вводите образцы в тройном экземпляре. Выполнить линейную регрессию по наименьшим квадратам по отношению пиковой площади (mAU) к номинальной концентрации и оценить линейность с использованием коэффициента определения (r 2), % y-пересечения и распределения остатков (наблюдаемо–предсказанное отклик).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуальный анализ калибровочного графика и графика остатков показал незначительное отклонение от линейности на самом низком уровне чувствительности (2,5 мкг·мЛ⁻1), с остатками в пределах заранее установленного предела приема (±3%). Калибровочный диапазон затем ограничен диапазоном 2,5–20,0 мкг·мл⁻1, при котором регрессия показала приемлемую линейность (r2 ≥ 0,999, % y-перехват < 2%, а все остатки в пределах ±3%).

7. Оценка GLP-1RA, задерживаемого в щечной ткани

  1. Удалить слизистую слизистую слизистую слизь GLP-1 RA и GDC из FDC/вкладок.
  2. Промывайте ткань трижды с помощью PBS, чтобы удалить адсорбированные препараты и плёнки.
  3. Затем гомогенизировать ткань в 5 мл PBS с помощью настольного гомогенизатора до полной фрагментации.
  4. Храните образец на ночь при 4 °C для уравновесения распределения пептидов между гомогенизированной тканью и PBS.
  5. Затем центрифугуйте смесь при 5000 × г в течение 5 минут, чтобы осаждать фрагменты и собрать супернатант для количественного анализа.
  6. Стерилизуйте супернатант с помощью центрифугных фильтров 0,22 мкм для удаления остаточных частиц перед анализом uHPLC.

8. Гистология оромукозальной ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: После 3 часов проникновения GLP-1 RA из смесей, HTC или пленок слизистая обрабатывается для оценки повреждений.

  1. Зафиксируйте ткани в 10% формалина в течение 48 часов, а затем внедрите фиксированные ткани в парафин.
  2. Разрезать ткани размером 5 мкм с помощью микротома.
  3. Затем окрашивайте ткани гематоксилином и эозином (HE) для изучения гистологической целостности с помощью световой микроскопии при увеличении 4×.
  4. Слайды снимаются вертикальным микроскопом и анализируются с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий рабочий процесс изложен на рисунке 4.

Результаты

Выделение и рассечение свино-букальных эпителиальных тканей
Свитая слизистая слизистая слизистая широко используется как суррогатная ткань для оромукозных у человека, поскольку они обладают схожими анатомическими особенностями и физиологическими барьернымисвойствами 29. Эпителиальные ткани свиной бука изолируют как хирургическими, так и нагревающими методами, как показано на рисунке 4. Изначально скальпель используется для удаления мышц и более глубоких соединительных тканей с щёк. Изолированные участки ткани с комбинированными и целыми слизистыми слоями и соединительной тканью затем помещаются в тёплую PBS, нагреваемую до 65 °C в течение 3 минут. Ткань удаляется из буфера, а эпителий и подлежащая пластинка проприа отслаиваются щипцами размером 5. Нагрев позволяет получить равномерную, равномерную толщину в полученном расчленённом эпителии.

Экс виво проникновение GLP-1RA через свино-щечные оромукозы, установленные в FDC и 3D-печатных вставках
Экс виво пермеация GLP-1RA оценивалась с использованием слизистой слизистой свиной буккальной эпителиальной ткани, установленной в FDC и вставках. Для оценки оптимального соотношения концентрации GLP-1 RA: GDC на донорскую сторону слизистой слизи, установленные в FDC, были прикреплены HTC с ватными подушками площадью 12,7 мм, а смесь пептида с усилителем была пипетирована на ватный диск. Кумулятивная проникновение GLP-1 RA достигала примерно 4,3% за 3 часа при включении GDC в соотношении 1:1 (GLP-1RA 25 мг; GDC 25 мг). В отличие от этого, при отсутствии GDC не было обнаружено обнаруживаемого потока GLP-1RA27. Параметры количественной проницаемости, включаяприложение P, рассчитываются по следующей формуле:

P app =figure-results-1

Где:
P-приложение: кажущийся коэффициент проницаемости (см/с).
dQ/dt: скорость транспортировки GLP-1RA в устойчивом состоянии, рассчитанная как количество транспортируемого пептида за единицу времени (мкг/с).
A: площадь 3D-вставки (см 2).
Co: начальная концентрация пептида в донорском (апикальном) компартменте (мкг/мл).

Кажущийся коэффициент проницаемости (P app) GLP-1RA через слизистую свринку показан на дополнительном рисунке 2. Когда соотношение GLP-1RA:GDC было 1:1, те же концентрации, что и для HTC, включались в двухслойные пленки; однако проникение GLP-1RA через изолированные свино-буккальные ткани не поддалось количественному измерению с помощью традиционной системы FDC, поскольку проявление GLP-1RA из пленок в слизистые происходит медленнее, чем в растворённых смесях или HTC. Чтобы преодолеть это ограничение, были разработаны индивидуальные 3D-печатные вставки низкого объёма, чтобы уменьшить объём приёмника до 1,5 мл, тем самым повышая чувствительность к обнаружению. С помощью 3D-вставок накопленное проникновение GLP-1RA из буккальных пленок в течение 3 часов было измеримо и достигло примерно 1,8 %, как показано на рисунке 5. Для оценки целостности эпителиального барьера и параклеточной проницаемости использовались значения TEER и потоки FD-4. В группах лечения наблюдалось временно-зависимое снижение TEER (дополнительный рисунок 3) и соответствовало увеличению проницаемости GLP-1RA. PBS и ткани, обработанные пустой пленкой, не выявили изменений в TEER, что свидетельствует о том, что матрица двухслойной плёнки не нарушила барьер. Эти данные указывают, что GDC является основным фактором эффекта усиливания проницаемости.

Гистологическая оценка свиной ткани
Гистологическая оценка слизистой слизистой ex vivo свиной свьючной слизистой была проведена для оценки влияния методов изоляции тканей и для изучения целостности эпителия после трёхчасового воздействия GLP-1RA и GDC. Как показано на рисунке 6, свежеизолированные ткани, полученные методом нагрева, сохраняли нормальную физиологическую архитектуру эпителия, с целыми слоистыми слоями и непрерывной поверхностной слизи, и не имели признаков структурного повреждения. В отличие от этого, ткани, изолированные механическим разделением или подвергшиеся хранению/замораживанию, демонстрировали незначительные изменения в морфологии эпителиальных клеток и уменьшение толщины поверхностной слизи. Щечная слизистая, подвергшаяся воздействию 25 мг GLP-1RA в присутствии 25 мг GDC, сохраняла целостность эпителия и очень напоминала необработанные контрольные виды. Наблюдались лишь лёгкие отёки и поверхностная эпителиальная эрозия. Воздействие GLP-1RA отдельно или на заготовку и GLP-1RA: двусторонние пленки с нагрузкой GDC не вызывали видимого повреждения тканей, а гистологические особенности были сопоставимы с теми, что были у контрольных тканей, обработанных PBS.

figure-results-2
Рисунок 1: Свиная полость рта, демонстрирующая щечные и подязычные слизистые области. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой картины.

figure-results-3
Рисунок 2: FDC и компоненты. Шесть камер установлены в интегрированной системе (слева). Показан персонаж — Франц Кельс (в центре). Система крепления щётной ткани в отдельной камере (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 3: Компоненты 3D-печатных смоляных вставок размером 1см 2 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 4: Рабочий процесс для выделения, монтажа, проникновения и гистологической характеристики свиного букального эпителия. Создано в BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 5: Совокупное количество GLP-1 RA. Накопленное количество GLP-1 RA ex vivo проникало на сторону приёмника в слизистую свистую своё своё утро после 180 минут нанесения 25 мг/мл GLP-1RA (красный), 25 мг/мл GLP-1RA: 25 мг/мл раствора GDC (чёрный) и 25 мг/мл GLP-1RA: 25 мг/мл GDC, загруженного в пленки (фиолетовый), нанесённых через HTC, FDC и 3D-вставки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-7
Рисунок 6: Микроскопические изображения слизистой слизистой свиной щечной эпителиальной слизистой при различных условиях воздействия. (A) Пустая плёнка, (B) водная смесь GLP-1RA: GDC, (C) пленки, заключённые с GLP-1RA:GDC, (D) слизистая, выделенная из свежей ткани после термической обработки (65 °C), (E) буккальный эпителий, выделенный из замороженной ткани после термической обработки, (F) слизистая, выделенная механическим методом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Состав мукоадгезивного слоя
КомпонентыКонцентрация (мг)
GLP-1RA12,5 мг
GDC12,5 мг
HPMC45 мг
Na-CMC10 мг
PVP-K9025 мг
Глицерин3 мг
Aerosil 200F2 мг
Слой подкладки
Этилцеллюлоза5 мг
Пропиленгликоль5 мг

Таблица 1: Состав слизистого клея и подкладных слоёв щёчной плёнки.

Дополнительный рисунок 1: Адсорбция GLP-1RA после инкубации 0,5 мг GLP-1RA в течение 6 часов с помощью 3D-вставок. Данные имеют среднее значение ± SD трёх экспериментов (n = 3).Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Кажущийся коэффициент проницаемости (Papp) GLP-1RA после 3-часового воздействия священной слизистой ткани свиного щека, установленного в 3D-вставках. 25 мг/мл раствора GLP (красный), 25 мг/мл GLP + 25 мг/мл водного раствора GDC (чёрный) и 25 мг/мл GLP + 25 мг/мл GDC, включённого в щёчные пленки (фиолетовый). Представленные данные имеют среднее ± SD (n = 3). Наблюдалась статистическая значимость между группами: p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Трансэпителиальное сопротивление (TEER). Постепенное снижение трансэпителиальной резистентности (TEER) из изолированной свино-буккальной эпителиальной ткани, закреплённой в 3D-вставках, после воздействия 25 мг/мл GLP-1 + 25 мг/мл раствора GDC (красный), 25 мг/мл GLP-1 + 25 мг/мл GDC в буккальных пленках (зелёный) и 25 мг/мл GLP-1RA в PBS (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Целостность тканей и утечка. Целостность тканей и утечка оценивались путём экспонирования священных эпителиальных тканей свинины в 3D-вставках до 0,05 мМ FD4 со стороны донора. Образцы брались с фиксированным интервалом по 60 минут в течение 6 часов. Среднее +SD для трёх экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: transwell-Oring-v7 (JOVE).stl.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: transwell-v9 (JOVE).stl.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3: Дополнительные экспериментальные детали.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Данная методология описывает экспериментальные протоколы выделения свиной букальнай и других оромукозных эпителий, а также анализы проницаемости для пептидных терапевтических средств с использованием низкопотенционного стабильного аналога GLP-1RA в качествепримера 30. Пептиды — это гидрофильные макромолекулы с незначительной проницаемостью через слизистыемембраны 17. Успешное выполнение вышеуказанного протокола зависит от точной изоляции и установки щечной и подъязычной слизистой оболочки. Изоляция требует специальных навыков и строгого контроля температуры; Даже незначительные тепловые колебания в процессе нагрева могут вызвать вредные физиологические и морфологические изменения в эпителиальной ткани, что в конечном итоге нарушает целостность данных о проницательности. Кроме того, фиксация изолированной ткани внутри специально напечатанных 3D-вставок является критически важным этапом. Учитывая хрупкий характер эпителиальных слоёв, существует повышенный риск разрыва или протечки ткани во время монтажа. Для снижения этой проблемы мы применили тест на утечку FD4, который служит мерой контроля качества для обеспечения целостности мембраны перед началом исследований потока. Утечка FD4 изначально оценивалась визуально, а затем количественно измерялась с помощью ультрафиолетовой спектроскопии. Соответствующие данные приведены в дополнительных данных (Дополнительный рисунок 4 и Дополнительный файл 3).

Традиционный FDC, считающийся стандартом для ex vivo исследований, часто представляет сложности при количественной оценке пептидной терапии из-за больших объёмов в приемной камере, обычно 10 мл. Высокий объём приводит к чрезмерному разбавлению образца, что снижает концентрации проникших пептидов ниже нижнего LOD для стандартных аналитических методов. Чтобы этого избежать, мы разработали новый 3D-печатный вставкой, имитирующий масштаб и объёмы системы трансвеллов, используемых для монослоев эпителиальных клеток, включаяCaco-2 31. Вставки могут быть размещены непосредственно в стандартных 12-колодцевых пластинах для культуры тканей и надёжно вмещают изолированные слизистые сволочные священные пукальные эпителии. Эта модификация значительно уменьшает объём донорского отсека почти в 7 раз до 1,5 мл, что позволяет сосредоточиться на анализе и преодолеть ограничения чувствительности uHPLC. Эта адаптация особенно важна для количественной оценки дорогих препаратов с низкой проницаемостью пептидов.

Увеличение проникновения GLP-1 RA в присутствии GDC было зафиксировано при использовании 3D-вставной системы. Совокупное проникновение GLP-1RA достигло ~55,3 мкг через 3 часа, что соответствует ~4,3 % от первоначально применённой концентрации на стороне донора. В отличие от этого, измеримый поток РА GLP-1 не был обнаружен, когда аналогичные концентрации GLP-1RA и GDC, захваченные в буккальных пленках, были применены к щечной слизи, установленной в FDC, что свидетельствует о том, что пептидная проникновение могло происходить, но оставалось аналитически необнаруживаемым из-за чрезмерного разбавления большого объема приемника. Однако кумулятивная проникновение GLP-1 RA из состава двуслойной буккальной плёнки достигла примерно 1,8 % за 3 часа в 3D-вставках в течение 3 час, что демонстрирует возможность обнаружения низкоуровневого транспорта пептидов через щечную ткань из дозировочных форм с помощью миниатюрной ресиверной системы. Экс-виво проникновение GLP-1 RA также оценивалось с помощью HTC, содержащих ватный диск, загруженный пептидом и GDC. Это очень полезное средство для первоначального скрининга, чтобы доказать концепцию, что возможно представление пептида из пленок с помощью усилителя проницаемости. Целостность барьера свино-буккального эпителия можно контролировать во время эксперимента с помощью утечки TEER и FD-4. Медленное, зависящее от времени снижение TEER наблюдалось во время воздействия агониста рецепторов GLP-1 (GLP-1 RA), что соответствует увеличению парацеллюлярного транспорта, вызванному желчнойсолью 32 в слизистой щечной слизи.

Ограничением этой техники является зависимость от свежей свиной ткани, которая не всегда доступна по запросу на бойнях, а качество тканей может варьироваться. Чтобы устранить ограничения по получению свежей ткани на разумном расстоянии от лаборатории, мы оценили криопротективу для хранения высококачественных образцов, которые можно будет использовать позже. Хотя использование свежих тканей оптимально, использование изолированных слизистых тканей требует тщательного применения криопротекторов и скорости замораживания для предотвращения образования кристаллов льда и последующего повреждения барьера. Протокол способен преодолевать разрыв между стандартными макромасштабными исследованиями проницаемости и анализом пептидов с высокой чувствительностью. Оптимизируя как процесс изоляции тканей, так и протокол прохождения с помощью 3D-вставок, мы достигли более высокой степени воспроизводимости и чувствительности, чем обычно сообщается с FDC. Кроме того, использование 3D-вставок предоставляет исследователям основу для установления пределов обнаружения дорогих пептидных молекул, что представляет собой значительное улучшение гибкости и пропускной способности экс-виво слизистых исследований.

Эти протоколы служат основой для надёжного измерения проницаемости слизистой ткани с использованием классов лекарств, выходящих за рамки пептидов. Возможность создавать высокоразрешающие профили проницаемости на основе ex vivo моделей поможет прогнозировать доклинические данные абсорбции, полученные на основе животных моделей. Экс-виво проницаемость GLP-1 RA также оценивалась с использованием HTC, содержащих ватный диск, загруженный пептидом, и GDC — раствор усилителя пермеации. Такой подход обеспечивал тесный, воспроизводимый контакт между смесью и слизистой поверхностью. Значительное увеличение проникновения GLP-1RA наблюдалось при соотношении 1:1 GDC в 3D-вставках, имитирующих трансвеллы. Это очень полезное устройство для скрининга, подтверждающее, что презентация пептида из пленок с усилителем проникновения может быть возможна в конструкции, адаптированной из культивированных монослоёв эпителиальных клеток в слизистую ткань. Целостность барьера свино-буккального эпителия можно контролировать во время эксперимента с помощью измерения TEER и утечки FD4.

В целом, экс виво пермеация и гистологические оценки показывают, что надёжная оценка буккального и сублингвального транспорта пептидов в присутствии усилителя пермеации зависит от подготовки тканей, протоколов потока и аналитической чувствительности. Среди изученных методов изоляции разделение свежеполученного свиного щечного и подязычного эпителия с помощью теплового метода обеспечило хороший баланс между поддержанием целостности эпителия и воспроизводимостью рассечения тканей, что подтверждается стабильным исходным TEER, минимальной утечкой FD4 и сохранением структуры тканевых клеток. Важно, что 3D-печатная вставка значительно повысила надежность экспериментов, снизив разбавление приёмного отсека, что позволило количественно оценивать низкие потоки пептидов, которые не были обнаружены в FDC. В совокупности эти результаты подтверждают использование изолированной слизистой свитого букального эпителия в камере вставки тканей в качестве ex vivo платформы для оценки щечного введения терапевтических пептидов для системной доставки.

Раскрытие информации

Авторы не имеют финансовых обязательств или конфликтов интересов, которые могли бы раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Бена Шовлина (Ветеринарная школа UCD) за техническую помощь. Мы также благодарим доктора Ханса Экхардта (Школа химии UCD) за поддержку в анализе uHPLC. Этот проект получил финансирование от исследовательской и инновационной программы Европейского союза Horizon Europe в рамках гранта номер 101071054. Мы также признаем дополнительную финансовую поддержку от гранта No 13/RC/2073_P2, Research Ireland CURAM Center for Medical Devices и Европейского фонда развития. Авторы выражают благодарность Кеннету Макнамаре из Rosderra Irish Meats за предоставление свиных щёк.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Компьютер / НоутбукОбщийЛюбая стандартная система≥8 ГБ оперативной памяти рекомендуется
Скрипт сбора данныхПользовательскийcollect.pyСкрипт сбора данных на основе Python
Одноразовые гелевые электродыОбщийПредварительно желируемые электроды Ag/AgClДля однократного использования, с липкой основой
Модуль регистрации ЭЭГUpside Down LabsBioAmp EXG PillАналоговый фронт-энд для сигналов биопотенциалов
Электродный гель (если используются повторно используемые электроды)ОбщийПроводящий гельУлучшает проводимость сигнала
Интерактивное приложение (игра)ОбщийЛюбая простая игра (например, гонки)Интерфейс управления клавиатурой
ПеремычкиОбщийСоединители Male–FemaleСтандартные провода для настольной панельной монтажной схемы
Matplotlib / SeabornОткрытое программное обеспечениеПоследние версииБиблиотеки визуализации
Плата микроконтроллераArduinoUno / Maker Uno10-битный АЦП, интерфейс USB
Программная среда PythonPython Software FoundationPython ≥3.8Язык программирования с открытым исходным кодом
Библиотека PyTorchMeta AIВерсия ≥1.12Фреймворк для глубокого обучения
Scikit-learnОткрытое программное обеспечениеПоследняя стабильная версияУтилиты машинного обучения
Библиотеки обработки сигналовSciPyПоследняя версияФильтрация, ДПФ
USB-кабельОбщийUSB Type-A на BКабель для передачи данных

Ссылки

  1. Karki, S., et al. Oromucosal films for peptide delivery: formulation strategies using permeation enhancers and polymers. Drug Deliv Transl Res. , (2025).
  2. Karavasili, C., Eleftheriadis, G. K., Gioumouxouzis, C., Andriotis, E. G., Fatouros, D. G. Mucosal drug delivery and 3d printing technologies: a focus on special patient populations. Adv Drug Deliv Rev. 176, 113858(2021).
  3. Brayden, D. J., Hill, T., Fairlie, D., Maher, S., Mrsny, R. Systemic delivery of peptides by the oral route: formulation and medicinal chemistry approaches. Adv Drug Deliv Rev. 157, 2-36 (2020).
  4. Al Musaimi, O. FDA's stamp of approval: unveiling peptide breakthroughs in cardiovascular diseases, ACE, HIV, CNS, and beyond. J Pept Sci. 30 (11), e3627(2024).
  5. Lewis, A. L., McEntee, N., Holland, J., Patel, A. Development and approval of Rybelsus (oral semaglutide): ushering in a new era in peptide delivery. Drug Deliv Transl Res. 12 (1), 1-6 (2022).
  6. Zhang, Y., Zhang, H., Ghosh, D., Williams, R. O. Just how prevalent are peptide therapeutic products? a critical review. Int J Pharm. 587, 119491(2020).
  7. Wanasathop, A., Patel, P. B., Choi, H. A., Li, S. K. Permeability of buccal mucosa. Pharmaceutics. 13 (11), 1814(2021).
  8. Mazzinelli, E., et al. Oral mucosa models to evaluate drug permeability. Pharmaceutics. 15 (5), 1559(2023).
  9. Djekic, L., Martinovic, M. In vitro, ex vivo and in vivo methods for characterization of bioadhesiveness of drug delivery systems. Bioadhesives Drug Deliv. , (2020).
  10. Mura, P., et al. A preliminary study for the development and optimization by experimental design of an in vitro method for prediction of drug buccal absorption. Int J Pharm. 547 (1-2), 530-536 (2018).
  11. Majid, H., Bartel, A., Burckhardt, B. B. Development, validation and standardization of oromucosal ex-vivo permeation studies for implementation in quality-controlled environments. J Pharm Biomed Anal. 194, 113769(2021).
  12. Wakchaure, R. S., Dhial, K., Pathak, A. Ethical and Safety Considerations in Drug Delivery Systems. Next-Generation Drug Delivery Systems. , Springer, Humana. New York, NY. (2025).
  13. Wang, S., Zuo, A., Guo, J. Types and evaluation of in vitro penetration models for buccal mucosal delivery. J Drug Deliv Sci Technol. 61, 102122(2021).
  14. Sa, G., et al. Histological features of oral epithelium in seven animal species: as a reference for selecting animal models. Eur J Pharm Sci. 81, 10-17 (2016).
  15. Patel, V. F., Liu, F., Brown, M. B. Modeling the oral cavity: in vitro and in vivo evaluations of buccal drug delivery systems. J Control Release. 161 (3), 746-756 (2012).
  16. Tian, Y., et al. Oromucosal films: from patient centricity to production by printing techniques. Expert Opin Drug Deliv. 16 (9), 981-993 (2019).
  17. Malhotra, S., Lijnse, T., O'cearbhaill, E., Brayden, D. J. Devices to overcome the buccal mucosal barrier to administer therapeutic peptides. Adv Drug Deliv Rev. 220, 115572(2025).
  18. De Vries, M. E., et al. Localization of the permeability barrier inside porcine buccal mucosa: a combined in vitro study of drug permeability, electrical resistance and tissue morphology. Int J Pharm. 76 (1-2), 25-35 (1991).
  19. Diaz Del Consuelo, I., Pizzolato, G. P., Falson, F., Guy, R. H., Jacques, Y. Evaluation of pig esophageal mucosa as a permeability barrier model for buccal tissue. J Pharm Sci. 94 (12), 2777-2788 (2005).
  20. Pather, S. I., Rathbone, M. J., Şenel, S. Current status and the future of buccal drug delivery systems. Expert Opin Drug Deliv. 5 (5), 531-542 (2008).
  21. Junginger, H. E., Hoogstraate, J. A., Verhoef, J. C. Recent advances in buccal drug delivery and absorption—in vitro and in vivo studies. J Control Release. 62 (1-2), 149-159 (1999).
  22. Goswami, T., Jasti, B. R., Li, X. Estimation of the theoretical pore sizes of the porcine oral mucosa for permeation of hydrophilic permeants. Arch Oral Biol. 54 (6), 577-582 (2009).
  23. Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D., Grizzle, W. A. Standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotech Histochem. 91 (5), 309-326 (2016).
  24. Franz-Montan, M., et al. Evaluation of different pig oral mucosa sites as permeability barrier models for drug permeation studies. Eur J Pharm Sci. 81, 52-59 (2016).
  25. Pegg, D. E. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , Springer, Humana. New York, NY. (2014).
  26. Hoogstraate, A., et al. In vivo buccal delivery of fluorescein isothiocyanate-dextran 4400 with glycodeoxycholate as an absorption enhancer in pigs. J Pharm Sci. 85 (5), 457-460 (1996).
  27. Karki, S., et al. A pullulan-based bilayer film for buccal delivery of a GLP-1 peptide analogue. Carbohydr Polym. 380, 125064(2026).
  28. Shu, W., et al. Computational and experimental analysis of drug-coated microneedle skin insertion: the mode of administration matters. Adv Mater Interfaces. 12 (17), 2500202(2025).
  29. Marxen, E., Axelsen, M. C., Pedersen, A. M. L., Jacobsen, J. Effect of cryoprotectants for maintaining drug permeability barriers in porcine buccal mucosa. Int J Pharm. 511 (1), 599-605 (2016).
  30. Rebollo, R., et al. Salcaprozate-based ionic liquids for GLP-1 gastric delivery: a mechanistic understanding of in vivo performance. J Control Release. 377, 267-276 (2025).
  31. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat Protoc. 2 (9), 2111-2119 (2007).
  32. Brayden, D. J., Stuettgen, V. Sodium glycodeoxycholate and sodium deoxycholate as epithelial permeation enhancers: in vitro and ex vivo intestinal and buccal bioassays. Eur J Pharm Sci. 159, 105737(2021).

Перепечатки и разрешения

Теги

ex vivo3D
Стандартизированная ex vivo модель оромукозного свинообразного образования для оценки потоков пептидов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.