Идентификация хаб-генов, однонуклеотидных полиморфизмов и потенциальных лекарственных мишеней при раке молочной железы с помощью транскриптомического анализа

Summary

В этом исследовании изучались гены, связанные с митохондриальным окислительным стрессом, связанные с терапевтической резистентностью при HER2-положительном раке молочной железы. Используя транскриптомные наборы данных, интегрированную биоинформатику и клинические данные (n = 4 929), авторы определили MTHFD2 и PRDX3 как ключевые дифференциально экспрессированные гены с потенциальной прогностической ценностью. In silico. Анализы указывают на функциональные эффекты генетических вариантов.

Abstract

HER2-положительный (HER2⁺) рак молочной железы часто развивает устойчивость к таким терапиям, как лапатиниб, что потенциально связано с метаболизмом митохондрий и редокс-перепрограммированием. Целью данного исследования было выявление генов, связанных с митохондриальным окислительным стрессом (MOS-DEGs), как биомаркеров устойчивости, а также характеристики их функциональных nsSNP и структурных воздействий. Наборы данных РНК-секвенации (GSE231524, GSE231525) анализировались с использованием DESeq2 для идентификации DEG, которые были пересечени с генами окислительного стресса митохондриальных для получения MOS-DEGs. Были проведены функциональное обогащение, анализ ИПП, анализ ROC, профилирование экспрессии и анализ выживаемости. nsSNP оценивались с использованием нескольких предиктивных инструментов, а структурные воздействия оценивались с помощью вторичного и 3D-моделирования. Интегрированный транскриптомический и клинический анализ определил MTHFD2 и PRDX3 как центральные MOS-DEGs, демонстрирующие противоположные регуляторные роли в метаболизме митохондриального редокс-соединения. MTHFD2 был значительно повышен и сопровождался плохим прогнозом (HR = 1,53, p = 1,1 × 10⁻¹⁶), тогда как PRDX3 демонстрировал защитные паттерны экспрессии (HR = 0,73, p = 7,7×10⁻¹⁰). Анализ ROC показал их потенциал как предикторов терапевтического ответа. Анализ nsSNP выявил пять вредных вариантов в MTHFD2 и четыре вредных варианта в PRDX3, при этом наиболее патогенными были rs1471336772 (MTHFD2) и rs747786383 (PRDX3). Эти варианты были предсказаны как вредные на основе множества вычислительных систем оценки, включая SIFT ≤ 0,05, PolyPhen-2 ≥ 0,85, вредные показатели CADD и высокие показатели REVEL, и находились в каталитических или редокс-активных доменах. Структурное моделирование показало, что эти замещения могут дестабилизировать конформацию, нарушать сайты связывания металлов и кофакторов, а также влиять на регенерацию NADPH или тиоредоксин-зависимую пероксидазу. Прогнозы молекулярной динамики указывали на потенциальную потерю структурной устойчивости и изменённую гибкость, что указывает на возможное функциональное нарушение окислительно-окислительного контроля митохондриальной. В этом исследовании MTHFD2 и PRDX3 выделяются как регуляторы митохондриального окислительного стресса при раке молочной железы HER2⁺ . Вредные nsSNP в этих генах могут способствовать изменению редокс-баланса, потенциально влияя на метаболическую адаптацию (MTHFD2) и антиоксидантную защиту (PRDX3).

Introduction

Рак молочной железы — самый часто диагностируемый рак у женщин во всём мире и основная причина смерти, связанной с раком, несмотря на значительный прогресс в ранней диагностике и таргетной терапии ^1,2,3. Молекулярная гетерогенность опухолей молочной железы лежит в основе различных клинических исходов и ответов на лечение, что создаёт постоянные трудности для точной^{онкологии 4,5}. Среди признанных молекулярных подтипов рак молочной железы, положительный к эпидермальному фактору роста 2 (HER2), составляет примерно 15–20% всех случаев рака молочной железы и характеризуется амплификацией гена HER2 и гиперэкспрессией тирозинкиназы^HER2 рецептора ^6,7. Хотя терапии, направленные на HER2, такие как трастузумаб и лапатиниб, значительно улучшили прогноз пациентов, первичная и приобретённая устойчивость к этим препаратам часто проявляется, что приводит к рецидиву опухоли и прогрессированию^{заболевания 8,9}. Таким образом, понимание молекулярных механизмов, определяющих устойчивость к терапии HER2, остаётся основной неудовлетворённой потребностью в клинической онкологии.

Новые данные свидетельствуют о том, что дисфункция митохондрий и окислительный стресс играют критическую роль в опосредовании лекарственной резистентности при раке молочной железы. Митохондрии, помимо своей канонической роли в производстве АТФ, являются ключевыми регуляторами апоптоза, редокс-сигнализации и метаболической пластичности — всех процессов, которые раковые клетки используют для выживания терапевтического давления. В частности, устойчивые раковые клетки HER2⁺ демонстрируют метаболический сдвиг в сторону окислительного фосфорилирования (OXPHOS), усиленного буферизации реактивных видов кислорода (ROS) и изменённого митохондриального биогенеза. Эти адаптации позволяют клеткам сохранять сигналы выживаемости и избегать апоптоза, несмотря на длительное подавление сигнальных путей HER2. Гены, кодирующие субъединицы митохондриального комплекса, и ферменты, регулирующие редокс, таким образом, являются потенциальными биомаркерами и терапевтическими мишенями для преодоления устойчивости.

Параллельно несинонимные однонуклеотидные полиморфизмы (nsSNP) в генах, связанных с митохондриальным или окислительным стрессом, могут изменять структуру и функцию белков, влияя на активность ферментов, ответ на лекарства и восприимчивость к^{болезням 10}. Вычислительное предсказание вредных эффектов nsSNP с использованием in silico.такие инструменты, как SIFT, PolyPhen-2 и CADD, обеспечивают быстрый способ выявления функциональных вариантов, которые могут способствовать гетерогенности рака и терапевтической устойчивости. Интеграция транскриптомических и мутационных данных таким образом даёт многомерный взгляд на дисрегуляцию и структурные изменения генов как на транскрипционном, так и на геномном уровнях.

Недавние достижения в биоинформатике и системной биологии позволили высокопроизводительно идентифицировать потенциальные драйверные гены посредством масштабного профилирования экспрессии и сетевого анализа. Публичные репозитории, такие как Gene Expression Omnibus (GEO), предоставляют ценные наборы данных по секвенированию РНК, фиксирующие молекулярные изменения в экспериментальных моделях и когортах пациентов. В сочетании с аналитическими инструментами, такими как DESeq2, clusterProfiler и анализ сетей STRING–Cytoscape, эти ресурсы позволяют осуществлять всестороннюю характеристику дифференциально экспрессированных генов (DEG), обогащение путей и обнаружение генов хаба. Важно отметить, что интеграция генных сигнатур митохондриального оксидативного стресса с DEGs может выявить новые молекулярные механизмы, лежащие в основе устойчивости к HER2-таргетной терапии, и выявить кандидатные биомаркеры для терапевтического вмешательства.

Ось сопротивления, управляемая HER3, недавно привлекла внимание как основной компенсатор после ингибиции HER2. Активация HER3 восстанавливает передачу сигналов PI3K/AKT по низшей цепочке, способствуя выживаемости клеток и толерантности к лекарствам (см. рисунок 1). DUSP6 (фосфатаза с двойной специфичностью 6), отрицательный регулятор ERK-сигнализации, участвует в модулировании этого адаптивного ответа. Ингибирование DUSP6 реактивирует сигнализацию ERK и может противодействовать резистентности, опосредованной HER3, однако его взаимодействие с митохондриальным окислительным стрессом и метаболической адаптацией остаётся недостаточно изученным. Поэтому сравнительный транскриптомический анализ клеточных линий HER2⁺ (BT474 и MDA-MB-453) при ингибировании DUSP6 и хроническом воздействии лапатиниба представляет собой идеальную модель для анализа молекулярных детерминантов лекарственной резистентности.

Рисунок 1. Схематическое изображение молекулярного ландшафта, связывающего митохондриальную дисфункцию, окислительный стресс и прогрессирование рака молочной железы. Эти механизмы интегрировали молекулярные механизмы, лежащие в основе митохондриального окислительного стрессового онкогенеза при раке молочной железы. Дисрегулированные митохондриальные электронные транспортные комплексы, особенно с участием DUFS3, UQCRC1, COX4I1, SDHA и ATP5PO, приводят к чрезмерному образованию реактивных видов кислорода (ROS), что приводит к окислительному повреждению ДНК, перекислению липидов и снижению потенциала мембран митохондрий. Эти окисляющие возмущения активируют онкогенные сигнальные пути, такие как PI3K/AKT, MAPK и NF-κB, одновременно подавляя апоптотические регуляторы, включая p53 и BAX, тем самым способствуя выживаемости, пролиферации и уходу от иммунитета опухолевых клеток. Диаграмма также подчёркивает двойное влияние митохондриального окислительного стресса на метаболизм рака и микроокружение опухоли, подчёркивая его вклад в устойчивость к терапии и иммуномодуляцию при условиях рака молочной железы HER2+. Эта интегративная модель служит механистической основой для последующих транскриптомических и SNP-анализов, направленных на выявление генов-драйверов митохондриальных средств и потенциальных терапевтических целей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Настоящее исследование было направлено на систематическое выявление центральных генов, функциональных nsSNP и потенциальных лекарственных мишеней, связанных с митохондриальным окислительным стрессом при раке молочной железы HER2⁺ . Интегрируя транскриптомные данные из GSE231524 и GSE231525 с отображёнными митохондриальными и окислительными стрессовыми генами, текущее исследование было направлено на определение дифференциально экспрессированных генов митохондриального окисления стресса (MOS-DEG), способствующих устойчивости к терапии. Дальнейшие анализы включали генную онтологию (GO) и обогащение путей KEGG, построение сетей взаимодействия белков и белков (PPI), приоритизацию генов-центров и анализ корреляции выживаемости с использованием базы данных иммунотерапии Kaplan–Meier. Кроме того, ключевые гены были дополнительно изучены на предмет вариации nsSNP и возможного структурного влияния для определения функциональных последствий, вызванных мутациями.

Сочетая транскриптомическое профилирование, сетевую биологию и in silico. мутационный анализ, это исследование предоставляет интегрированную основу для выявления потенциальных митохондриальных биомаркеров и терапевтических целей при раке молочной железы HER2⁺ . Идентификация окисляющих-фосфорилированных хаб-генов и их функциональных SNP может проложить путь к разработке прецизионных терапевтических стратегий для преодоления HER2-резистентности к препаратам и улучшения результатов для пациентов.

Protocol

Извлечение и предобработка данных

Это исследование проводилось с использованием общедоступных транскриптомических и генетических данных; Напрямую не участвовали ни люди, ни животные. Транскриптомные наборы данных, относящиеся к устойчивости к терапии рака молочной железы HER2⁺, были извлечены из базы данных NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)¹¹. Были выбраны два набора данных по РНК-секвенциям, GSE231524 и GSE231525, из-за их специального фокуса на устойчивости, вызванной HER3, и ингибировании DUSP6 в линиях клеток рака молочной железы HER2+ (BT474 и MDA-MB-453). Эти наборы данных включали родительские, лекарственно-толерантные и лекарственно-устойчивые фенотипы, полученные в результате воздействия лапатиниба (1 мкм) и снижения DUSP6. Исходные матрицы счёта и соответствующие файлы метаданных осуществлялись с помощью пакетов GEOquery (v2.70.0) и Biobase (v2.62.0) в RStudio (v4.3.2)¹². Метаданные были отобраны для определения двух основных контрастов для каждого набора данных: GSE231524 сравнивали контрольную группу (BT474 родительский, день 0) с образцами, толерантными к лекарствам и резистентными к ним препаратам (9-й день — 9-й месяц), а GSE231525 сравнили контрольную (Scombled siRNA) с DUSP6 knockdown (DUSP6-KD). Контроль качества и нормализация данных проводились с использованием фреймворка DESeq2 (v1.42.0), которая применяет преобразование с стабилизацией дисперсии (VST) для снижения гетероскедастичности и обеспечения сопоставимости между выборками. Распределение данных и паттерны кластеризации были визуально оценены с помощью ggplot2 (v3.5.0) и pheatmap (v1.0.12) для подтверждения единообразия данных и выявления потенциальных выбросов до анализа дифференциального^{выражения 13,14}.

В этом исследовании было поддержано чёткое различие между результатами, полученными на основе наборов транскриптомических клеток клеток, и результатами, полученными из клинических наборов пациентов. Данные клеточных линий в основном использовались для исследовательского анализа, включая идентификацию дифференциально экспрессированных генов и получение предварительных механистических инсайтов в контролируемых экспериментальных моделях. В отличие от этого, для внешней валидации паттернов экспрессии генов и оценки клинической значимости, включая прогностическую оценку, использовались наборы данных, полученные от пациентов. Соответственно, результаты моделей клеточных линий и клинических когорт интерпретируются отдельно, чтобы избежать чрезмерного обобщения и обеспечить соответствующий трансляционный контекст для всех результатов.

Дифференциальный анализ экспрессии генов

Был проведен дифференциальный анализ экспрессии для выявления генов, значительно изменённых между контролируемыми и лечебными состояниями. Нормализованные подсчёты обработаны с помощью скорректированной регрессионной модели (ARM), интегрированной в DESeq2, для точной оценки изменений лог₂ fold и статистической значимости. Формула проектирования определялась как ~condition, представляющее контрольные и обработанные группы. Гены с скорректированным p-значением (FDR) < 0,05 и абсолютным изменением log₂ fold ≥ 1 считались значительно дифференцированно экспрессированными. Усадка изменения складки Log₂ была выполнена с помощью метода apeglm для повышения прочности при оценке размера эффекта. Результаты анализа визуализировались с помощью EnhancedVolcano (v1.22.0)¹⁵ и ggplot2¹⁶, которые создавали диаграммы вулканов и MA-графики, показывающие связь между магнитудой выражения и статистической достоверностью. Оценки дисперсии также оценивались внутри DESeq2 для обеспечения точного моделирования дисперсии и последовательной нормализации между биологическими^{реплицами 17}.

Извлечение и идентификация генов, связанных с митохондриальным окислительным стрессом, дифференциально экспрессированных генов (MOS-DEGs)

Для изучения связи между энергетическим метаболизмом, окислительным стрессом и лекарственной резистентностью был составлен комплексный список генов, связанных с митохондриальными и окислительными стрессами, из нескольких баз данных, включая Human MitoCarta3.0¹⁸ (https://personal.broadinstitute.org/scalvo/MitoCarta3.0/human.mitocarta3.0.html), Gene Ontology (GO:0006979, ответ на окисляющий стресс) (http://geneontology.org/), Киотскую энциклопедию генов и геномов (KEGG) окислительный фосфорилированный путь (https://www.genome.jp/kegg/), а также базу данных генов человеческого окислительного стресса (HOSGDB) (http://hosgdb.com/). Все полученные гены были стандартизированы в символы генов, одобренных HGNC, с использованием org. Hs.eg.db (v3.18.0) и AnnotationDbi (v1.64.0), при этом дублирующиеся записи, псевдогены и некодируемые РНК были удалены для обеспечения точности аннотации. Полученная курированная панель генов митохондриального окислительного стресса (MOS-гены) впоследствии использовалась в качестве эталонного набора для интеграции с дифференциально экспрессированными генами, выявленными из обоих транскриптомных наборов данных.

Пересечение курируемого списка генов MOS с DEG, полученными из GSE231524 и GSE231525, было выполнено в R с использованием функций dplyr (v1.1.3)¹⁹ и базового R intersect(). Этот интегративный подход позволил идентифицировать MOS-DEG, представляющие гены, функционально связанные с метаболизмом митохондрий, редокс-регуляцией и адаптацией к окислительному стрессу. Пересечение между наборами данных было визуализировано с помощью пакета VennDiagram (v1.7.3) в R для иллюстрации общих и уникальных генов в экспериментальных^{моделях 20}. Уточнённый список MOS-DEG был использован для дальнейших анализов, предоставив механистическое понимание транскрипционного и метаболического перепрограммирования, лежащего в основе устойчивости к HER2-таргетной терапии.

Профилирование экспрессии и визуализация MOS-DEG

Профилирование экспрессии выявленных MOS-DEGs проводилось с использованием пакетов ComplexHeatmap (v2.18.0)²¹ и pheatmap (v1.0.12) в RStudio для визуализации глобальных паттернов экспрессии при родительских, лекарственно-толерантных и устойчивых состояниях. Нормализованные данные подсчёта были преобразованы с помощью масштабирования z-score для стандартизации матрицы экспрессии генов по образцам. Кластеризация проводилась с использованием евклидовых методов расстояния и полного сцепления для выявления паттернов коэкспрессии и различения специфических для условий транскрипционных профилей. Тепловые карты и графики кластеризации были созданы с помощью ggplot2 для чёткого визуального различия условий. Этот подход к визуализации способствовал выявлению генных групп, связанных с митохондриальной активностью, модуляцией окислительного стресса и метаболическим перепрограммированием в состояниях лекарственно-устойчивых препаратов.

Функциональное обогащение и аннотация путей

Для изучения биологической значимости и регуляторных механизмов выявленных MOS-DEG были проведены анализы обогащения генной онтологии (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) с использованием R Studio (версия 4.3.1). Анализы проводились в среде tidyverse с использованием нескольких пакетов Bioconductor для воспроизводимых вычислений и визуализации. Аннотация генов и отображение идентификаторов выполнялись с помощью организации. Hs.eg.db базу данных (https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/), основанную на эталонном геноме Homo sapiens (GRCh38). Анализ обогащения ГО проводился с использованием пакета clusterProfiler (версия 4.8.1; https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/), который классифицирует гены на три основные онтологии — биологический процесс (BP), клеточный компонент (CC) и молекулярная функция (MF). Функция^{enrichGO 22} использовалась с параметрами, установленными в p-значение < 0,05, и скорректированным p-значением. (FDR) < 0,05, применяя метод коррекции Бенджамини–Хохберга. Визуализации, включая столбочные графики, точечные диаграммы и акордовые диаграммы, были созданы с помощью enrichplot (https://bioconductor.org/packages/enrichplot/), ggplot2¹³ (https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/) и GOplot (https://cran.r-project.org/web/packages/GOplot/). Эти инструменты предоставляли структурированное представление о обогащённых терминах ГО и их генных ассоциациях.

Обогащение пути KEGG осуществлялось с помощью функции enrichKEGG() в пакете clusterProfiler, ссылаясь на человеческую базу данных KEGG (https://www.genome.jp/kegg/). Пакет KEGGREST (https://bioconductor.org/packages/KEGGREST/) использовался для поиска и аннотаций данных по путям. Пути с скорректированным p-значением. (q-значение) < 0,05 считались значимыми. Визуализация и отображение путей проводились с использованием pathview (https://bioconductor.org/packages/pathview/), ggplot2 и enrichplot, а для представления сети²³ использовались igraph и ggraph. Все анализы и визуализации обогащения реализовывались в R Studio (v4.3.1) с использованием воспроизводимого кода и стандартизированных рабочих процессов биопроводников, что обеспечивало надёжную идентификацию обогащённых функциональных категорий и биологических путей, связанных с MOS-DEGs.

Валидация предиктивных биомаркеров при раке молочной железы на основе ROC

Для подтверждения клинической предиктивной способности MOS-DEG был проведён анализ кривой операционной характеристики приемника (ROC) с помощью онлайн-инструмента ROCplotter (https://www.rocplot.org/)²⁴. ROCplotter — это интегрированная веб-платформа, которая объединяет данные экспрессии генов с клинически аннотированными наборами данных ответа на лечение от 3 104 пациенток с раком молочной железы, включая тех, кто проходил химиотерапию, гормональную терапию или анти-HER2-препараты.

Анализ проводился с использованием параметров «патологический полный ответ» в качестве переменной исхода и «любая химиотерапия» в качестве категории лечения. Значения экспрессии генов, полученные из наборов микрочипов Affymetrix, были автоматически стратифицированы на группы респондентов и нереспондентов на основе клинических аннотаций внутри платформы.

Для оценки способности каждого гена различать реагирующих и нереагирующих применялись кривая операционной характеристики приёмника (ROC), тест Mann–Whitney U, изменение свершения и тест хи-квадрат. Площадь под кривой (AUC) использовалась в качестве основной метрики для оценки дискриминационной эффективности. Значения AUC более 0,55 с p-значениями ROC < 0,05 считались значимыми, что свидетельствует о умеренной предсказательной эффективности, типичной для транскриптомных биомаркеров, при этом для поддержания аналитической строгости применялась коррекция частоты ложного обнаружения (FDR).

Все выбранные MOS-DEG были запрошены с использованием соответствующих идентификаторов зонда Affymetrix. Дискриминативный потенциал каждого гена оценивался в клинических когортах рака молочной железы, где данные экспрессии были стратифицированы на группы респондентов и нереспондентов. ROC-кривые, коробочные графики и связанные статистические результаты генерировались непосредственно платформой ROCplotter и экспортировались для визуализации и сравнения на последующих этапах. Анализ количественно определил прогностическую ценность окислительно-окислительного стресса и метаболических регуляторов, участвующих в окислительном стрессе митохондрий. Гены, демонстрировавшие стабильную прогностическую значимость в клинических образцах, были сохранены для включения в итоговую предиктивную панель.

Дифференциальный анализ экспрессии в опухолей, нормальных и метастатических тканях (анализ TNMplot)

Паттерны экспрессии верхних MOS-DEGs анализировались на нормальных, опухолевых и метастатических тканях молочной железы с помощью веб-инструмента TNMplot v2 (https://tnmplot.com/analysis/)²⁵. Были изучены как наборы данных РНК-Сек (TCGA + GTEx + MET500), так и наборы данных по генным чипам для обеспечения кроссплатформенной валидации. Модуль «Multiple Gene Analysis» использовался для инвазивной карциномы молочной железы как выбранный тип^{ткани 26}. Значения экспрессии были преобразованы в log₂ и сравнивались в группах опухоли против нормы (TvsN), метастатической и опухоли (MvsT) и метастатической против нормальной (MvsN). TNMplot автоматически вычислял значения сворачного изменения (FC) и p-значения с помощью теста Mann–Whitney U для оценки статистической значимости. Распределение экспрессии визуализировалось в виде коробочных графиков и плотностных графиков, непосредственно генерируемых с интерфейса TNMplot, где зелёный, красный и серый цвета обозначали нормальные, опухолевые и метастатические ткани соответственно. Все рисунки экспортировались в высоком разрешении для интеграции в раздел результатов. Этот двухплатформенный анализ позволил надёжно выявить и валидировать ключевые митохондриальные редокс-метаболические регуляторы, связанные с прогрессированием рака^{молочной железы 27}.

Анализ выживаемости и прогнозирования с помощью плоттера Каплана–Майера

Для оценки прогностической значимости MOS-DEGs при раке молочной железы был проведён анализ выживаемости с помощью онлайн-инструмента Kaplan–Meier Plotter (https://kmplot.com/analysis/)²⁸. Эта база данных интегрирует данные о экспрессии генов и выживаемости более 4900 пациенток с раком молочной железы, полученные из множества наборов данных GEO, EGA и TCGA. Анализ проводился для выживаемости без рецидивов (RFS) с использованием индивидуальных идентификаторов зонда Affymetrix, соответствующих приоритетным генам: 225609_at (GSR), 201761_at (MTHFD2), 201619_at (PRDX3/AOP1) и 201128_s_at (ACLY). Пациентов делили на группы с высокой и низкой экспрессией на основе медианного порога экспрессии, а вероятности выживаемости оценивались с помощью метода Каплана–Мейера. Log-rank тест использовался для оценки статистической значимости между кривыми выживаемости, а коэффициенты опасности (HR) с 95% доверительными интервалами (CI) автоматически рассчитывались инструментом. Все анализы проводились с использованием конечной точки RFS, без ограничений в зависимости от гормонального рецептора или статуса HER2 (ER, PR, HER2 = все). Избыточные выборки были удалены, а предположения о пропорциональных рисках проверены для обеспечения статистической надёжности. Фильтры контроля качества исключали смещённые микромассивы. Ручной выбор зонда или коррекция p-значения для многократных тестов не применялись в соответствии с настройками KM Plotter по умолчанию. Статистическая значимость была определена как стр. < 0,05. Графики выживаемости были визуализированы и загружены в высоком разрешении для дальнейшей интерпретации, сравнивая результаты между высокими и низкими экспрессирами каждого кандидата^{MOS-гена 29,30}.

Данный анализ был инициирован с использованием наборов данных, включающих исключительно образцы рака молочной железы HER2⁺ для идентификации дифференциально экспрессированных генов (DEG) и генов хаба. Впоследствии был проведён анализ выживаемости без ограничений статуса HER2 (ER, PR, HER2 = все) для оценки более широкой прогностической значимости и обобщённости выявленных генов. Этот подход использовался как вторичный этап валидации, а не для переопределения направления исследования. Поэтому прогностические последствия выявленных генов хаба интерпретируются осторожно, при этом первичные выводы остаются специфичными для рака молочной железы HER2⁺ .

Канонические транскриптные последовательности MTHFD2-201 (ENST00000394053.7) и PRDX3-201 (ENST00000298510.4) были извлечены из Ensembl Genome Browser (https://www.ensembl.org)^31,32. Аннотация и классификация вариантов проводились с помощью Ensembl Variant Effect Predictor (VEP) (https://www.ensembl.org/vep), который предоставлял подробный геномный контекст, изменения кодонов и аминокислотные замещения для каждого идентифицированного варианта. Для дальнейшего анализа были выбраны только варианты missense (несинонимные SNP).

Прогнозирование патогенности и приоритизация вариантов

Функциональные последствия каждого nsSNP оценивались с помощью комбинации вычислительных инструментов прогнозирования. SIFT (https://sift.bii.a-star.edu.sg) применялся для оценки сохранения аминокислот, классифицируя варианты с баллом ≤ 0,05 как^{вредные 33}. PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2) оценил структурное и эволюционное влияние замен, где оценки ≥ 0,85 указывали на вероятный ущерб³⁴. CADD (https://cadd.gs.washington.edu) предоставил составную оценку вредоносности, интегрирующую несколько аннотаций, при этом значения ≥ 20 обозначают высокий патогенный^{потенциал 35}. Комплементарные метрики из^{MetaLR 36}, Mutation Assessor и REVEL были интегрированы из интерфейса VEP для повышения надёжности^{предсказания 37}. Варианты, соответствующие порогам MetaLR ≥ 0,70, Mutation Assessor ≥ 3,5 и REVEL ≥ 0,75, считались наиболее вероятными патогенными.

Прогнозирование структурного и механистического воздействия

Для оценки влияния аминокислотных замещений на структурную целостность и биохимическую функцию каждый высокоранжированный nsSNP был дополнительно проанализирован с использованием MutPred2 (http://mutpred.mutdb.org)³⁸ и DynaMut (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut)³⁹. MutPred2 оценил вероятность функциональных нарушений, включая изменённую каталитическую активность, прирост или потерю металлосвязывающих остатков, изменения доступности растворителя и аллостерическую модуляцию, при этом баллы ≥ 0,80 классифицированы как высокопатогенные. DynaMut вычислила изменение свободной энергии Гиббса (ΔΔG) между белками дикого типа и мутантными белками, оценивая направление и величину изменения стабильности, а также создавала визуализации атомных смещений и перестановок водородных связей.

Вторичное и 3D-структурное моделирование и профилирование доступности растворителей

Экспериментально разрешённые кристаллические структуры MTHFD2 и PRDX3 были получены из Белкового банка данных (PDB) и обработаны с помощью PyMOL V:3.1 (https://pymol.org)⁴⁰ для визуализации пространственного распределения вредных остатков. Мутантные модели создавались путём введения соответствующих аминокислотных замещений и затем структурной очистки и минимизации энергии. Сравнительный 3D-анализ выявил сдвиги вторичных элементов, изменённые межатомные контакты и пространственную близость nsSNP к каталитическим и кофакторно-связывающим доменам, выявив возможные нарушения в редокс-окислительном и метаболическом процессе.

Анализ вторичной структуры и экспозиции растворителя проводился с использованием PSIPRED V: 3.2 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)^41,42 и NetSurfP 3.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetSurfP-2.0)⁴³. Эти инструменты предсказывали α-спирали, β-цепи, катушки и неупорядоченные области, а также показатели относительной доступности растворителей (RSA). Были картированы остатки с умеренными или высокими значениями RSA и структурным порядком для выявления позиций, воздействованных растворителем и функционально критических. Поражённые участки визуализировались в 2D-топологических диаграммах, чтобы определить, происходят ли вредные мутации в жёстких каталитических ядрах или гибких областях петли, тем самым предсказывая их вероятное влияние на динамику сворачивания белков и ферментативную эффективность.

Кросс-валидация баз данных, функциональная интеграция и проверка стабильности

Каждый приоритетный nsSNP был сверён с геномными базами данных на уровне популяции, включая dbSNP, 1000 Genomes, ExAC и gnomAD, для подтверждения частоты вариантов, глобального аллельного распределения и ранее зарегистрированных клинических ассоциаций. Интеграция эволюционного консервации, структурного моделирования и функционального прогнозирования на основе машинного обучения позволила выявить высокоуверенные вредные варианты в MTHFD2 и PRDX3. Эти высоковоздействующие мутации впоследствии были сопоставлены с функциональными доменами для выяснения их потенциальной роли в дисбалансе окислительного стресса митохондрий, изменении метаболических сигналов и терапевтической устойчивости при раке молочной железы. Для дальнейшего подтверждения термодинамических последствий каждой вредной замены был использован iMutant 3.0 (https://folding.biofold.org/i-mutant/i-mutant3.0.html)⁴⁴ для прогнозирования влияния мутаций на стабильность белка с использованием последовательностей и структурных данных. Анализ вычислял значения ΔΔG (ккал/моль), отражающие изменение свободной энергии между белками дикого типа и мутантными белками. Варианты с отрицательными значениями ΔΔG классифицировались как дестабилизирующие мутации, что указывало на снижение стабильности белка и повышенную вероятность разворачивания. Интеграция предсказаний iMutant с результатами DynaMut и MutPred2 обеспечила перекрёстную валидацию для выявления структурно критически важных остатков, вероятно, влияющих на окислительную функцию, каталитическую целостность и общую конформационную стабильность белка.

Интегрированная функциональная интерпретация и терапевтическая значимость

Все выявленные вредные nsSNP были валидированы путём перекрёстного сопоставления с базами данных dbSNP, gnomAD и ExAC для подтверждения частот малых аллелей и ранее сообщаемых ассоциаций с фенотипами рака. Интегративная интерпретация эволюционных данных о сохранении, структурном моделировании и стабильности показала, что мутации с высоким воздействием rs1471336772 (MTHFD2) и rs747786383 (PRDX3) оказывают наибольшее вредное воздействие на конформацию белка и каталитическую эффективность. Вычислительные результаты в совокупности показывают, что мутации в MTHFD2 дестабилизируют NADPH-зависимый редокс-метаболизм, а мутации в PRDX3 нарушают окислительный стресс, опосредованный пероксидазой, способствуя дисфункции митохондрий и агрессивности опухолей. Этот структурный и функциональный анализ на основе nsSNP предоставляет вычислительную основу для будущего терапевтического скрининга и мутационной валидации, выделяя MTHFD2 и PRDX3 как точные биомаркеры для редокс-таргетной терапии рака молочной железы. Для повышения ясности и всестороннего обзора аналитической стратегии схематический рабочий процесс, обобщающий основные этапы исследования, представлен на рисунке 2. Рабочий процесс интегрирует дифференциальный анализ экспрессии генов, фильтрацию митохондриальных генов, построение сети взаимодействия белок-белок, клиническую валидацию с использованием ROC-анализа и структурную характеристику на основе nsSNP. Эта поэтапная структура подчёркивает логический переход от обработки транскриптомических данных к идентификации биомаркеров и функциональной интерпретации.

Рисунок 2. Интегративный многоступенчатый рабочий процесс для идентификации и валидации биомаркеров, связанных с митохондриальным окислительным стрессом, при раке молочной железы HER2⁺ . Эта схема обобщает аналитический конвейер, использованный в исследовании. Во-первых, анализ дифференциальной экспрессии генов (DEG) был проведён на наборах данных РНК-секвенации (GSE231524 и GSE231525) для выявления значительно изменённых генов. Эти DEGs были пересечени с курированными генами, связанными с окислительным стрессом митохондриаль, для получения MOS-DEGs. Далее был проведён анализ сетей взаимодействия белков и белков (PPI) с использованием STRING и Cytoscape для выявления генов-хабов и функциональных модулей. Впоследствии анализ кривой операционной характеристики приёмника (ROC) был применён с помощью платформы ROCplotter для оценки прогностической эффективности выбранных генов в клинических когортах. Наконец, были проведены анализ несинонимных SNP (nsSNP) и структурное моделирование для оценки потенциального функционального и структурного воздействия ключевых вариантов в приоритетных генах (MTHFD2 и PRDX3). Этот интегративный рабочий процесс связывает транскриптомные, сетевые, клинические и структурные анализы для выявления потенциальных биомаркеров и терапевтических целей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Results

Дифференциальный анализ экспрессии генов

Дифференциальное профилирование экспрессии было проведено для изучения транскрипционных изменений, связанных с прогрессированием рака молочной железы HER2⁺ и устойчивостью к терапии, с использованием двух независимых наборов данных РНК-секвенации — GSE231524 и GSE231525. В первом наборе данных (GSE231524) было первоначально количественно измерено 19 727 генов. После нормализации, фильтрации и применения скорректированной регр...

Discussion

Митохондриальный окислительный стресс является определяющей чертой адаптации к опухоли, регулирующей выживание клеток, метаболическую пластичность и устойчивость к терапии. В данном исследовании систематически изучались дифференциально экспрессируемые гены (MOS-DEGs), связанные с митохондриальным окислительным стрессом (MOS-DEGs) при раке молочной железы HER2⁺ , интегрируя транскриптомические данные, функциональное обогащение, клиническую валидацию и детальный мутационный и ст...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnnotationDbi	Bioconductor	v1.64.0	Пакет аннотации R, используемый для стандартизации и аннотации символов генов HGNC.
apeglm	Bioconductor	method in DESeq2	Метод, используемый для сжимания log2 fold-change в анализе дифференциальной экспрессии.
Biobase	Bioconductor	v2.62.0	Пакет R, используемый для доступа и управления объектами экспрессии и метаданных, полученными из GEO.
CADD	University of Washington / Kircher Lab	web tool	Совместный аннотационный зависимый дефицитный счет, используемый для предсказания патогенности nsSNP.
clusterProfiler	Bioconductor	v4.8.1	Пакет R, используемый для анализа обогащения GO и KEGG.
ComplexHeatmap	Bioconductor	v2.18.0	Пакет R, используемый для создания тепловых карт и кластеризации экспрессии.
Cytoscape	Cytoscape Consortium	software	Платформа визуализации сети, используемая с сетями PPI, полученными из STRING, и приоритетизацией CytoHubba.
dbSNP	NCBI	database	База данных популяционных вариантов, используемая для перекрестной проверки приоритетных nsSNP.
DESeq2	Bioconductor	v1.42.0	Пакет R, используемый для нормализации, моделирования дисперсии и анализа дифференциальной экспрессии.
dplyr	CRAN / tidyverse	v1.1.3	Пакет R, используемый для манипуляции данными и пересечения наборов генов.
DynaMut	University of Melbourne / BioSig	web server	Инструмент, используемый для оценки изменений стабильности и гибкости, связанных с мутациями, в белках.
EnhancedVolcano	Bioconductor	v1.22.0	Пакет R, используемый для визуализации результатов дифференциальной экспрессии в виде вулканических диаграмм.
Ensembl Genome Browser	EMBL-EBI / Ensembl	database	Источник канонических последовательностей транскриптов для MTHFD2 и PRDX3.
Ensembl Variant Effect Predictor (VEP)	EMBL-EBI / Ensembl	web tool	Инструмент, используемый для аннотации миссэнсных вариантов и интеграции предиктивных оценок.
ExAC	Broad Institute	database	База данных экзомного уровня популяции, используемая для перекрестной проверки nsSNP.
Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI	database	Репозиторий, используемый для получения транскриптомных наборов данных для анализа HER2-положительного рака молочной железы.
Gene Ontology	Gene Ontology Consortium	GO:0006979	Ресурс онтологии, используемый для получения генов, связанных с оксидативным стрессом, и для анализа обогащения.
GEOquery	Bioconductor	v2.70.0	Пакет R, используемый для доступа к матрицам счетов GEO и метаданным.
ggplot2	CRAN / tidyverse	v3.5.0	Пакет R, используемый для визуализации данных, кластеризации и графических выводов.
ggraph	CRAN	R package	Пакет R, используемый для визуализации графов и сетей при представлении обогащения и путей.
gnomAD	Broad Institute	database	База данных популяционных вариантов, используемая для проверки частоты и распределения приоритетных nsSNP.
GOplot	CRAN	R package	Пакет R, используемый для визуализации обогащения GO, включая хордовые и сводные графики.
GSE231524	NCBI GEO	accession	Набор данных RNA-seq, используемый для анализа фенотипов BT474, чувствительных к родительскому, лекарственно-толерантным и устойчивым.
GSE231525	NCBI GEO	accession	Набор данных RNA-seq, используемый для анализа угнетения DUSP6 в HER2-положительных клетках рака молочной железы.
Human MitoCarta3.0	Broad Institute	database	Созданный ресурс митохондриальных генов, используемый для определения наборов митохондриальных генов.
Human Oxidative Stress Gene Database (HOSGDB)	HOSGDB	database	База данных, используемая для получения генов, связанных с оксидативным стрессом.
igraph	CRAN	R package	Пакет R, используемый для представления сетей и визуализации путей.
iMutant 3.0	University of Bologna / Biofold	web server	Инструмент, используемый для предсказания влияния мутаций на стабильность белка.
Kaplan–Meier Plotter	KMplot	web tool	Онлайн-платформа, используемая для анализа безрецидивной выживаемости в когортах рака молочной железы.
KEGG	Kyoto University	database	База данных путей, используемая для анализа окислительного фосфорилирования и обогащения путей.
KEGGREST	Bioconductor	R package	Пакет, используемый для получения и аннотации информации о путях KEGG.
Lapatinib	Not specified in manuscript	1 μM treatment condition	Ингибитор HER2, используемый в исходных экспериментальных наборах данных для получения фенотипов, толерантных к лекарствам/устойчивых к ним.
MetaLR	Integrated via Ensembl VEP	score	Вычислительный показатель патогенности, используемый для приоритетизации вариантов.
MutPred2	MutPred	web server	Инструмент, используемый для предсказания функциональных последствий замещений аминокислот.
NetSurfP 3.0	Technical University of Denmark	web server