Протокол крепления ленты для высококачественной Z-стековой съёмки глаз Drosophila Compound

Summary

Основная цель этого протокола — обеспечить неразрушительную визуализацию и количественный анализ глаз соединений Drosophila. Он сочетает стратегию монтажа ленты с стереомикроскопическим получением Z-стека и реконструкцией расширенной глубины фокуса для получения высококачественных изображений без артефактов.

Abstract

Здесь мы представляем неразрушительный протокол крепления и визуализации для высокоразрешающего фенотипического анализа глаз соединения дрозофилы. Точная фенотипизация сложного глаза Drosophila часто ограничена его выпуклой геометрией и механической хрупкостью при обращении. Чтобы решить эту проблему, мы подробно описываем универсальный, неинвазивный рабочий процесс визуализации, позволяющий визуализировать с высокого разрешения с разных точек зрения. Протокол использует индивидуальную схему крепления клея на платформе с перевёрнутой лентой, фиксируя мухи корпусом и крыльями, оставляя голову полностью нетронутой. Ключевым является то, что такая гибкая конфигурация поддерживает чёткие ориентации крепления: боковое положение для захвата полной выпуклости отдельных глаз и фронтальное положение для оценки симметрии всей головы. Этот метод также облегчает расположение высокоплотных массивов, позволяя быстро обрабатывать 20–30 образцов за сессию. Интегрируя стереомикроскопию с отражённым светом с Z-стеком и реконструкцией расширенной глубины фокуса (EDF), рабочий процесс генерирует равномерно чёткие, квази-3D композитные изображения. Этот подход сохраняет естественную пигментацию и создаёт высококачественные, контрастные изображения, подходящие для количественного органно-масштабного фенотипического анализа.

Introduction

Сложный глаз Drosophila melanogaster — это классический и мощный пример для изучения роста, паттернов и устойчивости органов в процессе развития. Состоящий примерно из 800 высокоупорядоченных омматидий, глаз мухи обеспечивает чувствительный и количественно измеримый показатель генетических нарушений, влияющих на пролиферацию, дифференцировку и организацию ^{тканей 1,2,3}. Генетическая манипуляция развитием глаз исторически дала фундаментальные знания о сохранении сигнальных путей. Семинальные исследования показали, что эктопическая экспрессия транскрипционного фактора без глаз достаточно для индуцирования образования глаз в несетчаточных тканях, закрепляя глаз как образец специфического органа и^{пластичности 4}. Последующие исследования определили сигнальный путь гиппопотама D. melanogaster как центральный регулятор размера глаз и количества клеток через координированный контроль пролиферации и^{апоптоза 5,6}. Параллельно было показано, что сигнализация Hedgehog и BMP регулирует морфогенетическую прогрессию, точность роста и пространственное формирование в развивающейся^{сетчатке 7,8}.

Однако захват высококачественных изображений взрослого сложного глаза представляет собой значительные оптические трудности из-за его выпуклой, полусферической геометрии. Стандартная микроскопия с ярким полем ограничена малой глубиной резкости, что делает невозможным одновременно фокусироваться на верхней верхней точке (полюсе) и краях (экватор) глаза за одну^{экспозицию 9}. Это ограничение часто приводит к изображениям, где значительная часть поверхности сетчатки размытась, что затрудняет применение высококачественного анализа изображений и инструментов машинного обучения, предназначенных для количественной оценки разнообразных фенотипов. Для полной характеристики поверхности сетчатки необходимо визуализировать всю кривизну без оптических артефактов. Поэтому необходим метод визуализации, который сохраняет родную морфологию глаз и позволяет визуализировать всю изогнутую поверхность сетчатки с высоким разрешением.

Кроме того, традиционные методы подготовки образцов для микроскопии часто нарушают структурную целостность головки мушки. Традиционные методы крепления часто используют клеи, которые могут закрывать поверхностные детали или использовать физические манипуляции пинцетом, чтобы давить на капсулу головки. Как отмечалось в исследованиях морфогенеза сетчатки, структурная целостность глаза имеет первостепенное значение. Прямое давление или прокол вызывает утечку гемолимфы, что приводит к потере внутреннего давления и последующему коллапсу или «вмятинам» поверхности глаза. Эти механические артефакты могут имитировать нейродегенеративные фенотипы или генетические дефекты, приводя к ложноположительным результатам на крупномасштабных скринингах. Цель этого протокола — обеспечить неразрушительный процесс монтажа и визуализации для высокоразрешающей визуализации целых глаз соединения дрозофилы.

Здесь мы представляем быстрый и воспроизводимый рабочий процесс визуализации, который позволяет с высоким разрешением визуализировать целые глаз соединения Drosophila и морфологию всей головы без прямого контакта с головой. В этом методе взрослых мух обездвиживают с помощью гибкой клеевой техники, которая фиксирует тело и крылья, обеспечивая стабильное расположение либо в боковой ориентации — чтобы захватить полный изгиб одного глаза, либо в фронтальной — для оценки симметрии всей головы и межглазных особенностей. Эта универсальная стратегия крепления минимизирует механические повреждения и сохраняет естественную геометрию глаз в трёх измерениях. В сочетании с стереомикроскопией с отражённым светом, Z-стеком и расширенной реконструкцией глубины^{фокуса 9} этот подход создаёт однородно чёткие, высококачественные изображения с разных точек зрения, подходящие как для качественного осмотра, так и для количественного фенотипического анализа. Этот метод особенно подходит для изучения генетических нарушений, фенотипов развития и высокопроизводительного скрининга морфологии глаз у дрозофилы.

Protocol

1. Сбор и синхронизация образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения сопоставимости экспериментов требуется строгий контроль времени эклозии. При стандартных условиях выращивания при 25 °C эклозия обычно происходит через 10–12 дней после откладки яиц. Куколки следует внимательно следить в этот период, так как потемнение куколки указывает на скорую эклозию.

1. Метод прямого набора (стандартный метод)
   1. Аккуратно постучите стандартным пластиковым флаконом Drosophila размером 24 x 95 мм (запечатанным поролоновым пробкой) по мягкой подушечке, чтобы сдвинуть взрослых мух на дно.
   2. Быстро уберите пробку и выровняйте горло свежего флакона с ампулой для посевов.
   3. Инвертируйте схему, чтобы культурный флакон был сверху. Аккуратно постучите по стенкам, чтобы переместить мух в флакон для сбора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот способ не рекомендуется, если стандартная кормовая среда кукурузной муки и агар влажная, так как недавно закрывшиеся мухи легко поймаются и погибают. Чтобы минимизировать смертность, сначала собирайте мух в пустой флакон размером 24 x 95 мм. После анестезии (шаг 3) переместите мух на внутреннюю стенку флакона размером 24 x 95 мм с свежим кормовым материалом.
2. Отрицательный метод переноса геотаксиса (метод антиадгезии)
   1. Уберите пробку из свежего флакона и переверните её на столе, чтобы не допустить попадания случайных мух.
   2. Держите культурный флакон так, чтобы отверстие было обращено вниз. Мухи поднимаются вверх к еде, подальше от отверстия.
   3. Когда отверстие освободится от мух, быстро откоркуйте флакон и выровняйте его с перевёрнутым пустым флаконом размером 24 x 95 мм на столе.
   4. Аккуратно постучите точкой соединения по столу, чтобы опустить мухи в флакон для сбора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод значительно снижает смертность, вызванную адгезией пищи, но занимает больше времени, чем прямое постукивание.
3. Метод анестезии с CO₂ (Метод высокой эффективности)
   1. Инвертируйте флакон с культурой так, чтобы пробка была обращена вниз.
   2. Аккуратно вставьте иглу пистолета для анестезии CO₂ между вилкой и стенкой флакона.
   3. Аккуратно включите ножную педаль и ручной клапан, чтобы выпустить 100% CO₂ при низком, мягком расходе.
   4. После того как мухи будут анестезиированы и упали на пробку, поставьте флакон с культурой горизонтально. Снимите пробку, выровняйте с пустым флаконом для сбора и аккуратно постучите по ампуле, чтобы переместить анестезированные мухи в ампулу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерный поток воздуха может выбросить мух на поверхность пищи, вызывая склеивание и гибель; строго поддерживать мягкий поток_CO2 , достаточный для анестезии мух без их физического вытеснения. Монитор летит близко в поисках ранних признаков восстановления, таких как лёгкие подёргивания или движение крыльев и ног.
4. Маркировка и обслуживание
   1. Промаркируйте флакон с указанием пола, даты сбора сдачи, даты заключения, генотипа и условий культуры.
   2. Разделение пола: Если снимка летит старше 10 дней, разделите самцов и самок на разные ампулы с пищевой культурой, чтобы предотвратить спаривание и появление поколения F2, что может мешать экспериментальной среде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мух можно содержать в этих флаконах с пищей при прежних условиях культуры (например, 25 °C) до достижения желаемого возраста для визуализации.

2. Подготовка монтажной пластины

1. Получите чистое стандартное стеклянное стекло для микроскопа.
2. Вырежьте полоску белой бумажной малярной ленты примерно на 2 см длиннее затвора.
3. Положите ленту на затвор так, чтобы клеевая сторона была направлена вверх (не клеящаяся сторона к стеклу). Убедитесь, что лента нависает над затвором примерно на 1 см с обоих концов.
4. Закрепите выступающие концы, плотно обмотав заднюю часть затвора двумя дополнительными полосками ленты длиной ~5 мм.
5. Убедитесь, что клеевая поверхность ровная, натянутая и без складок.
6. Маркировка: Отметьте индикаторы ориентации (например, «Сверху/Вверх» и «Снизу/Вниз») или идентификаторы образца на неклеящихся концах ленты для облегчения ориентации и отслеживания образца под микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе мух для визуализации избегайте особей с существенными различиями в размерах тела. Даже при одинаковом увеличении различия в размере тела могут привести к несопоставимым составным площадям поверхности глаз.

3. Эвтаназия и установка

1. Эвтаназия
   1. Переложите мухи в герметичный и пустой флакон для сбора.
   2. Поместите запечатанный флакон в морозильник при -80 °C на 15–20 минут.
      ВНИМАНИЕ: Никогда не проколывайте и не сжимайте ширинку острыми кончиками тонкого пинцета. Даже незначительная утечка гемолимфии приводит к быстрой потере внутреннего гидростатического давления, что приводит к мгновенному вмятинам и необратимому коллапсу соединенного глаза, что ухудшает качество изображения.
2. Крепление для бокового обзора (Single Compound Eye)
   1. Позиционирование: Под стандартным стереомикроскопом (например, Nikon SMZ745) используйте тонкий пинцет для ориентации эвтаназии мухи в боковое положение.
   2. Перенос: С помощью тонкого пинцета аккуратно захватите мушку за крыло (сохраняя боковую стойку) и перенесите её на подготовленную клеевую крепежную пластину.
   3. Фиксация: приклеить одну сторону тела мухи к клейкой ленте. Разведите крылья и приклейте их ровно к ленте для повышения устойчивости.
   4. Управление придатками: Во время посадки убедитесь, что ноги не мешают глазу. Если передние лапы закрывают поле зрения, используйте пинцет, чтобы аккуратно отвести их от глаза и прочно приклеить к ленте (например, удлинить вниз или заправить под грудную клетку).
   5. Закрепление: Наклоните пинцет и используйте боковую часть кончика (не острое), чтобы аккуратно прижать корпус к ленте для надёжного соединения.
   6. Тонкая регулировка: проверьте, горизонтальная ли головка. Если глаз не находится на одной фокальной плоскости, используйте пинцет для микрорегулировки угла тела.
3. Крепление для фронтального вида (вся голова)
   1. Позиционирование: На анестезиологической подушке ориентируйте мушку в положении вентральной стороны вниз (лежа).
   2. Перенос: Используйте пинцет, чтобы захватить одно крыло и поднять мушку. Перенесите его на клеящую монтажную пластину.
   3. Начальная фиксация: Аккуратно расправьте оба крыла наружу (влево и право) и плотно прижимайте их к клеевой поверхности, чтобы закрепить мушку.
   4. Стабилизация тела: Аккуратно нажимайте на грудь, чтобы обеспечить полный контакт с клеящей пластиной. Используйте пинцет, чтобы слегка схватить заднюю часть живота (хвост) и аккуратно потянуть, чтобы выпрямить ось тела, прежде чем приклеить живот к ленте.
   5. Ориентация головки: Отрегулируйте угол головы с помощью тонкого пинцета, чтобы фронтальная плоскость (лицо) была параллельна поверхности клея. Оба сложных глаза должны быть ровными и видимыми в одной фокальной плоскости.
4. Аранжировка
   1. Крепите несколько мушек параллельными рядами или сетчатой массивой на клеевой поверхности. Убедитесь, что отдельные мушки не перекрываются, чтобы предотвратить помехи Z-стека, хотя разрешён плотное упакование для максимизации пропускной способности (например, 20–30 мушек на слайд). Выровняйте всех мушек так, чтобы их головы были обращены в одно направление (как указано на метках на шаге 2.6), чтобы облегчить систематическую визуализацию.
   2. Подготовьте отдельные массивы образцов для латеральной и фронтальной визуализации с использованием разных наборов эвтаназии мух из одной когорты. После прикрепления мухи к ленте её нельзя безопасно снять или переместить без серьёзных механических повреждений образца; поэтому несколько видов нельзя последовательно сфотографировать одного и того же человека.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется делать снимки образцов сразу после эвтаназии и установки, чтобы предотвратить высыхание тканей.

4. Получение изображений

1. Запуск и инициализация системы моторизованного стереомикроскопа
   1. Включайте ПК, монитор и микроскоп последовательно.
   2. Запустите программное обеспечение LAS X.
   3. Когда появится запрос «Инициализация/Самотестировать», убедитесь, что поле под целью свободно от препятствий, и нажмите «Подтвердить». Позволите микроскопу завершить полное калибровочное движение по оси Z.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги оптимизированы для стереомикроскопа с программной системой LAS X.
2. Размещение образцов и освещение
   1. Перенесите подготовленную монтажную пластину на базовую платформу моторизованного стереомикроскопа, вручную разместив её так, чтобы первый образец в массиве был центрирован под объективом цифровой камеры.
   2. Включите источники передаваемого света (базовый) и падающий свет (верхний). Для сложной визуализации в основном используйте отражённый свет. Отрегулируйте диафрагму для равномерного освещения.
3. Конфигурация программного обеспечения
   1. Установите режим получения на Z-стек. В настройках проекта установите приоритет многомерного движения на «Z-первый» для обеспечения непрерывной и стабильной работы моторного привода.
   2. Установите режим изображения на Отражённый свет.
   3. Включите расширенную глубину фокуса (EDF) для синтеза полностью сфокусированного изображения.
   4. В расширенных настройках изображения включите высокий динамический диапазон (HDR). Это настоятельно рекомендуется для смягчения зеркальных бликов и чрезмерной экспозиции, часто вызванной сильно отражающей, хитиновой поверхностью сложного глаза.
4. Позиционирование и баланс белого
   1. Отрегулируйте регулятор увеличения до нужного уровня (например, коэффициент увеличения 16x для бокового обзора одним глазом и 12,5x для фронтального обзора всей головы), чтобы конкретная область интереса занимала от 1/2 до 2/3 поля зрения.
   2. Ручно разместите монтажную пластину так, чтобы грудь мухи оказалась в центре поля зрения.
   3. Проведите калибровку баланса белого с помощью груди для коррекции цветовой температуры.
5. Параметры экспозиции и изображения (Эталонные значения)
   Экспозиция: 60–80 мс.
   Усиление: 0–5 (Держите низкий уровень для минимизации шума).
   Интенсивность: 60%–80%.
   Размер шага Z-стека: стандартный: 8–12 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для гладких, здоровых сложных глаз (например, ^{w 1118} × GMR-GAL4) могут быть достаточны шаги до 15 мкм, так как непрерывная и регулярная кривизна требует меньше оптических срезов. Однако для шероховатых или неровных фенотипов глаз, характеризующихся резкими топологическими изменениями, для захвата мелких структурных деталей и значительного повышения точности реконструкции EDF требуются меньшие шаги (до 5 мкм).
6. Определение и захват Z-стека
   1. Для бокового вида: установите диапазон Z-стека от орбитального края (Start) до центральной омматидии (End) с помощью шага 8–12 мкм.
   2. Для фронтального вида: отрегулируйте ручку фокусировки так, чтобы внешний контур сложных глаз был в фокусе (Start). Настройте фокус в противоположную сторону, пока центральные очки (жёлтые простые глаза) на макушке не будут в фокусе (конец). Нажмите Set End.
   3. Нажмите Stop Live, чтобы заморозить предпросмотр.
   4. Нажмите «Начать приобретение». Система автоматически захватывает определённые фокальные плоскости и синтезирует высокоразрешённое, полностью сфокусированное изображение.
7. Сохранение файлов:
   1. После завершения восстановления EDF нажмите на значок «Сохранение » в интерфейсе программного обеспечения (или перейдите в раздел «Файл > сохранить как»).
   2. Выберите каталог назначения, введите указанное имя файла и нажмите «Сохранить».
   3. Обратите внимание, что каждое приобретение генерирует три отдельных файла изображений: a. Необработанное/каналное изображение (в оттенках серого);b. Цветной превью изображения; c. Композитное изображение EDF (с суффиксом «_Composite»)
      ПРИМЕЧАНИЕ: И исходное/каналное изображение, и композитное изображение EDF следует сохранить для анализа и документации

Results

Полный экспериментальный процесс — от сбора образцов до получения изображений — изложен на рисунке 1. Эффективность модифицированного протокола демонстрируется созданием массив выборок высокой плотности. Как показано на рисунке 2A, 20–30 анестезированных мух могут быть размещены в виде сетки на одной платформе из перевёрнутой ленты. Ориентационные маркеры, написанные на неклеящихся концах ленты, обеспечивают единообразную направ...

Discussion

Глаз Drosophila compound служит мощным фенотипическим индикатором для генетического скрининга, где заметные изменения размера глаз, шероховатости или^{пигментации 2,3,8} часто указывают на нарушения основных сигнальных путей, таких как^{Hippo 5,6} или^{Hedgehog 7}. Однако эффективность таких экранов долгое время о...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Газовый баллон CO2)	Местный поставщик	Н/Д
CO2 анестезиологический духающий пистолет	T& L	DG-08
Цифровая микроскопическая камера	Leica	DMC6200
Тонкие пинцеты	VETUS	MOS-167B
Поролоновые пробки	Дунпэн	Н/Д
Программное обеспечение для получения изображений (LAS X)	Leica	3.7.1
Программное обеспечение для обработки изображений (FIJI/ImageJ)	NIH	Открытый исходный код
Светодиодный купольный подсветитель	Leica	LED5000 HDI
Светодиодный подсветитель Gooseneck	cossim	LG-10
Моторизованный стереомикроскоп	Leica	M205 FCA
Объективная линза	Leica	1.0x PlanApo NA0.2
Пневматический педальный клапан	ДЕЛИКСИ	FV-320
Стандартные флаконы для культуры дрозофилы	ЛАЙБУР	2424951
Стандартная пищевая среда для дрозофилы	Н/Д	Кукурузная мука-агар-патока
Стандартные стеклянные микроскопические стекли	Citotest	10127101P-G
Стандартный стереомикроскоп	Nikon	SMZ745
Белая бумажная малярная лента	UBWIN	Ширина 25 мм