Прогресс исследований стратегий оценки эффективности восстановления повреждений ДНК

Xiao Liu; Yiwei Zhu; Ling Li; Siyu Hang; Sipei Wu; Song-Bai Liu

doi:10.3791/71031

Обзорная статья

Прогресс исследований стратегий оценки эффективности восстановления повреждений ДНК

DOI:

10.3791/71031

⸱

23 июня 2026 г.

Xiao Liu^*¹^,² , Yiwei Zhu^*³ , Ling Li¹^,² , Siyu Hang¹ , Sipei Wu⁴ , Song-Bai Liu¹^,²

¹Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, ²School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, ³Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, ⁴Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тесты на восстановление повреждений ДНК можно в целом разделить на три группы: клеточные функциональные анализы, in vitro биохимические тесты и молекулярные маркерные анализы. Эти подходы позволяют качественно или количественно оценивать эффективность ремонта по нескольким путям восстановления повреждений ДНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточная геномная ДНК постоянно подвергается воздействию эндогенных и экзогенных факторов, вызывающих различные формы повреждения ДНК. В клетках млекопитающих ежедневное повреждение ДНК может достигать 10⁴–10⁵ поражений на клетку. Повреждение ДНК, сохраняющееся в S-фазе, может привести к мутациям. Когда такие мутации возникают в онкогенах, генах-супрессорах опухолях или генах, участвующих в пролиферации клеток, они могут способствовать клеточной трансформации и канцерогенезу. Поэтому восстановление повреждений ДНК играет ключевую роль в поддержании геномной стабильности и предотвращении развития рака. Оценка способности к восстановлению ДНК лучше всего достигается путем измерения функциональной активности систем репарации ДНК. Пути восстановления повреждений ДНК и их эффективность имеют большое значение для разработки химиотерапевтических препаратов, валидации функций генов и терапии рака. Соответственно, исследование эффективности восстановления отдельных путей восстановления повреждений ДНК имеет важное теоретическое и практическое значение. В этом обзоре представлены основные пути восстановления повреждений ДНК, методы оценки эффективности ремонта, а также преимущества и ограничения этих подходов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Система восстановления повреждений ДНК — это критически важный клеточный защитный механизм, который поддерживает геномную стабильность, снижая частоту мутаций и подавляя^{канцерогенез 1}. Различные виды повреждений ДНК восстанавливаются с помощью различных, но взаимосвязанных путей^{ремонта 2}. Например, несоответствия баз, возникающие во время репликации ДНК, корректируются с помощью ремонта несоответствий (MMR), тогда как химически модифицированные основы, такие как алкилированные основы, в основном восстанавливаются с помощью эксцизионного восстановления баз (BER⁾³. Ультрафиолетовые (УФ)-индуцированные 6-4 фотопродукта и массивные нуклеотидные аддукты, образующиеся определёнными химическими агентами, удаляются с помощью нуклеотидного эксцизионного ремонта (NER). Повреждение межцепочной ссылки (ICL) восстанавливает за скоординированную активность белков, связанных с путём анемии^{Фанкони 4}. Одноцепочечные разрывы (SSB) восстанавливаются по пути одноцеточного ремонта (SSBR), тогда как двухцеточные (DSB) в основном восстанавливаются путём негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологичной рекомбинации (HR). В большинстве случаев сложные поражения ДНК разрешаются через скоординированные взаимодействия между несколькими путями восстановления^{ДНК 5}.

Оценка повреждения ДНК и эффективности восстановления в клетках обычно основывается на сочетании экспериментальных подходов, включая кометный анализ, иммунофлуоресценцию (IF), вестерн-блоттинг (WB), реактивацию клеток хозяина (HCR) и плазмидные тесты на ремонте. Эти методы оценивают повреждение и восстановление ДНК путём обнаружения разрывов цепочек ДНК, маркеров повреждения ДНК и экспрессии или локализации белков, связанных с^{ремонтом 6}. Однако точная количественная оценка эффективности восстановления клеток обычно требует динамических тестов на основе вызовов. В этих подходах экспериментально индуцируются специфические поражения ДНК, а клетки берутся в последовательное время для мониторинга формирования и устранения сигналов повреждения. Сравнение остаточных уровней повреждений со временем относительно начальной нагрузки позволяет количественно оценить кинетику ремонта и функциональность пути.

Для систематического сравнения характеристик и применений доступных в настоящее время тестов эффективности восстановления повреждений ДНК этот обзор суммировал основные методы обнаружения по пяти параметрам: специфичность поражения/субстрата, аналитическая разрешающая способность, чувствительность, количественные возможности и требования к приборам (Таблица 1). Данный обзор направлен на предоставление практического методологического руководства для выбора подходящих подходов к изучению путей восстановления повреждений ДНК в базовых, трансляционных и клинических исследованиях.

Метод обнаружения	Специфичность поражения/субстрата	Аналитическое разрешение	Порог чувствительности/обнаружения	Количественный и качественный результат	Требования к приборам
Вестерн блот	CPD, 6-4PP, репарационные белки (например, MGMT, RAD51)	Население	Умеренный	Полуколичественные	Электрофорез белков, перенос мембран, система хемилюминесцентной визуализации
Иммунофлуоресценция	CPD, фокусы DSB (например, γ-H2AX, RAD51)	Одноячейка	Умеренный	Полуколичественные	Флуоресцентный микроскоп
HPLC-MS/MS	CPD, 6-4PP, окисляющее и алкилированное повреждение оснований	Население/In vitro	Чрезвычайно высокий	Количественное	HPLC-MS/MS
Анализ активности ферментов MGMT	Повреждения алкилирования O⁶-meG	Население/In vitro	Высокий	Количественное	Считыватель микропластин
Кометный анализ	SSB, DSB, окисленные основания (с предварительным лечением FPG/OGG)	Одноячейка	Высокий	Количественное	Флуоресцентный микроскоп/электрофорезная система
Анализ разреза	Участки AP, разрезы NER, разрезы BER	Население/In vitro	Высокий	Количественное	Гелевая визуализация, радиомаркировка/обнаружение флуоресценции
Восстановленная система ремонта	Повреждения базы, специфичные для конкретных объектов, AP-локации, разрывы нити	In vitro	Высокий	Количественное	Гель-электрофорез, флуоресценция/обнаружение МС
Плазмидный анализ восстановления	Повреждения, специфичные для конкретного места	Население	Умеренный	Количественное	Считыватель микропластин, потоковый цитометр, подсчёт колоний
Анализ репортёров	Повреждения, специфичные для конкретного места; BER, NER, HR, NHEJ, MMR	Население	Высокий	Количественное	Считыватель микропластин, потоковый цитометр, флуоресцентный микроскоп
HCR/FM-HCR	УФ-повреждения, платиновые перекрёстные связи, повреждения по конкретному месту	Население	Высокий	Количественное	Потоковый цитометр, детектор флуоресценции/хемилюминесценции
RADD	Широкоспектральное повреждение ДНК	Одноячейка	Чрезвычайно высокий	Количественное	Одномолекулярный флуоресцентный микроскоп
qPCR	УФ-повреждения, цепочные поражения	Население	Умеренный	Количественное	Инструмент qPCR в реальном времени
Обнаружение MSI	Микросателлитная нестабильность, связанная с дефицитом MMR,	Население	Умеренный	Качественные	ПЦР-прибор/капиллярный электрофорез
DR-GFP/EJ5-GFP	Ремонт DSB при поддержке HR и NHEJ	Население	Высокий	Количественное	Потоковый цитометр/флуоресцентный микроскоп
БЛАГОСЛОВЕНИЕ/БЛАЖЕНСТВО	Геномное отображение DSB	Одноячейка	Чрезвычайно высокий	Количественное	Секвенсор с высокой пропускной способностью
iPOND	Белки DDR на репликационных вилках/восстановление, связанное с TLS	Форк/протеом репликации	Высокий	Полуколичественные	Платформа масс-спектрометрии/секвенирования

Таблица 1: Систематическое сравнение методов обнаружения эффективности восстановления повреждений ДНК. Сравнение широко используемых методов оценки эффективности восстановления повреждений ДНК по нескольким путям ремонта. Таблица суммирует специфичность поражения или субстрата, аналитическую разрешительность, чувствительность, количественные возможности и требования к инструментам для каждого анализа, включая биохимические, молекулярные и клеточные подходы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обзор и перспектива

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Прямой ремонт (DR)

Прямой ремонт (ДР) — это самая простая форма ремонта ДНК, которая означает прямое восстановление повреждённой ДНК без удаления оснований или^{нуклеотидов 7}. DR в первую очередь восстанавливает два основных типа поражений ДНК. Первый — повреждение циклобутан-пиримидинового димера (CPD), вызванное ультрафиолетовым (УФ) излучением. У многих организмов фотолиаза распознаёт и связывает пиримидиновые димеры. При воздействии видимого света фотолиаза активируется, напрямую обращает повреждения ДНК, а затем отделяется от молекулы ДНК. Этот механизм фотореактивации особенно важен у растений и низших организмов. Однако плацентарные млекопитающие, включая человека, не имеют функциональной фотолизы и поэтому не могут осуществлять фотореактивацию. В результате повреждение КПР, вызванное УФ-воздействием, в человеческих клетках восстанавливается преимущественно за счёт нуклеотидного эксцизионного восстановления (NER)⁸.

Второй основной тип повреждений, восстанавливаемых с помощью DR, — это базовый урон от алкилирования. Ремонт осуществляется с помощью алкилтрансферазы O6-алкилгуанин-ДНК (AGT), также известной как метилтрансфераза^{O6-метилгуанин-ДНК} (MGMT). Этот фермент переносит алкильные группы с позиции^{O 6} остатков гуанина на себя, тем самым непосредственно восстанавливая повреждённое основание ДНК.

Методы определения эффективности DR

Обнаружение эффективности ремонта повреждений CPD, вызванных ультрафиолетовым (УФ) излучением
1. Тест Western blot (WB) для обнаружения изменений в содержании CPD
  Используя антитела, специфичные к CPD, исследователи могут обнаружить изменения в количестве CPD в разные временные моменты после ультрафиолетового облучения и оценить эффективность восстановления по уровню остаточного повреждения. Более высокая эффективность ремонта соответствует более быстрому удалению CPD. Обнаружение CPD на основе WB — классический и эффективный подход к оценке активности репарации ДНК; однако существуют и некоторые ограничения. Во-первых, анализ измеряет средние уровни повреждений между популяциями клеток и, следовательно, не имеет разрешения на одну клетку. Во-вторых, и что важнее, анализ не может различать пути ремонта. Поскольку CPD в человеческих клетках в основном восстанавливаются с помощью NER, один анализ WB не может отличить, отражает ли наблюдаемая активность ремонта, опосредованного фотолиазой, или активность NER, без дополнительного экспериментального контекста.
2. Динамика динамики фокуса при позиционировании иммунофлуоресценции (ИФ)
  Клетки, подвергшиеся ультрафиолетовому облучению и фоторепарации, могут быть окрашены с помощью специфических к CPD-антителам, а изменения в ядерных очагах CPD можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии. Количественный анализ образования и очистки очагов CPD позволяет оценить способность к восстановлению ДНК как на популяционном, так и на уровне отдельных клеток. Скорость исчезновения очагов КПД напрямую отражает эффективность ремонта. IF обеспечивает пространственную и временную визуализацию динамики ремонта внутри отдельных клеток и позволяет обнаруживать гетерогенность между клетками. Однако флуоресцентные сигналы подвержены затушению, и количественный анализ часто основан на ручном подсчёте, что вводит субъективность. В клетках млекопитающих, не имеющих фотореактивационной активности, этот метод в первую очередь отражает эффективность восстановления, опосредованного NER.
3. Высокоэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС/МС) для количественного анализа CPD
  Экстракционная ДНК ферментативно расщепляется в нуклеозиды, после чего CPD отделяются от нормальных нуклеозидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Затем количественный анализ проводится с помощью тандемной масс-спектрометрии (MS/MS). Эффективность ремонта определяется путем сравнения количества CPD до и после^{ремонта 9}. HPLC-MS/MS обеспечивает чрезвычайно высокую специфичность и чувствительность на уровне пикомоляра; Однако этот метод требует дорогостоящих приборов, сложной подготовки образцов и не отражает состояние восстановления целых клеток. В образцах человеческих клеток измеренный результат восстановления преимущественно отражает активность NER.
Эффективность восстановления базовых повреждений ДНК, вызванного алкилирующими агентами
1. Анализ активности ферментов MGMT
  Эффективность восстановления повреждений ДНК, вызванного алкилирующими агентами, обычно оценивается путём измерения активности^{MGMT 10}. Радиоактивно метилированные субстраты ДНК используются для мониторинга переноса метиловых групп из повреждённой ДНК в белок MGMT, что позволяет количественно оценивать эффективность ремонта.
2. Анализ генов для выявления эффективности восстановления^O6-meG
  Для оценки эффективности ремонта могут быть построены репортерные плазмиды, содержащие поражения O6-метилгуанина (O^6-meG). Интродукированное поражение подавляет экспрессию репортерных генов до тех пор, пока восстановление, опосредованное MGMT, не восстановит активность репортеров. Эффективность восстановления затем количественно измеряется уровнем экспрессии репортерских генов. Анализы репортерских генов обеспечивают интуитивную и количественную оценку активности восстановления в живых^{клетках 11}. Однако эти анализы требуют построения специфических для поражения векторов и включают относительно длительные экспериментальные^{циклы 12}.
Эффективность восстановления повреждений при обнаружении разрыва цепи
1. Анализ кометы
  Кометный анализ, также известный как одноклеточный гель-электрофорез (SCGE), является чувствительным методом обнаружения разрывов цепочек ДНК на уровне одной клетки. Повреждённые фрагменты ДНК мигрируют из ядра во время электрофореза, образуя хвосты, похожие на кометы, тогда как целая ДНК остаётся концентрированной в ядерной области. Параметры, такие как длина хвоста кометы, содержание ДНК хвоста и момент хвоста, можно количественно измерить с помощью флуоресцентной микроскопии и программного обеспечения для анализа изображений. Эти показатели позволяют количественно оценивать степень разрыва цепи ДНК. Сравнивая профили комет сразу после индукции повреждений ДНК с теми, что получены после ремонта, можно оценить^{эффективность ремонта 13}.
  Анализ Comet обладает несколькими преимуществами, включая простоту работы, относительно низкую стоимость, высокую чувствительность и одноэлементное разрешение. Дальнейшее совершенствование этого метода привело к разработке ферментно-модифицированных вариантов и кометных in vitro тестов восстановления ДНК, которые можно использовать для оценки активности BER и NER.

2. Ремонт с удалением базы (BER)

Репарация с удалением оснований (BER) — это высококонсервативный путь восстановления ДНК, который в основном удаляет мелкие основаниевые поражения, возникающие в результате окисления, алкилирования и^{деаминации 14}. BER имеет значительное механистическое пересечение с одноцепочным ремонтом разрывов (SSBR), и некоторые события SSBR считаются продолжением BER. В соответствии с длиной ремонтного патча BER делится на короткие BER (SP-BER) и длинные BER (LP-BER).

BER инициируется ДНК-гликозилазами, которые распознают и удаляют повреждённые основы, разрывая N-гликозидную связь между основанием и дезоксирибозой, образуя тем самым апуриные/апиримидиновые (AP) сайты¹⁵. AP эндонуклеаза 1 (APE1) затем расщепляет ДНК-магистраль на 5′-стороне участка AP, образуя термины 3′-OH и 5′-дезоксирибозного фосфата (dRP). Во время SP-BER группа dRP удаляется, ДНК-полимераза β (Polβ) заполняет зазор в однонуклеотидном составе, и лигаза ДНК III (LigIII) завершает связывание.

Восстановление одноцепочечных разрывов, вызванных алкилированием, содержащих 3′-блокированные концы, происходит по схожему механизму, но требует дополнительной обработки концов. Полинуклеотидкиназа 3′-фосфатаза (PNKP) сначала удаляет аномальные 3′-концы, чтобы получить правильную 3′-OH группу. Polβ затем заполняет недостающий нуклеотид, а LigIII герметизирует зарез для полного ремонта.

Методы определения эффективности BER

Ферментно-модифицированный анализ кометы
Ферментно-модифицированный анализ Comet расширяет стандартный анализ Comet за счёт включения специфических для поражения ферментов для ремонта. Эти ферменты распознают и расщепляют повреждённые основания, превращая иначе незаметные поражения в обнаруживаемые разрывы цепотей. Интенсивность хвоста кометы отражает уровень повреждения^{ДНК 16}˒¹⁷.
Для оценки эффективности BER используется формамидопиримидиновая ДНК-гликозилаза (FPG) или её млекопитающийся гомолог 8-оксогуаниновая ДНК-гликозилаза (OGG1) для превращения окисленных оснований в одноцепочечные разрывы, которые затем анализируются с помощью анализа^{Comet 18}.
Анализ разреза
Анализ разреза является основным методом in vitro для оценки активности BER. ДНК-субстраты, содержащие AP-участки, инкубируются с помощью очищенных ферментов или клеточных экстрактов, а доля расщепленных субстратов ДНК количественно измеряется. Этот анализ напрямую отражает активность разреза, опосредованную APE1, и обеспечивает высокую специфичность и чувствительность, минимизируя помехи из внутриклеточной^{среды 19}.
Однако анализ разреза не полностью воспроизводит активность BER в живых клетках, поскольку не может оценить динамическую регуляцию всего процесса ремонта, включая распознавание поражения, удаление оснований, расщепление AP-сайта, синтез ДНК и лигирование²⁰.
Восстановленная система ремонта
Восстановленная система ремонта — это экспериментальная платформа in vitro , которая восстанавливает пути ремонта ДНК с использованием очищенных белков ремонта. Эта система позволяет проводить детальный анализ молекулярных функций и взаимодействий отдельных репарационных белков и широко используется для механистических исследований и скрининга лекарств.
Для оценки эффективности BER очищенные гликозилазы, AP-эндонуклеазы, ДНК-полимеразы и лигазы последовательно инкубируются с повреждёнными ДНК-субстратами для восстановления распознавания, удаления, синтеза и лигации. Средства восстановления анализируются с помощью гель-электрофореза, флуоресцентной маркировки или масс-спектрометрии²¹. Хотя этот подход позволяет проводить высококонтролируемые механистические исследования, он не учитывает структуру хроматина или глобальную клеточную регуляцию активности^{восстановления 22}.
Плазмидный анализ восстановления
Тесты на основе плазмидного ремонта включают введение плазмид с определёнными поражениями ДНК в клетки хозяина или инкубацию с использованием клеточных экстрактов, содержащих ферменты ремонта, затем оценку эффективности ремонта с помощью репортерных тестов, проточной цитометрии или анализа формирования^{колоний 23}.
Для оценки эффективности BER плазмиды, содержащие окисляющее повреждение ДНК, инкубируются с клетовыми экстрактами и затем преобразуются в бактериальные штаммы, дефицитные для ремонта, такие как Escherichia coli. Эффективность ремонта оценивается по скорости формирования колоний.
Генетический анализ репортёров
Анализы репортерских генов косвенно оценивают эффективность репарации ДНК или регуляторную активность генов, измеряя восстановление экспрессии репортерских^{генов 24}. В этих анализах в репортерные конструкции включаются поражения ДНК или регуляторные элементы, а эффективность ремонта количественно оценивается через изменения активности репортёра после ремонта.
Для анализа BER в кодирующую область гена репортера люциферазы можно вставить поражение 8-оксоG. Если поражение остаётся неустранённым, перенос нарушается; Успешное восстановление восстанавливает экспрессию белка в полном размере. Неповреждённые плазмиды, такие как векторы люциферазы pRL-TK Renilla, часто используются в качестве внутреннего контроля.
Реактивация клеток хозяина (HCR)
Реактивация клеток хозяина (HCR) — это классический анализ, который косвенно оценивает эффективность ремонта ДНК, измеряя способность клеток хозяина восстанавливать экспрессию из повреждённых репортерских^{плазмид 25}. Плазмиды с определёнными поражениями, такими как УФ-индуцированные пиримидиновые димеры или химически индуцированные перекрёстные сшибы, трансфектируются в клетки-хозяина. Эффективность восстановления затем количественно измеряется экспрессией репортерских генов.
Анализы HCR обеспечивают высокую чувствительность и позволяют оценить активность восстановления по определённым типам поражений. Однако требуется эффективная трансфекция и подготовка качественных повреждённых плазмид. Основным ограничением традиционного ГЦР является то, что обработка плазмид агентами, повреждающими ДНК, часто приводит к появлению гетерогенных популяций поражений по всей плазмиде, что усложняет механистическую^{интерпретацию 26}.
Для устранения этих ограничений были разработаны анализы реактивации клеток хозяина на основе цитометрии потока (FM-HCR) с использованием локал-специфических плазмид с одиночным поражением. FM-HCR позволяет быстро проводить количественный анализ активности восстановления в живых клетках, хотя анализ требует специализированных приборов и имеет ограничения для одновременного механистического анализа нескольких путей^{BER 27}.
Также были разработаны анализы реактивации клеток хозяина бляшки (PL-HCR) на основе специфических для поражения субстратов BER для изучения механизмов BER в живых клетках (рисунок 1⁾²⁸. В этом подходе плазмиды, содержащие одно поражение^1,N 6-этеноаденина (εA), вводятся в клетки млекопитающих. После ремонта плазмидная ДНК извлекается, переваривается с помощью рестрикционных ферментов, превращается в E. coli и количественно измеряется с помощью анализа образования бляшек. Полностью восстановленные плазмиды линеаризируются после рестрикционного пищеварения и не могут образовывать бляшки, тогда как невосстановленные или неполностью восстановленные плазмиды остаются круговыми и образуют бляшки. Эффективность BER определяется количественной оценкой бляшек.
Обнаружение повреждений с помощью ремонта
Обнаружение повреждений с помощью восстановления (RADD) — это метод с использованием одной молекулы для выявления и количественной оценки повреждений^{ДНК 29}. В этом подходе ферменты восстановления, специфические для поражения, распознают и удаляют повреждённые основания, после чего ДНК-полимеразы включают флуоресцентно маркированные нуклеотиды в образовавшиеся зазоры. Молекулы ДНК затем визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии, что позволяет напрямую обнаруживать и количественно оценивать поражения ДНК (Рисунок 2)³⁰.
RADD обеспечивает высокочувствительный качественный и количественный анализ повреждения ДНК на уровне одной молекулы. Однако метод в первую очередь измеряет нагрузку на повреждение ДНК, а не напрямую оценивает кинетику восстановления или общую эффективность восстановления в популяциях клеток.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Реактивация клеток хозяина бляшки (PL-HCR). Круглая одноцепочечная ДНК M13mp18 с определённым поражением трансфектируется в компетентные клетки. После трансфекции клетки культивируются на агарных пластинах для образования бляшек. Репликативная форма ДНК M13 затем изолируется из бляшек, переваряется с помощью рестрикционных ферментов и анализируется с помощью гель-электрофореза для различия мутантных и диких продуктов и определения наличия восстановления поражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Обнаружение повреждений с помощью ремонта (RADD). Одноцепочечные промежутки, образующиеся при ремонте ДНК, заполняются нуклеотидами, мечеными биотином. Флуоресцентно маркированный авидин или стрептавидин затем используется для обнаружения инкорпорированных нуклеотидов, что позволяет количественно оценивать уровень повреждения ДНК с помощью флуоресцентного анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Восстановление эксцизии нуклеотидов (NER)

Нуклеотидная эксцизия (NER) — это основной путь восстановления ДНК, отвечающий за удаление крупных поражений ДНК, искажающих двойную спираль^{ДНК 31}. Субстраты NER включают УФ-индуцированные циклобутан-пиримидиновые димеры (CPD), 6-4 фотопродукта пиримидина-пиримидона (6-4 PP), окисляющие пуринные поражения, массивные химические аддукты и цисплатино-индуцированные внутрицепочечные^{сцепные связи 32}. Дефекты NER связаны с такими заболеваниями, как ксеродерма пигментоз, которая характеризуется высокой чувствительностью к ультрафиолету и повышенной восприимчивостью к раку.

NER состоит из двух основных подпутей: глобального генома NER (GG-NER⁾³³ и транскрипционно-связанного NER (TC-NER⁾³⁴. GG-NER обследует весь геном на наличие поражений, искажающих спираль, тем самым подавляя мутагенез и канцерогенез. В отличие от этого, TC-NER избирательно удаляет транскрипционно-блокирующие поражения из активно транскрипционных генов и является необходимым для поддержания целостности транскрипции. Дефекты TC-NER способствуют таким расстройствам, как синдром Кокейна и УФ-чувствительный^{синдром 35}.

Методы обнаружения эффективности NER

Анализ разреза
Анализ разреза оценивает эффективность NER, обнаруживая разрезы цепочек, введённые в местах повреждения ДНК белками восстановления. В этом анализе повреждённые субстраты ДНК, такие как УФ-облучённая ДНК с CPD, инкубируются с помощью репаративных белков или клеточных экстрактов, а продукты разреза затем^{обнаруживаются 36}.
Радиомаркировка или флуоресцентная маркировка могут использоваться для повышения чувствительности и обеспечения точного мониторинга активности^{разреза 37}. Анализ напрямую измеряет активность ключевых белков NER, отвечающих за распознавание и удаление повреждений. Однако успешная реализация требует подготовки высококачественных повреждённых субстратов и активных белковых экстрактов.
Анализ кометы по восстановлению ферментов
Эффективность NER также можно оценить с помощью ферментно-модифицированных комет-тестов. В этом подходе эндонуклеазу T4 V инкубируют с повреждёнными клетками для преобразования пиримидиновых димеров в обнаруживаемые одноцепочечные разрывы, которые затем анализируются с помощью кометного^{анализа 38}.
Количественная ПЦР с флуоресценцией в реальном времени (qPCR)
Количественное ПЦР в реальном времени (qPCR) косвенно оценивает эффективность восстановления ДНК, измеряя ингибирующие эффекты поражений ДНК на амплификацию^{ПЦР 39}. Во время анализа NER сначала используется ультрафиолетовое облучение для индуцирования пиримидиновых димеров. Эти поражения затрудняют прогрессирование ДНК-полимеразы и снижают эффективность амплификации, что приводит к увеличению значения порога цикла (Ct). После ремонта по пути NER целостность ДНК восстанавливается, а эффективность амплификации улучшается, что приводит к снижению значения Ct. Эффективность ремонта можно количественно измерить, сравнивая усиление до и после ремонта относительно неповреждённой внутренней управляющей^{области 40}.
Кроме того, qPCR может использоваться для оценки уровней экспрессии генов, участвующих в сигнальных и ремонтных путях повреждения ДНК, включая ATM, ATR, BRCA1, CDKN1A и XPC, что косвенно отражает способность к восстановлению ДНК⁴¹.
Реактивация клеток хозяина на основе потоковой цитометрии (FM-HCR)
Анализы FM-HCR используют плазмиды, содержащие локал-специфичные поражения, трансфицированные в клетки-хозяина, и количественно оценивают эффективность ремонта с помощью потокового цитометрического анализа интенсивности флуоресценции и доли флуоресцентных клеток (рисунок 3)⁴²^˒43. Повышенная интенсивность флуоресценции обычно отражает большую способность к восстановлению^{ДНК 44}˒⁴⁵.
Секвенирование восстановления эксцизии (XR-seq)
Секвенирование восстановления эксцизии (XR-seq) — это общегеномный метод картирования активности NER с разрешением одного нуклеотида. Этот метод избирательно обогащает и секвенирует повреждённые олигонуклеотиды, исключённые во время NER, тем самым создавая высококачественные карты репарационной активности по всему геному. XR-seq позволяет количественно анализировать эффективность ремонта и схемы распределения, связанных как с путями GG-NER, так и с TC-NER, и представляет собой значительный технологический прорыв в исследованиях NER.
Поскольку NER состоит из двух механистически различных подпутей и включает множество белков ремонта, для всесторонней оценки ремонтной активности требуется несколько комплементарных^{методов 46}˒⁴⁷. В дополнение к описанным выше методам, эффективность NER также оценивается с помощью вестерн-блоттинга, иммунофлуоресцентных анализов, плазмидных ремонтных тестов и репортерных генов.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Принцип обнаружения реактивации клетки-хозяина на основе цитометрии потока (FM-HCR). Плазмиды, содержащие четыре различных типа повреждения ДНК, котрансфицируются в культивированные клетки млекопитающих. Способность к восстановлению ДНК (DRC) впоследствии количественно оценивается с помощью потоковой цитометрии на основе интенсивности флуоресценции репортеров. ДРК, способность к восстановлению ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Исправление несоответствия (MMR)

Восстановление несоответствия (MMR) — это пострепликационный путь коррекции ошибок, отвечающий за устранение несоответствий баз, таких как ошибки G-T и A-C, а также небольших петель вставки-делеции, возникающих во время репликации^{ДНК 48}. MMR запускается, когда MutS распознаёт несовпадающие базы, после чего MutL привлекает факторы восстановления и экзонуклеазы для активации процесса^{ремонта 49}. Критическим этапом MMR является различение родительской и недавно синтезированной^{ДНК-цепи 50}.

У прокариотов различение цепочек достигается с помощью метилирования ДНК, которая отмечает родительскую цепь. У эукариот идентичность цепочек определяется через временные разрывы в недавно синтезированной ДНК и взаимодействия с пролиферирующим клеточным ядерным антигеном (PCNA). MMR значительно улучшает верность репликации и играет важную роль в поддержании геномной^{стабильности 51}. Дефекты MMR тесно связаны с множественными видами рака, включая синдром Линча.

Методы оценки эффективности MMR

Тестирование неустойчивости микросателлитов
Дефектный MMR приводит к неисправке ошибок скольжения репликации в микросателлитных локусах, что приводит к микросателлитной нестабильности (MSI). Тестирование MSI включает ПЦР-амплификацию представительных микросателлитных маркеров, а затем анализ фрагментов на основе капиллярного электрофореза. Нестабильность в нескольких локусах указывает на снижение активности MMR, тогда как стабильные микросателлитные профили указывают на нетронутую функцию MMR. Тестирование MSI обеспечивает высокую чувствительность и специфичность для выявления дефицита MMR; однако он остаётся косвенным показателем функции MMR и не оценивает количественно эффективность ремонта.
Репортерные плазмиды, содержащие определённые несоответствия или петли вставки-делеции, также могут использоваться для оценки эффективности MMR с помощью анализов репортерных генов. Кроме того, тесты Western blotting и иммунофлуоресценции, направленные на белки, связанные с MMR, могут давать косвенную оценку активности путей.

5. Ремонт двойного разрыва (DSB)

Разрывы двух цепочек (DSB) являются одними из самых цитотоксичных форм повреждения ДНК. Неточное восстановление DSB может привести к мутациям, делециям хромосом, транслокациям, геномной нестабильности и опухологенезу. Восстановление DSB в основном происходит за счёт гомологичной рекомбинации (HR) и негомологичного соединения концов (NHEJ), которые преимущественно действуют на разных фазах^{клеточного цикла 52}.

Методы оценки эффективности ремонта DSB

Анализ фокусов гамма-H2AX
Анализ фокусов γ-H2AX является одним из самых широко используемых методов косвенного обнаружения DSB. После образования DSB гистон H2AX быстро фосфорилируется на Ser139 для образования очагов γ-H2AX. Количество очагов γ-H2AX коррелирует с степенью образования DSB, а эффективность восстановления можно определить, отслеживая скорость исчезновения очагов со временем с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.
Этот анализ обладает несколькими преимуществами, включая высокую чувствительность, одноклеточное разрешение и устоявшиеся экспериментальные протоколы, что делает его центральным методом в исследованиях ответа на повреждение ДНК (DDR).
Благословение и БЛАЖЕНСТВО
BLESS (маркировка разрывов, обогащение стрептавидина и секвенирование) и BLISS (маркировка разрывов на месте и секвенирование) — это методы картирования DSB на уровне всего генома, основанные на метке in situ и высокопроизводительном секвенировании. Оба подхода идентифицируют DSB-сайты через прямое перемещение секвенирующих адаптеров на сломанные концы ДНК, что позволяет точную локализацию и количественную оценку DSB по всему геному. Эти методы также могут использоваться для оценки общей кинетики ремонта DSB.
Кроме того, специфические для DSB анализы репортерных генов могут количественно оценивать эффективность восстановления DSB и отличать восстановление, опосредованное HR, и восстановление, опосредованное NHEJ (рисунок 4). Однако, несмотря на то, что анализы γ-H2AX, BLESS и BLISS эффективно измеряют глобальную нагрузку DSB и кинетику ремонта, они не могут определить, произошёл ли ремонт именно через HR или NHEJ-пути.

figure-protocol-4
Рисунок 4: Репортерский генный анализ для восстановления двухцепочечного разрыва (DSB). DSB-репортерные плазмиды вводятся в целевые клетки. После соответствующего периода восстановления после трансфекции флуоресценция репортерного гена контролируется с помощью флуоресцентной микроскопии для оценки эффективности восстановления DSB. DSB, двойной перерыв. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

6. Восстановление гомологичной рекомбинации (HR)

Гомологичная рекомбинация (HR) — это высокоточный путь восстановления ДНК, который в основном функционирует во время фаз S и G2 клеточного цикла, когда неповреждённая сестринская хроматида доступна в качестве шаблона для^{ремонта 53}. После образования DSB комплекс MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) распознаёт концы ДНК и инициирует резекцию конца ДНК в сотрудничестве с CtIP⁵⁴. Этот процесс генерирует 3′ одноцепочечные навесы ДНК (ssDNA).

Полученная ssДНК изначально покрыта белком репликации A (RPA), который защищает ДНК от деградации нуклеазы и предотвращает формирование вторичных^{структур 55}. Впоследствии BRCA2 опосредует замещение RPA рекомбиназой RAD51, что приводит к образованию нуклеопротеиновой^{филамента RAD51 56}. Эта нить ищет гомологичные последовательности ДНК на сестринской хроматиде и способствует вторжению цепочек в гомологичный дуплексный шаблон ДНК, создавая структуру петли смещения (^{D-петля) 57}˒⁵⁸. Синтез ДНК и обмен цепями затем завершаются восстановление.

Эффективность HR может быть количественно оценена с помощью систем репортёров DR-GFP в анализах репортерских генов. В качестве альтернативы косвенная оценка может проводиться с использованием тестов Western blotting или иммунофлуоресценционных тестов, направленных на белки, связанные с HR.

7. Негомологичное соединение концов ДНК (NHEJ)

Негомологичное соединение концов (NHEJ) восстанавливает DSB без необходимости обширной гомологии последовательностей между концами ДНК⁵⁹. Вместо этого сломанные концы ДНК напрямую обрабатываются и связываются, что делает NHEJ по своей природе склонным к ошибкам путём ремонта. Поскольку концы ДНК могут деградировать до связывания, а концы несвязанных DSB могут быть соединены, NHEJ может привести к мутациям, делециям и перестановкам^{хромосом 60}.

Выделяются три основных формы негомологичного ремонта: классический NHEJ, одноцепочечное отжиг (SSA) и микрогомологическо-опосредованное соединение концов (MMEJ).

Классическая NHEJ
Классический NHEJ действует на протяжении всего клеточного цикла. Ku70/Ku80 гетеродимер сначала распознаёт и связывает концы^{DSB с 61}. Этот комплекс рекрутирует каталитическую субъединицу протеинкиназы (ДНК-PKcs), что приводит к активации сигнализации киназ и инициации NHEJ. Ферменты конечной обработки, включая нуклеазы и фосфатасы, впоследствии обрабатывают повреждённые концы ДНК до того, как комплекс XRCC4-ДНК-лигаза IV опосредует связывание концов ДНК⁶². Поскольку терминальная обработка часто приводит к потере нуклеотидов или неточному повторному соединению, NHEJ считается путём мутагенного^{ремонта 63}˒⁶⁴.
Одножилочное отжиг (SSA)
Одноцепочное отжиг (SSA) восстанавливает DSB, возникающие между повторяющимися гомологичными последовательностями. После образования DSB нуклеазы резецируют концы ДНК диаметром 5′, образуя удлинённые 3′ ssDNA навесы. RAD52 опосредует отжиг между комплементарными гомологичными^{повторами 65}. Впоследствии комплекс эндонуклеазы XPF-ERCC1 удаляет неспаренные ДНК-лоскуты, и комплекс SLX1-SLX4 также может участвовать в конечной обработке. ДНК-лигаза затем запечатывает оставшиеся промежутки. Поскольку последовательности, расположенные между гомологичными повторами, удаляются во время ремонта, SSA считается быстрым, но по своей сути мутагенным механизмом^{восстановления 66}.
Микрогомологично-опосредованное конечное соединение (MMEJ)
Микрогомологическое соединение концов (MMEJ), также известное как альтернативный NHEJ (Alt-NHEJ), является ещё одним ошибочным путём восстановления^{DSB 67}. В MMEJ короткие микрогомологичные последовательности, расположенные рядом с концами разрыва ДНК, используются для выравнивания сломанных концов ДНК перед восстановлением. После распознавания этих микрогомологичных областей концы ДНК соединяются посредством процесса, похожего на^{рекомбинацию 68}. Поскольку MMEJ опирается на очень короткие гомологичные последовательности, делеции и геномные перестановки часто происходят во время ремонта.
Эффективность NHEJ может быть количественно оценена с помощью репортерских систем EJ5-GFP в анализах репортерных генов. Альтернативно, активность восстановления может быть косвенно оценена с помощью анализа западного блотинга и иммунофлуоресцентного анализа белков, ассоциированных с NHEJ.

8. Ремонт межцепочной связи (ICL)

Межцепочные скрещённые связи (ICL) — это высокотоксичные поражения ДНК, которые ковалентно связывают две цепи двойной спирали ДНК, тем самым блокируя репликацию и транскрипцию ДНК. Восстановление ICL механистически сложно и в основном включает путь анемии Фанкони (FA) и^{NEIL3 69}.

В FA пути FANCM распознаёт ICL-поражения и способствует моноубиквитинации комплекса FANCI-FANCD2, тем самым активируя следующие репарационные^{белки 70}. Структуроспецифические нуклеазы затем разрезают ДНК рядом с перекрёстной связью, разделяя две цепи ДНК, и полученные DSB восстанавливаются через пути HR или NHEJ.

В пути NEIL3 ДНК-гликозилаза NEIL3 разрывает гликозидные связи, связанные с ICL-поражением, образуя AP-участки, которые впоследствии обходятся полимеразами синтеза транслезии (TLS^{) 71}. Поскольку ICL предотвращают отделение цепотей, необходимое для репликации и транскрипции, эти поражения сильно цитотоксичны и способствуют старению, нейродегенерации и развитию рака⁷²˒⁷³.

Эффективность восстановления ICL можно оценить с помощью плазмидных ремонтных тестов, репортерных генов, реактивационных клеток хозяина и систем восстановления in vitro .

9. Синтез транслезии (TLS)

Синтез транслезии (ТЛС) — это механизм толерантности к повреждению ДНК, который позволяет продолжать репликацию на неотремонтированных поражениях^{ДНК 74}. TLS в первую очередь включает специализированные ДНК-полимеразы, включая полимеразы κ, η, ι и ζ. Когда репликация ДНК замирает в повреждённых участках, TLS-полимеразы, обходя поражение и позволяют репликации продолжаться, тем самым сохраняя стабильность^{генома 75}.

В отличие от BER, NER, MMR, HR и NHEJ, которые напрямую удаляют или ремонтируют поражения ДНК, TLS не устраняет повреждения ДНК. Вместо этого он обходит неотремонтированные поражения во время репликации ДНК и поэтому классифицируется как механизм устойчивости к повреждениям, а не как канонический путь восстановления^{ДНК 76}.

TLS можно разделить на безошибочные и склонные к ошибкам пути обхода. Безошибочная TLS вводит нужный нуклеотид напротив поражения, тогда как ошибочная TLS часто вводит неправильные нуклеотиды и способствует мутагенезу. Склонный к ошибкам TLS считается важным механизмом, с помощью которого канцерогены окружающей среды вызывают геномные мутации. Следовательно, модуляция ошибочно-уязвимых путей TLS может представлять собой потенциальную стратегию профилактики и терапии рака⁷⁷.

Методы оценки эффективности TLS

Изоляция белков на зарождающейся ДНК (iPOND)
Изоляция белков на зарождающейся ДНК (iPOND) — это метод, используемый для анализа белков, связанных с недавно синтезированной ДНК, на застопорившихся вилках репликации. Поскольку активность TLS часто происходит на застой, iPOND позволяет динамически анализировать рекрутацию и сборку TLS-полимераз и белков ответа на повреждение ДНК (DDR) во время репликационного стресса. Таким образом, этот метод можно использовать для оценки активности TLS и процессов восстановления, связанных с репликацией.
Эффективность TLS также может оцениваться с помощью репортерных плазмид, содержащих специфические TLS поражения ДНК в анализах репортерных генов. Кроме того, тесты Western blotting и иммунофлуоресценции, направленные на белки, связанные с TLS, могут давать косвенную оценку активности путей.

10. Вопросы контроля качества и воспроизводимости в экспериментальном проектировании

Биологическая и техническая репликация
Чёткое различие между биологическими и техническими репликами крайне важно для обеспечения надёжности и воспроизводимости в исследованиях репарации ДНК. В целом, для каждого эксперимента следует включать как минимум три независимых биологических реплики, тогда как количество технических репликий определяется в зависимости от вариабельности платформы обнаружения.
Для одноклеточных анализов, таких как кометный анализ и иммунофлуоресцентный анализ фокусов, следует анализировать не менее 50–100 клеток на биологическую реплику, чтобы минимизировать смещение выборки. В репортерных анализах на основе цитометрии потока, включая DR-GFP и FM-HCR, для обеспечения статистической надёжности необходимо собрать минимум 10 000 событий живых клеток на выборку.
Стратегия стандартизации
Точное количественное сравнение эффективности ремонта между различными образцами или экспериментальными партиями требует строгих процедур нормализации для минимизации систематических вариаций, возникающих из-за различий в эффективности трансфекции, жизнеспособности ячеек, загрузке образцов и производительности приборов. Распространённые стратегии нормализации включают следующие:
1. Котрансфекция нормализационных плазмид
  В анализах HCR, репортерных и плазмидных ремонтных анализах рекомендуется совместная трансфекция с нормализационной плазмидой, не затронутой повреждением ДНК. К наиболее распространённым контролям относятся плазмиды люциферазы pRL-TK Renilla или конститутивно экспрессированные векторы GFP. Эффективность ремонта нормализуется путём вычисления отношения между сигналом экспериментального репортера и сигналом репортера управления.
2. Нормализация с помощью белков Housekeeping или тотального окрашивания белков
  В анализах Western Blot, оценивающих экспрессию восстановленных белков или остаточный уровень CPD, нормализация должна проводиться с помощью белков Housekeing, таких как GAPDH, β-актин или гистон H3, либо методами тотального окрашивания белков, включая окрашивание Ponceau S или REVERT.
3. Неповреждённые органы управления
  В тестах на восстановлении на основе qPCR неповреждённые геномные участки должны быть коамплифицированы как внутренние контроли, а относительные уровни повреждений рассчитываются методом ΔCt. Аналогично, анализы HCR должны включать неповреждённые контроли плазмид, представляющие максимальную экспрессию репортеров, что позволяет выражать эффективность ремонта относительно неповреждённых эталонных плазмид.
4. Нормализация числа клеток
  В анализах на основе проточной цитометрии, включая FM-HCR и DR-GFP, необходимо анализировать равное количество жизнеспособных клеток по образцам. Эффективность восстановления следует впоследствии отражать как процент положительных клеток или относительные изменения интенсивности флуоресценции.
Кинетическая размерность измерения эффективности ремонта
Репарация ДНК — это динамический процесс, и измерения, полученные в одной точке времени, могут не различать задержку восстановления и полный недостаток пути. Поэтому настоятельно рекомендуется использовать экспериментальные проекты с временным курсом.
После индукции повреждения ДНК образцы следует собирать в несколько последовательных временных точек, таких как 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 и 24 часа, чтобы отслеживать накопление и очистку маркеров повреждений или средств восстановления. Кинетика исчезновения сигнала предоставляет важную информацию о скорости ремонта, целостности пути и общей эффективности ремонта.
Исправление множественного тестирования гипотез:
Высокопроизводительные и мультиплексированные подходы часто предполагают одновременный анализ нескольких путей ремонта или экспериментальных условий, что увеличивает риск ложноположительных результатов из-за множественных статистических сравнений. Примеры включают одновременное оценивание деятельности BER, NER, HR и NHEJ с использованием анализов FM-HCR; геномный анализ DSB с использованием BLESS или BLISS; а также анализ экспрессии генов восстановления ДНК на основе qPCR-матриц.
Соответственно, методы статистической коррекции для тестирования множественных гипотез должны быть заранее определены при проектировании экспериментов. Выбранные методы коррекции и скорректированные пороги значимости должны быть чётко представлены в разделах «Материалы и методы» и статистический анализ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Выводы

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Точное обнаружение и количественный анализ процессов восстановления повреждений ДНК необходимы для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе репарации ДНК, оценки биологических эффектов воздействия окружающей среды и оценки терапевтических^{реакций 78}. Таким образом, углубленное изучение путей восстановления повреждений ДНК и их эффективности имеет значительное значение как в фундаментальных исследованиях, так и в клинических^{приложениях 7...}

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что нет конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этом исследовании.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Центром инженерных исследований провинции Цзянсу по разработке и внедрению ключевых технологий для профилактики и контроля хронических заболеваний; Инновационная исследовательская группа Института высшего образования Цзянсу в области науки и технологий (2021); программа Центра исследований инженерных технологий профессионального колледжа Цзянсу (2023); Основной фонд естественных наук Цзянсу высших учебных заведений Китая (грант No 24KJA310008); ключевой программой Сучжоуского профессионального колледжа здоровья (грант No szwzy202406); и Государственная ключевая лаборатория радиационной медицины и защиты Университета Сучжоу (грант No GZK1202506).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Прогресс исследований стратегий оценки эффективности восстановления повреждений ДНК

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Обзор и перспектива

Выводы

Раскрытие информации

Благодарности

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи