Исследование микросреды яичников: методы изоляции, двумерной культуры и органоидной культуры соматических клеток яичников мышей

Краткое содержание

Мы описываем методы выделения соматических клеток яичников мышей из фракции яичника, обогащённой стромой, а также получения соматических органоидов яичников мышей с использованием подхода без каркасов.

Аннотация

Яичник состоит из гетерогенных популяций соматических клеток как внутри фолликула, так и в окружающей строме, которые критически важны для поддержания функции яичников и для образования высококачественных гамет. Мы сообщаем о методах выделения соматических клеток из мышиных яичников, включая эндотелиальные, эпителиальные, стероидогенные, стромальные и иммунные клетки. Когда эти первичные соматические клетки яичников покрываются и культивируются в традиционной двухмерной системе культуры, теряются клеточная гетерогенность, организация, а также взаимодействия между клетками и матрицей, обычно встречающиеся в яичнике. Таким образом, мы также описываем, как генерировать соматические органоиды яичников мышей с помощью подхода без каркасов. Эти органоиды самособираются, поддерживают разнообразные клеточные популяции и производят внеклеточный матрикс и секретируемые факторы, включая цитокины. Органоиды могут использоваться для экспериментов по совместной культуре и поддерживаться в культуре не менее 3 недель с высокой жизнеспособностью. В целом эти модели позволяют исследовать физиологию и патологию яичников с точки зрения соматических клеток.

Введение

Хотя ооцит, или женская гамета, необходима для рождения следующего поколения, соматические клетки в яичнике играют ключевую роль в развитии гамет, выработке стероидных гормонов и гомеостазе яичников. Оооциты, окружённые соматическими гранулезами и тека-клетками, образуют функциональные единицы яичника, известные как фолликулы. Гранулезные клетки физически связаны с яйцеклетками через трансзональные проекции и обеспечивают метаболическую и питательную поддержку яйцеклетки, а также регулируют мейотическую^{остановку 1,2}. Кроме того, в ответ на гонадотропины гранулёза и тека-клетки вырабатывают стероидные гормоны, включая эстроген, прогестерон и андрогены, которые оказывают влияние за пределами репродуктивной системы, воздействуя на сердечно-сосудистую, опорно-двигательную и нервную системы, тем самым влияя на общее женское^{здоровье 3.} Фолликулы яичников развиваются внутри гетерогенной стромы яичника, состоящей из сосудистой системы, иммунных клеток, нескольких популяций интерстициальных фибробластов и мезенхимальных клеток, а также высокоупорядоченной внеклеточной матрикс (ECM)⁴. Эта стромальная микросреда предоставляет физические и химические сигналы, влияющие на рост фолликулов, овуляцию и^{лютеинизацию 4}.

Существует несколько методов для выделения и культивирования гамет и фолликулов in vitro, и эти методы продвинули наше понимание оогенеза и фолликулогенеза⁵. Однако соматический компартмент яичника относительно недостаточно изучен, отчасти из-за отсутствия устойчивых моделей in vitro. Современные модели соматического компартмента яичника в основном ограничены одним типом клеток, таким как фибробласты, эпителиальные клетки поверхности яичника, эндотелиальные, иммунные или гранулезные^клетки 6,7,8,9,10,11. Культура широко определённых первичных соматических клеток яичников в 2D со временем благоприятствует популяциям макрофагов, что приводит к потере клеточной^{гетерогенности 12}. Кроме того, традиционная двумерная (2D) монослойная культура не допускает разнообразных взаимодействий между клетками и матрицей, присутствующих в яичнике. Экспланты яичниковой ткани сохраняют клеточную и структурную сложность родной ткани, но различаются по составу в зависимости от того, где внутри яичника они были^{получены 13,14}.

Органоиды — это трёхмерные (3D), многоклеточные, миниатюрные версии органов или тканей, которые воспроизводят in vivo организацию и^{функционируют 15,16}. Органоиды могут формироваться из стволовых клеток или первичных клеток, выделенных из нормальных или больных^{тканей 15}. В контексте женской репродуктивной системы были созданы органоиды для моделирования эндометрия, маточной трубы, шейки матки и^{плаценты 17}. Однако, что касается яичника, до недавнего времени органоидные модели ограничивались одним типом клеток, такими как поверхностный эпителий яичника или раковые клетки, либо создавались из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, напоминающих структуры фолликулов, а не строму^{яичника 17,18}. Недавние исследования создали и охарактеризовали органоиды с использованием гетерогенных популяций соматических клеток, выделенных из мышей, макаки резуса и ткани яичников^{человека} 19,20,21. Эти органоидные модели позволили исследовать клеточные механизмы, лежащие в основе старения яичников, а также влияние воздействия фталатов на состав^{ЭКМ 19,21}.

Учитывая критическую роль соматических клеток, как в фолликуле, так и в строме для функции яичников, мы описываем методы выделения соматических клеток из фракции яичников мышей, обогащённой стромой, и их культивирования in vitro с использованием традиционной монослойной культуры или в органоидной модели. Используя микроформы агарозы без каркасов, соматические клетки яичников формируют органоиды в течение 1–3 дней. Органоиды сохраняют ключевые популяции клеток яичников, включая фибробласты, макрофаги и стероидогенные клетки, и могут культивироваться до 3 недель с высокой жизнеспособностью. Соматические органоиды яичников способствуют транскриптомической и гистологической оценке, анализу условных сред, совместному выращиванию с другими типами клеток и методам скрининга соединений. В целом, эти органоиды являются надёжной моделью для in vitro допроса и модуляции соматического компартмента яичника и могут применяться для изучения развития, старения, физиологии и патологии яичников.

Протокол

Использование животных для разработки этого протокола было выполнено в соответствии с Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Северо-Западного университета и Руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (номер по обеспечению благополучия животных Северо-Западного университета: A3283-01; Идентификатор протокола IACUC: IS00013082_IM12). Информация о производителях и каталожные номера всех материалов, включая силиконовые отливки для агарозных микроформ, среды и добавки, приведены в Таблице материалов. Обзор шагов протокола приведён на рисунке 1. Все этапы протокола должны выполняться с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты, в соответствии со всеми институциональными нормами по биобезопасности и охране окружающей среды и, если не указано иное, в шкафе класса II.

Рисунок 1: Схема выделения соматических клеток яичников у мышей, генерации соматических органоидов в яичниках и последующих применений. Мышиные яичники изолированы, а стромальная фракция обогащается. Обогащённая стромальная фракция переваривается ферментативно и механически. Непереваренная ткань протушивается. Клетки гранулируются, промываются, подсчитываются и обрабатываются для культивирования в 2D. Для генерации органоидов, после 2D-культивирования за ночь, клетки собирают с помощью трипсина, гранулируют, промываются и подсчитывают. Клетки засеиваются в агарозные микроформы для культуры органоидов. Органоиды могут использоваться для гистологии, экстракции РНК/белков, анализа кондиционированных сред, лечения и скрининга лекарств, а также для совместной культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

1. Подготовка среды для выделения и культивирования соматических клеток яичников

ПРИМЕЧАНИЕ: Переваривание ткани яичников и последующая изоляция и культура первичных соматических клеток требуют четырёх типов среды: дисекционная среда (СД; используется в шагах 2.3–2.4 для вскрытия и проколов яичников мышей), ферментативная среда (ЭМ; используется в шагах 2.5–2.8 для ферментативного переваривания яичников мышей, обогащённых стромой), закаливающая среда (КМ; используется в шаге 2.9 для замедления ферментативного пищеварения), и покрытие (PM; используется в шагах 2.11–2.14 и 4.6 для промывания, покрытия и 2D-культуры первичных соматических клеток яичников, а также для инактивации трипсина при извлечении клеток из 2D-культуры). Все среды должны быть подготовлены в стерилизованном биологическом защитном шкафе класса II или ламинарном вытяжном капе. Рецепты медиа, приведённые ниже, достаточно для обработки яичников от 5 до 6 мышей, но их следует масштабировать по мере необходимости. Все среды можно подготовить до недели вперёд и хранить при 4 °C, но ферменты для ЭМ должны быть добавлены свежими в день изоляции клеток.

1. Приготовьте ДМ (15 мл), содержащую 1% плодовой сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и 0,5% пенициллин-стрептомицина (PS) в среде L-15 Лейбовица. Стерилизуйте среду стерильным фильтром.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ДМ буферизируется для обмена воздухом и используется при микродиссекции яичника от окружающих тканей, а также при обогащении стромальной фракции.
2. Подготовьте EM (10 мл), содержащий 1% FBS и 0,5% PS в αMEM. Добавьте 82 ферментативных единицы/мл коллагеназы IV и 0,2 мг/мл ДНКазы I (≥400 ферментативных единиц активности/мг). Растворите ферменты путём инвертирования, а затем стерилизуйте среду с помощью стерильного фильтра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ферментативная среда состоит из бикарбоната натрия для обмена воздухом при 5%_CO2 и используется для ферментативного переваривания фрагментов ткани яичников.
3. Подготовьте QM (20 мл), содержащий 10% FBS и 0,5% PS в микро-MEM-среде. Стерилизуйте среду стерильным фильтром.
   ПРИМЕЧАНИЕ: QM — это бикарбонат натрия, буферизированный для обмена воздуха с содержанием 5%_CO2 , используемый для закалки ферментативного расщепления.
4. Приготовьте PM (30 мл), содержащий 10% FBS и 1% PS в RPMI 1640 (содержит 25 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина). Стерилизуйте среду стерильным фильтром.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PM — это бикарбонат натрия, буферизированный для обмена воздухом с содержанием 5%_CO2 и используется для покрытия первичных соматических клеток яичников, а также для культуры в 2D.

2. Пищеварение ткани яичников и выделение первичных соматических клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиные яичники изолируют и переваривают как ферментативно, так и механически для выделения первичных соматических клеток. Яичники от 5 до 6 мышей можно обрабатывать вместе в одном блюде. Следующие шаги следует выполнять с помощью асептической техники, желательно с помощью диссекционного микроскопа в ламинарной вытяжке.

1. Добавьте 10 мл EM, 20 мл QM и 20 мл PM в отдельные чашки Петри диаметром 100 мм. Уравновесьте тарелки в инкубаторе тканевой культуры (увлажнённая среда, 37 °C с 5%_CO2) минимум за 1 час до использования.
2. Подогрейте ДМ в водяной бане (37 °C) перед использованием.
3. Вскрытие яичников мыши в чашку Петри диаметром 35 мм, содержащее 3 мл ДМ. Отдельте яичники от прикреплённой жировой ткани, яйцевода и бурсы яичника с помощью тонких щипцев и/или микроножниц (рисунок 2Ai,ii). При необходимости для микродиссекции используйте расщепляющий микроскоп.
4. Перенесите вскрытые яичники в 45-мм стекло с 2–3 мл ДМ. Под расщепляющим микроскопом закрепляют и проколывают все области яичников с помощью инсулиновых игл 28-G, используя недоминантную и доминантную руки соответственно, примерно в течение 10 минут. Часто вращайте ткани яичников, чтобы все области были повреждены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прокалывание яичников обогащает стромальную фракцию, высвобождая преантральные фолликулы, а также кучевые яйцеклетки и гранулезные клетки из антральных фолликулов (рисунок 2Aiii–iv).
5. Используйте тонкие щипцы для перемещения яичников мышей, обогащённых стромой, к чашке Петри с помощью уравновешенного ЭМ (рисунок 2Bi).
6. Быстро минимизируя изменения температуры и pH среды, разорвите яичники, обогащённые стромой, на части примерно 2–3 мм с помощью тонких щипцов (рисунок 2Bii).
7. Держите чашку Петри под углом и неоднократно пипетьте EM с кусочками яичниковой ткани пипеткой p1000, установленной на 1 мл, 100× или в течение 3 минут, в зависимости от того, что наступит раньше (рисунок 2Biii). Покрутите чашку Петри по необходимости, чтобы убедиться, что все кусочки ткани пипетированы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань слишком большая для пипетирования наконечником p1000, кончик можно разрезать стерильным скальпелем, чтобы сделать отверстие шире. Отверстие должно быть достаточно широким, чтобы большинство (>50%), но не все части ткани могли проникнуть, создавая эффект сдвига.
8. Переместите чашку Петри с ЭМ и кусочками ткани яичников в инкубатор для культуры тканей (увлажнённая среда, 37 °C с 5%_CO2) и инкубировать в общей сложности 30 минут, после чего снова снимайте чашу и проводите пипетирование (100× или 3 минуты) через 15 минут, а затем снова в конце 30-минутной инкубации (рисунок 2Biii).
   ПРИМЕЧАНИЕ: После первых 15 минут инкубации кусочки ткани должны быть достаточно переварены, чтобы >80% проходили через наконечник пипетки p1000 без необходимости резать кончик для расширения отверстия. Общая продолжительность пищеварения и объём пипетирования будут зависеть от начального размера порванных кусочков ткани. Кроме того, возраст и штамм мыши, вариабельность активности ферментов от партии к партии и размер отверстия пипетки могут влиять на скорость разрушения тканей. Пищеварение должно быть заглушено, когда части ткани яичников расщеплены примерно на 1 мм фрагменты, которые всё ещё видны глазом (рисунок 2Biv). Чрезмерное переваривание может привести к потере клеток и снижению их жизнеспособности.
9. Разведите ферменты для замедления пищеварения тканей, добавив 20 мл предварительно уравновешенного QM (рисунок 2Ci).
10. Пропустите суспензию клетки через 40-мкм-клеточное сито, установленное поверх конической трубки объёмом 50 мл, чтобы удалить непереваренные части ткани (рисунок 2Cii). Центрифугуйте фильтрат при 300 × г в течение 5 минут при комнатной температуре для гранулирования клеток (рисунок 2Ciii).
11. Промывайте клетки, удаляя супернатант аспирацией, ресуспендировав гранулу клетки в 1 мл предварительно уравновешенного PM, перенося суспензию клетки в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл и центрифугуйте при 300 × г в течение 5 минут при комнатной температуре для повторного гранулирования клеток (рисунок 2Civ).
12. Удалите супернатант, суспензуйте клеточную гранулу в 1 мл PM, окрашьте 10 мкл аликвот клеток в трипан-синий цвет для оценки жизнеспособности клетки и подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. таблицу 1 для ожидаемого количества первичных соматических клеток яичников, в зависимости от штамма и возраста мышей, на этом этапе протокола изоляции. Жизнеспособность клеток на этом этапе должна составлять >80%.
13. Поместить клетки на сосуд, обработанный культурой тканей, при плотности примерно 1,25 × 10 5-1,5 × 10⁵/см^² (например, при количестве клеток примерно 3 × 10⁶ пластинчатые клетки на 60-мм тарелке, обработанной тканевой культурой, а при счёте примерно 1 × 10⁶ — пластинчатые клетки на одну лунку 6-луночной пластины, обработанной тканевой культурой).
    1. Добавьте дополнительное количество PM в зависимости от общего объёма тарелки или тарелки (например, добавить дополнительно 4 мл PM при использовании 60-мм тарелки или 2 мл PM, если использовать колодец с 6 колодцами).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность покрытия, указанная выше, рекомендуется для использования клеток для генерации органоидов после 2D-культуры за ночь. Для более длительной двухмерной культуры клетки могут быть покрыты с меньшей плотностью. Дополнительные материалы, которые не были уравновешены, могут храниться при 4 °C до 1 недели. ПМ необходим как для генерации органоидов, так и для поддержания соматических клеток яичников в 2D-культуре. На этом этапе протокола соматические клетки яичников могут содержаться в двухмерной монослойной культуре (шаг 2.14) или использоваться для генерации органоидов (перейдите к разделу 3). Двухмерная культура за ночь перед генерацией органоидов необходима для удаления всех яйцеклетки из фолликулов ранних стадий, которые могли пройти через сито клетки диаметром 40 мкм.
14. После ночного покрытия (минимум 16 часов) промывайте клетки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS; Без мг/Ca, pH 7,0–7,3) для удаления мёртвых клеток и мусора (рисунок 3A). Добавляйте свежий PM после мытья и заменяйте медиа свежим PM через день в культуре (рисунок 3B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на высокую жизнеспособность клеток после изоляции, после ночного покрытия обычно наблюдается значительное снижение общего количества клеток из-за гибели клетки или неспособности прикрепиться к сосуду культуры ткани (рисунок 3A).

Рисунок 2: Схема выделения соматических клеток яичников мыши. (A) Репрезентативные изображения (i,ii) диссекции яичников мыши и (iii,iv) обогащения стромы. Мышиный яичник обведён пунктирной линией в букве Ai. (B) Репрезентативные изображения фрагментов ткани яичников на протяжении механического и ферментативного пищеварения. Яичники, обогащённые стромой (i) до и (ii) после разрыва, (iii) фрагменты ткани яичников во время пипетирования и (iv) части яичников после пищеварения. (C) Репрезентативные изображения (i) утоления пищеварения, (ii) фильтрации клеточной суспензии и (iii, iv) гранулирования первичных соматических клеток яичников мыши. Всадки в Cii и Ciii показывают непереваренные части ткани, захватываемые клеточным ситечком и клеточной гранулой после центрифугирования соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Первичные соматические клетки яичников можно культивировать в 2D. (A) Репрезентативные световые изображения первичных соматических клеток яичников, помещаемых в 60-мм антенну через 16 часов после нанесения, до и после промывания PBS. (B) Репрезентативные световые изображения первичных соматических клеток яичников, покрытых в пластине с 24 лунками в течение 3 дней в культуре. Масштабные полосы = 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Подготовка агарозных микроплесеней и среды для генерации и культивирования органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Соматические органоиды яичников образуются и культивируются в агарозных микроформах без каркасов с яичниковыми органоидными средами. Микроформы агарозы и органоидные среды яичников должны подготовляться с помощью асептической техники в стерилизованном биологическом защитном шкафу класса II или ламинарном вытяжке.

1. Подготовка агарозных микроформ
   1. Поместите силиконовые сливки для микроформ и щипцов Graefe в мешок для стерилизации и автоклаве с использованием сухого цикла для стерилизации (давление в оболочке: 20 psi, температура камеры: 250 °F (121,11 °C, время стерилизации: 15 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько силиконовых отливок можно автоклавировать и использовать одновременно для более быстрого создания агарозных микроформ.
   2. Добавьте 1 мл PBS с 1% PS в каждую лунку 24-луночной пластины для хранения агарозных микроплесеней.
   3. Растворите 1,5% (w/v) стерильную агарозу в PBS, нагревая в микроволновке, в горячей бане или на горячей плите.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворение агарозы путём разогрева в микроволновке в конической трубке объёмом 50 мл, помещённой в стакан на 100 мл, наполненную водой, хорошо работает (рисунок 4Ai). Помимо контролируемого кипячения, горячая водяная ванна в стакане замедляет повторное затвердевание агарозы.
   4. Дайте жидкой агарозе остыть примерно до 50 °C, чтобы трубку было удобно использовать.
   5. Медленно вводите пипетку 300–350 мкл агарозы 1,5% в силиконовый отлив, при этом следите за тем, чтобы не переполнить или недозаполнить отливку и избежать образования пузырьков (рисунок 4Aii). Убедитесь, что агароза образует плоский слой в верхней части отливки, а не вогнутый или выпуклый край (рисунок 4Aiii, iv). Лопайте пузырьки стерильным наконечником пипетки p10 до того, как агароза начнёт затвердеть (рисунок 4Bi–iii).
   6. Дайте агарозе затвердеть в силиконовом отливке в течение 2–3 минут при комнатной температуре (рисунок 4Biv).
   7. После твердости инвертировать силиконовый отлив поверх 24-луночной пластины для культуры тканей, содержащей PBS + 1% PS. Аккуратно согните силикон, чтобы выпустить агарозную микроформу в пластину (рисунок 4Ci).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроформы агарозы, погружённые в PBS +1% PS в 24-луночной пластине для культуры тканей, обёрнутой парапленкой, могут храниться при 4 °C до 1 месяца до использования (см. рисунок 4Cii). Микроформы агарозы следует готовить не менее чем за 16 часов до использования, так как микроколодцы часто содержат воздушные пузырьки сразу после литья и погружения в PBS + 1% PS (рисунок 4Ciii). Однако эти воздушные пузырьки рассеиваются во время хранения (рисунок 4Civ). Перед использованием для органоидной культуры вставки агарозных микроколодцев следует тщательно осмотреть под микроскопом, чтобы убедиться, что микроколодцы не были слиты и не повреждены во время литья (рисунок 4D, i–iv). Дефектные микроплесени не рекомендуются для генерации и культивирования органоидов. Рекомендуется подготовить избыток агарозных микроплесеней, чтобы компенсировать ~25% с дефектами
2. Подготовка яичниковой органоидной среды
   1. В шкафчике для биобезопасности добавьте в базальную среду 1 и 2 и 1% PS в базальную среду согласно инструкции производителя. Храните подготовленную органоидную среду для яичников при 4 °C до 2 недель перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавки 1 и 2 можно цитировать и хранить при -20 °C.

Рисунок 4: Схематическое отображение подготовки агарозных микроформ. (A) Репрезентативные изображения (i) 1,5% приготовления агарозы, (ii) пипетирования в силиконовые отливки, (iii) правильно заполненных и (iv) переполненных силиконовых отливок. Пунктирные линии в буквах Aiii и AIV показывают плоские и выпуклые днища агарозных микроформ соответственно. (B) Репрезентативные изображения (i,ii) заполненных силиконовых отливок с пузырьками в агарозе, (iii) лопающихся пузырьков с наконечником пипетки перед затвердеванием агарозы и (iv) затвердевшей агарозной микроформы внутри силиконового отливка. (C) Репрезентативные изображения (i) удаления затвердевших агарозных микроформ из силиконовых отливок, (ii) хранения агарозных микроформ в 24-лунной пластине с PBS + 1% PS, (iii) пузырьков, присутствующих в микроскважинах сразу после литья, и (iv) безпузырьковых, правильно отлитых агарозных микроформ после 16 часов хранения. (D) Репрезентативные изображения микроплесеней с (i,ii) комбинированными скважинами, (iii) разрушенными колодцами, или (iv) повреждениями. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; PS = пенициллин-стрептомицин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Генерация и культивирование органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: После 2D-культуры за ночь первичные соматические клетки яичников извлекаются из 2D-культуры и засеяны в агарозные микроформы для получения органоидов. Следующие шаги следует выполнять с помощью асептической техники в стерилизованном шкафу биологической безопасности класса II.

1. Разогрейте PM и органоидные среды до 37 °C в водяной бане и разогрейте трипсин 0,05% до комнатной температуры.
2. Используя щипцы Грефе, аккуратно перемещайте микроформы в колодцы новой пластины на 24 лунки (рисунок 5Ai).
3. Добавьте 500 мкл яичниковой органоидной среды в каждую ячейку 24-ячевой пластины, содержащей агарозную микроформу (рисунок 5Aii). Убедитесь, что микроплесени полностью погружены в среду и уравновесьте микроформы и среду не менее 30 минут в инкубаторе (увлажнённая среда, 37 °C с 5%_CO2).
4. Удалите PM из приклеенных соматических клеток яичников, аспирируя и промывая клетки с помощью PBS без Mg/Ca.
5. Добавьте 0,05% трипсина (1–2 мл трипсина для тарелки на 6 колод или 60 мм) для извлечения клеток из 2D-культуры. Инкубировать клетки трипсином в течение 2–3 минут при 37 °C в инкубаторе.
6. Убедитесь, что клетки отделились под микроскопом, и инактивируйте трипсин, добавляя два объёма подогреного PM на каждый объём трипсина.
7. Перенесите суспензию ячейки в коническую трубку объёмом 15 мл и гранулируйте клетки центрифугой при 300 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
8. Суспензировать клетки в 1 мл подогреного PM, окрасить аликвот клеток в трипан-синий цвет для оценки жизнеспособности клетки и посчитать клетки с помощью гемоцитометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: см. Таблицу 1 для предполагаемого количества первичных соматических клеток яичников, в зависимости от штамма и возраста мыши, после двухмерной культуры за ночь и последующей трипсинизации. Жизнеспособность трипсинизированных клеток обычно превышает 90%.
9. Гранулировать клетки центрифугой (300 × г в течение 5 минут при комнатной температуре) и ресуспензировать клеточную гранулу в яичниковой органоидной среде до плотности 3,33 × 10⁶ живых клеток на 1 мл среды, то есть 2,5 × 10⁵ живых клеток на 75 мкл среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь 2,5 × 10⁵ клеток сеются в агарозную микроформу. Таким образом, общее количество микроформ, которые можно сгенерировать, будет зависеть от общего количества клеток. Органоиды могут генерироваться менее чем с 2,5 × 10⁵ клеток на агарозную микроформу, но размер органоидов, кинетика агрегации, относительный состав клеток и функции, включая выработку гормонов, могут зависеть.
10. Удалите уравновешенные агарозные микроформы из инкубатора, убедитесь, что микроформы ориентированы так, чтобы камера посева клеток была обращена вверх, и удалите органоидную среду яичников из камер клеточного посева (рисунок 5Aiii).
    1. Удалите среду из камер для засея клеток микроформ, используя щипцы Грефе для подъёма и наклона микроформ или с помощью пипетирования. Чтобы удалить материал из камер посева клеток с помощью пипетирования, аккуратно наведите кончик пипетки над углом камеры посева клетки во время набора среды. Не вступайте в прямой контакт с агарозной микроплесенью, чтобы не нарушать микроколодцы.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Камеры посева клеток должны быть максимально сухими, чтобы микроколодцы были видны глазом, но снаружи микроплесеней всё равно должны быть окружены органоидными средами яичников (рисунок 5Aiii).
11. Подайте 75 мкл суспензии клетки (то есть 2,5 × 10⁵ клеток) непосредственно в камеру засея каждой агарозной микроформы и избегайте образования пузырьков (рисунок 5Bi). Верните пластину с 24 лунками в инкубатор.
12. Через один-два часа после посева клеток добавьте дополнительно 250 мкл подогретого яичникового органоидного среды вокруг внешней стороны агарозных микроплесеней, стараясь не нарушать камеры посева клеток (рисунок 5Bii).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные соматические клетки яичников должны начинать агрегировать в течение 1–24 часа после посева в агарозных микроплесенях (рисунок 5Biii).
13. Замените среду вокруг агарозных микроплесеней на 750 мкл свежей органоидной среды яичников на следующий день после посева клеток, а затем через день во время культуры.
    1. Чтобы заменить среду, держите пластину под лёгким углом, чтобы удалить отложенный материал вокруг агарозных микроформ. Не удаляйте материалы из камер посева клеток. Аккуратно пипеттуйте свежую среду к стенке колодца, чтобы не нарушать камеры посева клеток.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Обусловленные среды от изменений среды могут сохраняться и сохраняться при -80 °C для анализа факторов, секрецируемых органоидами. После формирования органоидов (через 1–3 дня после засева клеток) среду можно заменить на среду, содержащую рекомбинантные белки, ингибиторы и т.д., чтобы изучить влияние различных методов обработки на функцию органоидов или для скрининга соединений.

Рисунок 5: Схема генерации соматических органоидов яичников. (A) Репрезентативные изображения (i) переноса агарозных микроформ на культивационную пластину с помощью щипцов Graefe, (ii) уравновесления агарозных микроформ в яичниковой органоидной среде и (iii) удаления среды из клеточных камер посева. Стрелка в букве Aiii указывает на пустую камеру посева ячеек. (B) Репрезентативные изображения (i,ii) засевания клеток в агарозные микроформы и (iii) пропущенного светового сканирования агарозной микроплесени, содержащей агрегирающие соматические клетки яичников. Шкала (Biii): 2500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

5. Использование органоидов для последующих приложений

ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды могут использоваться для различных последующих применений, включая гистологию, молекулярную биологию (например, анализ РНК/белков), анализ условных сред и совместное выращивание.

1. Гистология
   ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды могут быть обработаны для гистологических конечных точек без удаления из агарозных микроформ. Фактически, органоиды в агарозных микроплесенях действуют аналогично тканевым микроматрицам, что позволяет проводить высокопроизводительную гистологическую оценку нескольких равномерно расположенных органоидов одновременно.
   1. Растворить 1,5% (с в/в) стерильной агарозы в PBS путём кипячения.
   2. Следуя культуре соматических органоидов яичников, держите пластину под углом и убирайте среду вокруг агарозных микроплесеней.
   3. Под расщепляющим микроскопом удалите среду из клеточных камер, аккуратно подвесив кончик пипетки над углом каждой клеточной камеры и аккуратно поднимая среду, не нарушая органоиды и не нарушая саму микроплесень.
   4. Аккуратно пипеткой 100–125 мкл жидкой агарозы 1,5% охлаждённой до примерно 50 °C в угол каждой камеры посева клетки, чтобы заполнить и герметизировать камеры посева клеток, стараясь не беспокоить органоиды (рисунок 6Ai).
   5. Дайте агарозе затвердеть 2–3 минуты при комнатной температуре.
   6. Добавьте 750 мкл модифицированного Дэвидсона или 4% параформальдегида в каждую скважину и закрепите органоиды внутри герметичных агарозных микроформ на ночь при 4 °C.
   7. После фиксации удалите фиксатор и промывайте агарозные микроформы 70% этанолом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроплесени можно хранить в 70% этаноле при 4 °C до обработки тканей (обезвоживание, очистка и инфильтрация воска). Во время обработки тканей отслеживайте ориентацию агарозных микроплесеней.
   8. После обработки тканей внедрить агарозные микроформы в парафин так, чтобы микроформы были плоскими внутри парафиновых блоков, а нижние части микроформ были первыми разрезаны (рисунок 6Aii).
   9. Разрезать парафиновые блоки при 5 мкм и разместить тканевые срезы на заряженные микроскопические слайды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Присутствие микроколодцев можно визуализировать глазом при сечении как в срезах ткани, так и в парафиновых блоках (рисунок 6Aiii,iv). Наличие органоидов в срезах микроплесени можно проверить, изучив секционные стекли под микроскопом (рисунок 6Av). Вместо того чтобы размещать 2–3 последовательных секции на одном слайде, размещение 2–3 секций, каждая с расстоянием 50 мкм (то есть каждую^{десятую} секцию) на одном слайде, увеличивает вероятность того, что большинство органоидов будут представлены хотя бы в одном разделе на каждом слайде. Органоиды равномерно расположены в срезах ткани, что облегчает визуализацию после гистологического окрашивания (рисунок 6Avi).
   10. Дайте слайдам высохнуть в духовке при 37 °C на ночь.
   11. Проводите гистологическое или иммуногистохимическое окрашивание или храните стекли при комнатной^{температуре 19}.
2. Сбор органоидов для молекулярных применений
   ПРИМЕЧАНИЕ: После культуры органоиды могут быть удалены из агарозных микроформ и обработаны для различных последующих молекулярно-биологических применений, включая экстракцию РНК или белка для оценки экспрессии генов или белков.
   1. Держите пластину с агарозными микроформами под небольшим углом и удалите среду вокруг агарозных микроформ с помощью пипетирования.
   2. Добавьте 750 мкл PBS комнатной температуры в колодцы, содержащие агарозные микроформы.
   3. Используйте щипцы Graefe, чтобы инвертировать и взволношивать агарозные микроплесени, чтобы выпустить органоиды в окружающую PBS. Подтвердите выделение органоидов из агарозных микроформ под микроскопом.
   4. Удалите пустые агарозные микроформы с помощью щипцов Graefe и перенесите PBS, содержащие органоиды, в микроцентрифугные трубки с помощью пипетирования.
   5. Гранулируйте органоиды центрифугированием при 10 000 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
   6. Удалите супернатант с помощью аспирации и переходите к экстракции РНК или белка. В качестве альтернативы заморозьте ячеточную гранулу и храните при -80 °^{C 19}.
3. Сохранение органоидных обусловленных сред для анализа
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кондиционированные среды органоидов можно сохранять во время культуры для анализа факторов, секретируемых органоидами, включая гормоны, цитокины и факторы роста. Репрезентативные результаты анализа цитокинов в органоидно-обусловленных средах приведены на рисунке 7A.
   1. Держите пластину с агарозными микроформами под небольшим углом и удалите кондиционированную среду вокруг микроформ с помощью пипетирования. Не удаляйте среду из клеточных камер посева, чтобы не беспокоить органоиды.
   2. Переведите кондиционированную среду в микроцентрифугные трубки и переходите к анализу среды или быстрой заморозке и храните при -80 °^{C 19,22}.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности центрифугуйте кондиционированную среду при 10 000 × г в течение 5 минут, чтобы отпугнуть мёртвые клетки или мусор. Перед анализом или хранением среды перенесите супернатант в новые микроцентрифугальные трубки.
4. Органоидная кокультура
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соматические органоиды яичников могут быть кокультурированы с другими клетками и тканями несколькими способами. Репрезентативные результаты органоидной кокультуры с клетками рака яичников и фолликулами методами, описанными в шагах 5.4.1 и 5.4.3 соответственно, показаны в Рисунок 7B,C.
   1. Для получения органоидов с использованием комбинации первичных соматических клеток яичников мыши и других типов клеток для изучения эффектов прямых взаимодействий между клетками и клетками следует шагам 5.4.1.1–5.4.1.4.
      1. Следуйте шагам 4.1–4.9, чтобы промыть первичные соматические клетки яичников после 2D-культуры за ночь, извлекать клетки из 2D-культуры с использованием 0,05% трипсина, гранулировать, подсчитать и повторно суспензировать клетки в яичниковой органоидной среде при плотности 2,5 × 10⁵ живых клеток на 75 мкл среды.
      2. Если другой интересующий тип клеток привязывается, берите клетки из двумерной культуры. Посчитайте клетки, центрифугирайте их и ресуспензируйте в яичниковой органоидной среде с плотностью 2,5 × 10⁵ живых клеток на 75 мкл среды.
      3. Комбинируйте суспензию первичных соматических клеток яичников с подвешением другого интересующего типа клеток в известном соотношении.
      4. Следуйте шагам 4.10–4.13, чтобы засеять полученную клеточную суспензию в агарозные микроформы и культурные органоиды.
   2. Чтобы перенести агарозные микроформы, содержащие сформированные органоиды, на пластины с 24 лунками, содержащие другие клетки или органоиды, следует выполнить шаги 5.4.2.1–5.4.2.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки влияния факторов, получаемых из органоидов, секретируемых факторов на другие типы клеток и наоборот, сформированные органоиды могут оставаться внутри агарозных микроформ, а целые агарозные микроформы могут быть перенесены на пластину с 24 лунками, содержащую другие клетки или органоиды. Эти методы совместной культуры могут использоваться, когда органоидные среды яичников используются для культивирования обоих типов клеток и тканей.
      1. Разогреть органоидную среду яичников до 37 °C в водяной бане.
      2. Держите пластину с агарозными микроформами под углом и удалите среду вокруг агарозных микроформ с помощью пипетирования.
      3. С помощью щипцев Грефе аккуратно перемещайте микроформы в пластины с 24 лунками, содержащие другие клетки или органоиды.
      4. Добавьте 750 мкл свежей органоидной среды яичников, чтобы окружить агарозные микроформы.
   3. Чтобы удалить сформированные органоиды из агарозных микроплесеней и перенести их в новые агарозные микроформы, следует выполнить шаги 5.4.3.1–5.4.3.13.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если яичниковая органоидная среда не является желаемой средой для экспериментов с совместной культурой, парадигма, описанная в шаге 5.4.2, ставит вызов значительной переносности среды, учитывая, что агарозные микроплесени насыщены яичниковыми органоидными средами. Сформированные органоиды (через 1–3 дня после первоначального посева клеток) могут быть перемещены из агарозных микроформ и перенесены в новые агарозные микроформы для дополнительной культуры или совместного высевания, чтобы предотвратить перенос среды.
      1. Нагрейте нужные средства для совместной культуры до 37 °C в водяной бане.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Среды на основе DMEM, αMEM и F12 успешно использовались для совместных экспериментов с соматическими органоидами яичников.
      2. Используя щипцы Graefe, аккуратно переместите новые агарозные микроформы из PBS +1% PS в колодцы пластины с 24 лунками, содержащие другие клетки или органоиды для совместного культивирования.
      3. Убедитесь, что микроформы полностью погружены в среду, добавьте дополнительные необходимые материалы для совместного выращивания по мере необходимости и уравновесьте микроформы и среду не менее 30 минут в инкубаторе (увлажнённая среда, 37 °C с 5%_CO2).
      4. Держите пластину с агарозными микроформами с образованными органоидами под небольшим углом и удалите среду вокруг агарозных микроформ с помощью пипетирования.
      5. Добавьте нужные материалы для совместного выращивания вокруг агарозных микроплесеней с образованными органоидами.
      6. Используйте щипцы Грефе, чтобы инвертировать и возбуждать агарозные микроформы, чтобы выпустить органоиды в окружающую среду. Подтвердите выделение органоидов из агарозных микроплесеней под микроскопом.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если первичные соматические клетки яичников недостаточно агрегированы, органоиды могут не оставаться целыми при удалении из агарозных микроформ. Сборка органоидов может занять 1–3 дня, в зависимости от штамма и возраста мышей, из которых были выделены соматические клетки яичников.
      7. Удалите пустые агарозные микроформы с помощью щипцов Graefe и переместите среду с органоидами в микроцентрифугальные трубки с помощью пипетирования.
      8. Центрифугуйте органоиды при 300 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
      9. Под расщепляющим микроскопом удалять супернатант с помощью пипетирования, оставляя 50–75 мкл среды с органоидами.
      10. Удалите уравновешенные микроформы из инкубатора и убедитесь, что они ориентированы так, чтобы камера посева клеток была направлена вверх.
      11. Удалите среду из камер посева клеток с помощью щипцов Graefe или пипетированием.
          ПРИМЕЧАНИЕ: В скважинах не должно быть более 500 мкл среды, чтобы камеры посева микроформ можно было опустошить.
      12. Органоиды напрямую переносят в камеру посева каждой новой агарозной микроформы с помощью пипетирования. Верните пластину с 24 лунками в инкубатор.
      13. Через 1–2 часа добавьте дополнительно 250 мкл нужного материала по внешней стороне агарозных микроплесеней, стараясь не нарушать камеры посева клеток.

Рисунок 6: Ключевые типы клеток яичников сохраняются в соматических органоидах яичников. (A) Репрезентативные изображения (i) запечатывания микроплесени агарозой в конце культуры, (ii) неразрезанной микроформы и (iii) разрезанной микроформы, встроенной в парафиновый блок. Микроколодцы можно визуализировать в (iv) срезах, а наличие органоидов внутри секционных микроформ может быть (v) подтверждено под микроскопом до (vi) гистологического окрашивания. (B) Репрезентативные изображения срезов яичников мыши и соматических органоидных срезов яичников после иммуногистохимического окрашивания с использованием антител против Виментина, F4/80, Foxl2 и 3β-HSD. Шкала = 20 мкм. Сокращения: H&E = гематоксилин и эозин. Эта цифра была адаптирована с разрешения Дипали и ^др.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Совместная культура соматических органоидов яичников с фолликулами и клетками рака яичников. (A) Секреция органоидных цитокинов измерялась по агарозной микроплесени на 5-й день культуры и нормализована на условную среду из агарозных микроплесеней без органоидов. N = 4 агарозных микроплесени. (B) Репрезентативные световые изображения фолликулов яичников на днях 0, 4 и 8 культуры с (контрольными) органоидами или без них и (i) схема парадигмы ко-культуры. Масштабные полосы = 400 мкм. Количественная оценка (ii) выживаемости фолликулов и (iii) роста за 8 дней культуры с (контрольными) органоидами или без них. Данные представлены как среднее ± SD. Некоторые полоски ошибок слишком малы, чтобы их можно было визуализировать. N = 56 фолликулов на группу. **P < 0.01. (C) Репрезентативные световые (верхние) и флуоресцентные (внизу) изображения первичных соматических клеток яичников, культивируемых в соотношении 10:1 с маркированными красными флуоресцентными белоковыми клетками яичников (OVCAR8-RFP) в органоидах на 1, 3 и 5 день культуры. Масштабные полосы = 400 мкм. Сокращение: RFP = красный флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

6. Советы по устранению неполадок

1. Проблема 1: Количество изолированных первичных соматических клеток яичников ниже, чем ожидалось.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если фрагменты яичниковой ткани постоянно меньше 1 мм или не видны глазом после ферментативного переваривания, количество выделенных клеток может быть низким из-за снижения жизнеспособности из-за переварения. Если после ферментативного переваривания фрагменты ткани яичников больше 1 мм, количество выделенных клеток может быть низким из-за недостаточного переваривания яичников.
   1. Если после ферментативного расщепления фрагменты ткани яичников больше 1 мм, следуйте шагам 6.1.1.1–6.1.1.1.2.
      1. Убедитесь, что коллагеназа IV и DNase I находятся в рекомендуемом сроке хранения и не потеряли ферментативную активность из-за неправильного хранения или, в случае DNase I, повторяющихся циклов замораживания и оттаивания.
      2. Увеличить количество повторного пипетирования ткани яичника, уменьшить размер отверстия кончика p1000, если он был вырезан, чтобы сделать отверстие шире, и/или увеличить время инкубации в ЭМ.
   2. Если после ферментативного расщепления фрагменты яичниковой ткани стабильно значительно меньше 1 мм, уменьшите количество повторного пипетирования яичниковой ткани, увеличьте размер отверстия p1000 путём разрезания для расширения отверстия и/или уменьшите общую инкубацию в ЭМ.
2. Проблема 2: более ~25% литых агарозных микроформ имеют дефекты
   1. Убедитесь, что силиконовая отливка свободна от остаточных агароз и мусора. При необходимости промывайте силиконовые слепки в PBS и повторно стерилизуйте с помощью автоклава. При необходимости повторно нагрейте 1% агарозу, используемую для литья, так как агароза, которая затвердевает, может неравномерно заполнить силиконовый отливок и/или привести к образованию пузырьков.
   2. После пипетирования в силиконовый отливок агарозе дайте агарозе полностью затвердеть, так как преждевременное удаление агарозной микроформы из отливки может привести к нарушению микроколодцев.
   3. Убедитесь, что силиконовые отливки не недозаполнены, так как это может снизить структурную целостность агарозной микроформы, что приводит к повреждениям при сгибании силикона для удаления агарозной микроформы.
   4. Кроме того, производитель силиконовых отливок рекомендует не более 12 раз наносить их в автоклав. Если силиконовый гипс подвергся чрезмерной стерилизации, замените его.
3. Проблема 3: Органоиды не образуются более чем в 10% микроколодцев
   1. Убедитесь, что силиконовые отливки не переполнены при литье агарозных микроформ, так как это может привести к неправильному распределению клеток в микроколодцах, отдавая предпочтение центральным микроколодцам агарозной микроформы по сравнению с внешними микроколодцами.
   2. Избегайте образования пузырьков при подаче клеточной суспензии в камеру посевных клеток агарозных микроформ, так как пузырьки могут нарушать распределение клеток в микроколодцах.
   3. При необходимости начинайте с суспензии более 75 мкл ячеек (при плотности 3,33 × 10⁶ живых ячеек на 1 мл) на микроформу, чтобы избежать образования пузырьков из-за недостатка объёма кончика пипетки.
   4. Увеличьте интервал между засеянием клеток и добавлением яичниковой органоидной среды на внешнюю сторону агарозной микроплесени, чтобы обеспечить достаточное время для оседания клеток в микроколодцы.

Результаты

Для определения клеточного состава соматических органоидов яичников мы провели иммуногистохимию срезов органоидной ткани после 6 дней культуры с использованием антител против ключевых типов клеток яичников. Органоиды содержали виментин-положительные фибробласты, F4/80-положительные макрофаги, а также популяции стероидогенных клеток (рисунок 6B)¹⁹. Мы использовали антитело против Foxl2 для маркировки гранулезных и гранулезно-лютеиновых...

Обсуждение

В этой статье описаны методы выделения первичных соматических клеток яичников мыши из фракции яичника, обогащённой стромой, таким образом, чтобы сохранить гетерогенность соматического компартмента яичника. Первичные соматические клетки яичников мыши могут культивироваться в двумерном монослое или использовать для получения соматических органоидов яичников с помощью микроформ агарозы без каркасов. Микроформы агарозы содержат 96 микроскважин для образования органоидов и помещаются в одну я...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0.2 μm, Polyethersulfone syringe filter	Corning	431229
1.5 mL microcentrifuge tubes	MIDSCI	PR-MCT15
100 mL glass beaker	Fisherbrand	FB100100
100 mm Petri dishes	Corning	351029
15 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	339651
24-well plates (TC-treated)	Corning	353047
28-gauge insulin needles	Exel International	26027
35 mm Petri dishes	Corning	351008
3β-HSD antibody	Cosmo Bio	K0607	1:1000
4% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	1574100
40 µm cell strainer	Corning	431750
45 mm watch glass	Electron Microscopy Sciences	7054345
50 mL concial tubes	ThermoFisher Scientific	339652
60 mL sterile syringe	Air-Tite	ML60
60 mm TC-treated plates	Corning	353037
6-well plates (TC-treated)	Corning	353046
Agarose	Hoefer	GR140-500	Gel strength >1200 g/cm2; Gel Temperature 36 °C
Autoclave sterilization pouch	Fisherbrand	01-812-55
Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG	Vector Laboratories	BA-9200-1.5	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG	Vector Laboratories	PK-6101	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rat IgG	Vector Laboratories	BA-9400-1.5	1:100
Bluing reagent	Fisherbrand	23-245681
Centrifuge with swing bucket rotor for 50 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	Sorvall X1R Pro-MD
Class II biosafety cabinet	The Baker Company	SG403A
Cleaved Caspase-3 (CC3) antibody	Cell Signaling Technology	9579T	1:250
CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	Heracell VIOS 160i CO2 Incubator
Collagenase, Type IV, powder	Gibco, Fisher Scientific	17-104-019
C-Series Mouse Cytokine Antibody Array 3 Kit	RayBiotech	AAM-CYT-3-8
Cytoseal XYL	Epredia	83124
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Millipore Sigma	DN25-100MG	Dnase I
Dissecting microscissors	World Precision Instruments	WPI-14003
Dissecting scissors	World Precision Instruments	WPI-15922
Dissection microscope	Leica	MZ9.5, S9 series
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco, Fisher Scientific	14-190-250	pH 7.0–7.3
Eosin	Fisherbrand	23-314631
F4/80 antibody	Bio-Rad	MCA497G	1:50
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States	Gibco, ThermoFisher Scientific	10082147
Fine-tipped dissecting forceps	World Precision Instruments	WPI-14098
FOXL2 antibody	Abcam	ab246511	1:200
Graefe Forceps	Fine Science Tools	1105010
Hematoxylin	EK Industries	EKI 47971GL
Hemocytometer	MedOne	DHCN015
Imaging System	ThermoFisher Scientific	EVOS FL Auto
IntestiCult Organoid Growth Medium (Mouse)	STEMCELL Technologies	06005	Basal medium, Supplements 1 and 2
Laminar flow hood	IVFtech	IVFtech sterile workstation
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco, Fisher Scientific	11415114
Microscope slides	Mercedes Scientific	MER 7255/90/WH/CC
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids	Millipore Sigma	Z764043-6EA	Silicone casts for agarose micromolds
Modified Davidson's Fixative	Electron Microscopy Sciences	6413350
OVCAR8-RFP cells			Gift from Joanna Burdette PhD, University of Illinois Chicago
Penicillin-Streptomycin	Millipore Sigma	P4333-100ML
Picrosirius Red staining solution	StatLab	STPSRPT
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Gibco, Fisher Scientific	A1049101
Tabletop centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430 R
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco, ThermoFisher Scientific	25300054
Vimentin antibody	Cell Signaling Technology	5741S	1:100
αMEM, GlutaMAX Supplement, no nucleosides	Gibco, Fisher Scientific	32561102