Пространственно разрешённое, интегрированное одноклеточное мультиомное профилирование транскриптома и эпигеномных мишень в замороженных срезах тканей

Summary

В этом исследовании представлен пространственный мультиомный протокол Trekker–CUT&Tag, сочетающий прямое пространственное штрихкодирование срезов ткани с одноклеточным мультиомным анализом. Этот подход позволяет одновременно пространственно разрешать профилирование экспрессии генов на одноклеточном уровне и модификацию гистонов H3K27ac, предоставляя механистические представления о регуляции генов в контексте микроанатомии тканей.

Abstract

Пространственные мультиомные технологии в сочетании с профилированием отдельных клеток предоставляют беспрецедентные возможности для прояснения молекулярной и клеточной архитектуры сложных тканей. Сочетание пространственного штрихкодирования ядер внутри отдельных криосекций, подготовленных из тканевых блоков, встроенных в среду с оптимальной температурой резки (OCT), с одноклеточными мультиомическими анализами в простой и эффективный рабочий процесс может облегчить аннотацию и пространственно разрешённый молекулярный анализ клеток в типах тканей. В данном исследовании сообщается о пространственном расщеплении под мишенями и метками (CUT&Tag) мультиомном подходе, который одновременно профилирует модификацию гистонов H3K27ac и экспрессию генов в одном замороженном срезе мозга. После пространственного штрихкодирования отдельные ядра изолируются и подвергаются CUT&TAG, совместному захвату маркированных ДНК, РНК и пространственных штрихкодов, подготовке библиотек и секвенированию. Рабочий процесс генерирует пространственно аннотированные эпигеномные и транскриптомические профили из одних и тех же ядер, что позволяет присваивать мультиомическую информацию анатомическим координатам. Интеграция эпигеномной информации с пространственными транскриптомными данными повышает точность идентификации типов клеток и выявляет пространственно организованные регуляторные программы и взаимодействия между клетками внутри целостных тканей.

Introduction

Пространственная биология — это быстро развивающаяся область, которая картирует расположение, организацию и взаимодействия молекул, клеток и тканей в их естественных ^{средах 1,2,3}. В отличие от объёмных или традиционных одноклеточных методов, которые требуют диссоциации тканей и приводят к потере позиционной информации, пространственные подходы сохраняют физические координаты аналитов или клеток/ядер, позволяя непосредственно исследовать влияние архитектуры тканей на клеточную идентичность, межклеточные коммуникации и биологическую^{функцию} 4,5,6,7 . Хотя пространственная транскриптомика и пространственная протеомика в настоящее время являются наиболее широко используемыми модальностями, область быстро расширяется в сторону пространственного мультиомического^{профилирования 3,8,9}. Копрофилирование экспрессии генов и эпигеномных состояний внутри одной ткани особенно эффективно, так как напрямую связывает транскрипционный выход с регуляторными механизмами — такими как доступность хроматина и модификации гистонов — которые регулируют активность генов и известны варьиями между^{пространственными доменами} 10,11,12 . Таким образом, интегрированный пространственный анализ эпигенома и транскриптома даст важные представления о том, как регуляторные программы формируют клеточную идентичность и организацию тканей.

Разработано несколько пространственных мультиомных стратегий для обеспечения одновременного эпигеномного и транскриптомического профилирования. Детерминированное штрихкодирование в секвенировании тканей (DBiT-seq) использует микрофлюидные каналы для прямой или косвенной доставки пространственных штрихкодов через штампование гелевыми плитами к срезам тканей, что позволяет пространственно аннотировать анализируемые вещества. Этот подход способствует пространственно разрешенному копрофилированию эпигеномных и транскриптомных^{признаков} 12,13,14,15. Метод Slide-tag, коммерциализированный как платформа Takara Trekker, напрямую вводит пространственные штрихкоды в целые ткани до диссоциации, позволяя обрабатывать пространственно индексированные ядра с помощью стандартных одноклеточных рабочих процессов и вычислительно проецироваться обратно на исходные тканевые^{координаты 16}. В отличие от этого, пространственный анализ доступного хроматина, клеточных линий и экспрессии генов с помощью секвенирования (SPACE-seq) использует стратегию таргетирования, при которой поли(A)-хвостовые эпигенетические мишени и мРНК фиксируются на последовательности захвата поли-dT в пространственных транскриптомических^{плитках 17}.

Расщепление по мишеням и маркировка (CUT&Tag) — мощный инструмент для картирования взаимодействий между ДНК и белками гистонов или негистонов из крайне низких входных^{образцов 18}. CUT&Tag опирается на фрагментацию хроматина транспозазой Tn5 и маркировку ДНК (маркировка), используя Tn5, управляемый антителами, белковый A-конъюгированный Tn5 для локусоспецифичного расщепления и молекулярного метирования. В то время как традиционный анализ CUT&Tag включает несколько этапов инкубации и промывки, был использован упрощённый и упрощённый рабочий процесс CUT&Tag для повышения эффективности CUT&Tag в последующих приложениях с одноячейковым^{мультиомом 19}.

Рисунок 1: Обзор рабочего процесса и контроля качества пространственного многоомного анализа Trekker–CUT&Tag. (A) Схематическая диаграмма пространственного мультиомного рабочего процесса Trekker–CUT&Tag. Корональный участок свежезамороженной мышиной мозговой ткани крепится на пространственную плитку Trekker и подвергается пространственному штрих-кодированию. После лизиса тканей ядра изолируются и оцениваются на урожайность и качество. Около 50 000 ядер используются для H3K27ac CUT&TAG, а маркированные ядра подвергаются одноклеточному штрих-кодированию с помощью 10x гелевых шариков Genomics Chromium Multiome после подсчёта. Одноклеточная штрих-кодированная ДНК предварительно амплифицируется и делится на две части. Индексированная библиотека CUT&Tag генерируется непосредственно с помощью индексного ПЦР. Для экспрессии генов и библиотек пространственных штрихкодов предварительно амплифицированная ДНК дополнительно амплифицируется и выбирается по размеру. Фрагменты, соответствующие типичным размерам cDNA, используются для подготовки библиотеки экспрессии генов, а короткие фрагменты ДНК — для создания пространственной библиотеки штрихкодов. Библиотеки секвенируются и отображаются в соответствии с 10-кратными принципами Genomics и Curio Trekker. Ожидаемая хронология экспериментов указана слева. (B) Ключевые контрольные точки контроля качества (QC) и ключевые аспекты на протяжении всего рабочего процесса. Контроль контроля ядер включает оценку выхода, целостности, агрегации и содержания обломков. Предварительное секвенирование контроля качества включает оценку распределения размеров ДНК и загрязнения праймерными димерами для всех библиотек. Специфичность библиотеки CUT&Tag оценивается с помощью количественного ПЦР (qPCR), измеряющего обогащение целевых геномных областей на фоне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

В данном исследовании представлен пространственный мультиомный анализ Trekker CUT&Tag, который одновременно профилирует модификацию гистонов H3K27ac, связанную с активными цис-регуляторными элементами и экспрессией генов в свежезамороженных срезах ткани. Этот протокол предусматривает пошаговые процедуры пространственного штрихкодирования Takara Trekker, диссоциации тканей и изоляции ядер, подсчёта ядер и контроля качества, низковводного профилирования CUT&Tag модификации H3K27ac, захвата молекулярных мишень на 10x Genomics одноклеточных гелевых шариков Multiome и подготовке библиотеки. Рабочий процесс был продемонстрирован с помощью коронального сечения ткани мозга мыши. В отличие от стандартного рабочего процесса 10x Genomics Multiome, где доступность хроматина измеряется методом анализа на доступный для транспозазы хроматин с высокопроизводительным секвенированием (ATAC-seq), этот протокол заменяет фрагменты ДНК, полученные из CUT&Tag, на фрагменты ATAC, что позволяет напрямую анализировать ландшафты модификации гистонов с разрешением одной клетки. Для связки пространственных штрихкодов Trekker с 10x одноклеточными штрихкодами Genomics, пространственные штрихкоды с поли(A)-хвостом и транскрипты mRNA фиксируются поли-dT-последовательностями гелевых шариков Multiome, а фрагменты ДНК CUT&Tag — спейсерными последовательностями. Стратегия двойного захвата позволяет одновременно восстанавливать эпигеномную, транскриптомную и пространственную информацию из одного и того же ядра. Насколько нам известно, это первый пространственный мультиомный рабочий процесс, который напрямую интегрирует пространственную аннотацию Trekker с пространственной аннотацией с одной ячейкой для совместного профилирования геномного распределения метки гистона и транскриптома. Полученные пространственно разрешённые мультиомные ландшафты, интегрирующие данные о занятости H3K27ac и экспрессии генов, позволяют проецировать профиль отдельных клеток обратно к их исходным координатам ткани и обеспечивают прямую связь между эпигеномными регуляторными механизмами и транскрипционными программами в связи с целостной архитектурой ткани.

Protocol

Взрослые мыши были эвтаназированы вдыханием_CO2 (IACUC #: A48315-15-R24) перед забором тканей. Мозг был полностью удален после сагиттальной краниотомии и удаления половины кальварии. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Монтаж секции ткани на плитку штрих-кода Trekker для пространственного штрихкодирования

1. Подготовьте следующее перед началом работы.
   1. Уравновесить оптимальную температуру резки (OCT) блок ткани в криостате перед секционированием. Подготовьте буферы для расщепления ультрафиолета, диссоциации тканей и изоляции ядер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная температура для секционирования может варьироваться в зависимости от типа ткани.
   2. Для изоляции ядер предварительное охлаждение центрифуги с помощью качающихся ведра для трубок объёмом 1,5 мл до 4 °C. Предварительно охлаждите тарелку на 12 лунок с уплотнительным кольцом Trekker на льду.
   3. Установите УФ-метр на максимальный предел тока (1,2 А) и максимальную мощность.
2. Запишите пространственный идентификатор плитки штрих-кода (например, U0001_001) используемой плитки Trekker.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая плитка Trekker содержит уникальные координаты штрихкода. ID плитки необходим для получения правильного файла пространственного отображения штрихкодов данных секвенирования.
3. Разрезать ткани. Корональное сечение толщиной 25 мкм в приблизительном положении брегмы -1 мм проводилось при −18 °C (рисунок 1A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина может быть увеличена до 30 мкм при работе с тканями с низкой клеточностью.
4. Разместите секцию (или область интереса) на пространственную плитку и расплавите её, аккуратно положив палец на дно стекла.
   ВНИМАНИЕ: При необходимости проверьте процедуры через измерения качества ядер с помощью тренировочной плитки Trekker.
5. Используйте пинцет, чтобы снять плитку с прозрачного клея и поместить её в колодец с 12-луночной пластиной для культуры тканей на льду поверх уплотнительного кольца Trekker. Немедленно нанесите на плитку 30 мкл УФ-расщепляющего буфера Trekker, убедитесь, что вся ткань покрыта буфером.
6. Поставьте УФ-лампу (1,2 А) на пластину прямо над колодцем. Подсветите 1 минуту, чтобы отпустить штрихкоды, при этом всё оставалось под лёдом.
   ВНИМАНИЕ: При работе с УФ-лампой используйте защитные очки.
7. Выключите ультрафиолетовую лампу и инкубируете плитку на льду на 7,5 минут. Во время инкубации возьмите промывку Trekker 10 x 10 и заполните камеры 1 и 2 400 мкл холодного буфера Trekker Nuclei для промывки на льду.
8. Аккуратно поднимите плитку пинцетом, не трогая бусины, и промойте плитку в камере 1 за 5 секунд. Промой плитку во второй камере на 5 секунд. Аккуратно положите плитку в колодец в 12-колодной пластине на льду. Участок ткани должен быть окрашён в синий цвет и легко заметен.

2. Диссоциация тканей и изоляция ядер

1. Введите 175 мкл буфера Invent Minute A, направленного на ткань. Повторите ещё 3 раза, чтобы получить в сумме 700 мкл. При каждом дозировании цельтесь в разные части плитки, чтобы отделить всю ткань от плитки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте загрязнения бусинами при царапании плитки или падения бусин.
2. Продолжайте отделять ткань от плитки, аспирируя буфер со стороны колодца и нанося его на участки плитки, покрытые тканью, сохраняя пластину на льду как можно дольше. Повторяйте, пока на плитке не останется ткани. Когда вся ткань с плитки удалена, аккуратно используйте пинцет, чтобы перенести плитку в пустой колодец.
3. Используйте пипетку P1000 для механической диссоциации ядер при повторяющем тритурировании в одной и той же яме. Повторяйте, пока не останутся видимые кусочки ткани.
4. Аккуратно перенесите суспензию ядер в фильтрующий картридж с сборной трубкой из одноядерного изоляционного набора Invent Minute для нейронных тканей/клеток. Инкубировать трубку с открытой крышкой при –20 °C в течение 10 минут. Закройте фильтрующий картридж и немедленно центрифугуйте при 13 000 х г в течение 30 секунд в охлаждённой микроцентрифугах.
5. Сбросьте фильтрующий картридж и снова подвесьте гранулу, аккуратно прокручив пипеткой 10–20 раз. Прокрутите трубку в предварительно охлаждённой центрифуге с качающимися ведрами при 600 х г в течение 5 минут. Аккуратно удалите супернатант и снова подвесьте гранулу в 200 мкл буфера Trekker C.
6. Добавьте 1 мл холодного буфера Invent Minute B к низкосвязанной трубке Эппендорфа объёмом 1,5 мл и аккуратно наложите 200 мкл суспензии ядер поверх буфера Minute B, медленно выделяя его в стенку трубки, чтобы избежать смешивания слоёв. Крутите трубку в предварительно охлаждённой центрифуге с качающимися ведрами при 500 x g в течение 10 минут. Аккуратно удалите молочный слой и наверхньо снимите.
7. Аккуратно суспензируйте ядра с помощью 24 мкл буфера Trekker C и переходите к измерениям качества изолированных ядер.

Рисунок 2: Оценка контроля качества изолированных ядер. Репрезентативные яркие изображения изолированных ядер из мышиной мозговой ткани. Ядра были окрашены в 0,4% трипан-синий цвет и сняты с увеличением в 40 раз для оценки целостности ядерной энергии и наличия обломков. Препарат ядер, показанный слева, демонстрирует высококачественные, целые ядра, подходящие для анализов последующих анализов, тогда как препарат, показанный справа, иллюстрирует низкокачественные ядра с частично лизированными тканевыми агрегатами. Повреждённые или разорванные ядра обозначены заполненными наконечниками стрелок. Шкала — 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Измерения подсчёта и контроля качества изолированных ядер

1. Для подсчёта ядер возьмём 2 мкл суспензии ядер в 8 мкл буфера Треккера C. Смешайте 10 мкл разбавленной суспензии ядер с 10 мкл раствора окрашивания AO/PI. Считайте ядра согласно инструкциям производителя.
2. Для оценки качества изолированных ядер разведите 2 мкл суспензии ядер до 8 мкл 4% трипанового синего раствора. Осмотреть ядра под флуоресцентным микроскопом при увеличении 40x, проверяя целостность морфологии ядерной мембраны и содержания неядерного мусора (рисунок 2).
3. Немедленно переходите к одноядерному мультиному анализу CUT&Tag (CUT&Tag на H3K27ac + экспрессии генов).
   ВНИМАНИЕ: Переходите к следующим шагам, если будет обнаружено не менее 30 000 высококачественных ядер.

4. Метка CUT&Tag на изолированных ядрах

1. Подготовьте инкубационный буфер CUT&Tag I. Поставьте его на лёд.
2. Подготовьте первичные антитела и транспозазу, активируемые конъюгатом фермента TAG.
   1. Добавьте 46,23 мкл инкубационного буфера CUT&Tag I и 1,33 мкл фермента TAG в ПЦР-пробирку на льду. Добавьте оптимальное количество первичных антител в пробирку. Медленно перемешивайте, пипетируя 10 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: К реакции было добавлено 2,43 мкл антитела к H3K27ac. Партия антител была подтверждена для проведения объемных и in-situ тестов CUT&Tag. Оптимизируйте количество антител для конъюгации фермента TAG с помощью массового анализа. Оптимальное антитело определялось как самая низкая концентрация, достигающая максимального соотношения сигнал-шум, определяемую с помощью qPCR в положительных и отрицательных целевых локусах.
   2. Ненадолго покрутите и поставьте трубку на вращательный механизм на 18 об/мин. Инкубировать при комнатной температуре 1 час. Полученную смесь можно заранее приготовить и поместить на лёд до 5 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация антитела и TAG может проводиться одновременно с или до выделения ядер.
3. Инкубация изолированных ядер с конъюгатом фермента антитела и TAG.
   1. Вращайте трубку (шаг 2.7) изолированных ядер в предварительно охлаждённой центрифуге с качающимися ведрами при 500 x g в течение 10 минут. Удалите супернатант, не нарушая гранулу, и оставляйте ~5 мкл супернатанта.
   2. Добавьте 25 мкл инкубационного буфера CUT&Tag I (шаг 4.1) и подвесьте повторно, аккуратно пипетируя 10 раз. Перенесите ядра в трубку (шаг 4.2.2), содержащую сопряжённый антитело-TAG, используя тот же кончик пипетки. Аккуратно перемешивайте, пипетируя 10 раз, и поставьте трубку на мягкий ротатор.
   3. Инкубировать на ночь при 4 °C.
4. На следующий день (второй день) подготовьте 1X буфер для ядер CUT&Tag и поставьте на лёд.
5. Тегментация CUT&Tag
   1. Извлечь реакционную трубку (шаг 4.3.3) из вращателя. Добавьте 5 мкл активатора CUT&Tag и переведите смесь в новую трубку объёмом 1,5 мл. Инкубировать 1 час при 37 °C на ThermoMixer при 550 об/мин.
   2. Достаньте трубку, добавьте 20 мкл буфера для закалки CUT&Tag и аккуратно перемешайте реакцию, прокручив пипеткой 10 раз. Центрифугуйте трубку в предварительно охлаждённой центрифуге с поворотными ведрами при 500 x g в течение 10 минут. Удалите супернатант, не нарушая гранулу ядер, оставив ~5 мкл супернатанта на дне трубки.
   3. Добавьте 100 мкл 1X буфера ядер CUT&Tag и повторно подвесьте ядра путём аккуратной пипетировки 10 раз. Крутите трубку в предварительно охлаждённой центрифуге с качающимися ведрами при 500 x g в течение 10 минут. Удалите 85 мкл супернатанта, оставив ~15 мкл. Повторно суспесируйте ядра, аккуратно и медленно пипетируя 10 раз.
6. Подсчёт помеченных ядер и определение числа прицела
   1. Добавьте 1 мкл суспензии помеченных ядер в 9 мкл физиологического раствора, буферированного фосфатами, и смешайте с 10 мкл раствора окрашивания AO/PI. Считать отмеченные ядра, как описано в шаге 3.1.
   2. Используйте в 1,6 раза больше целевого количества ядер для генерации одноклеточного GEM, чтобы получить желаемое количество захваченных ядер.
   3. Прокрутите трубку в предварительно охлаждённой центрифуге с поворотными ведрами при 500 x g в течение 10 минут и аккуратно удалите супернатант, оставив итоговый объём 8 мкл.

5. Одноклеточное штрихкодирование помеченных ядер и предварительная амплификация штрихкодированных ДНК

1. Добавьте 7 мкл буфера ATAC B к 8 мкл помеченных ядер с ожидаемым количеством целенаправленных ядер для вашего эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. больше подробностей о настройках реакции и работе прибора Chromium X в протоколе «GEM Generation and Barcoding» Руководства пользователя Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit (CG000338 Rev G).
2. генерация и штрихкодирование GEM с помощью прибора Chromium X.
   1. Добавьте 60 мкл мастер-смеси GEM в трубку с отмеченными ядрами. Аккуратно перемешайте с помощью пипета и загрузите на первый ряд чипа Chromium Next GEM J.
   2. Подготовьте гелевые шарики Single-Cell Multiome и загрузите 50 мкл гелевых бусинок на второй ряд. Раздайте 45 мкл разбивающей нефти в скважины в ряду 3.
   3. Поместите собранный чип J с прокладкой в лоток прибора Chromium X и запускайте инструмент.
   4. Медленно аспирируйте 100 мкл GEM из самых низких точек скважин для восстановления в верхнем ряду 3. Медленно вводите GEM в новую ПЦР-трубку на льду, прижимая кончики пипетки к боковым стенкам колодцев.
   5. Инкубировать собранные GEM в термическом циклере (температура крышки 50°C) по следующему протоколу: один цикл 37 °C в течение 45 минут, один цикл 25 °C в течение 30 минут и 4 °C для удержания.
   6. Добавьте 5 мкл закалительного средства и медленно перемешивайте, пипетируя 10 раз.
3. Очистка после инкубации после GEM и очистка ДНК
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробнее см. в протоколе «Post GEM Incubation Cleanup» Руководства пользователя Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit (CG000338 Rev G).
   1. Добавьте в трубку 125 мкл розового препарата для восстановления при комнатной температуре и аккуратно инвертируйте трубку 10 раз. Ненадолго центрифуга. Медленно удаляйте и сбрасывайте 125 мкл средства для восстановления/разделяющего масла (розового) с нижней части тюбика.
   2. Добавьте 200 мкл смеси для очистки Dynabeads в пробирку и перемешайте, пипетируя 10 раз. Инкубировать 10 минут при комнатной температуре. Поставьте трубку на магнитную подставку, пока раствор не очистится. Удалите супернатант.
   3. Добавьте 300 мкл свежеприготовленного 80% этанола в гранулу. Инкубировать 30 секунд и удалить супернатант. Добавьте 200 мкл этанола 80% в гранулу, инкубируем 30 с и удалите супернатант. Покрутите трубку ненадолго и положите её на магнит. Удалите оставшийся супернатант.
   4. Снимите трубку с магнита. Сразу добавьте 50,5 мкл раствора элюции I. Перемешайте с помощью пипетки и инкубуйте 1 минуту при комнатной температуре. Покрутите ненадолго и поставьте трубку на магнит, пока раствор не прояснится. Перенесите 50 мкл очищенного раствора в новую трубку.
   5. Очистка ДНК с помощью парамагнитных шариков
      1. Добавьте 90 мкл парамагнитных шариков (1,8X) к каждому образцу и тщательно перемешайте с помощью пипетирования. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Покрутите ненадолго и поставьте трубку на магнит, пока раствор не прояснится. Удалите супернатант.
      2. Добавьте 200 мкл этанола 80% в пеллет. Инкубировать 30 секунд. Удалите этанол. Повтори это ещё раз.
      3. Покрутите ненадолго и поставьте трубку на магнит. Удалите оставшийся супернатант.
      4. Снимите трубку с магнита. Добавьте 46,5 мкл буфера EB и перемешайте с помощью пипетирования. Инкубировать 2 минуты при комнатной температуре. Вращайте и кладите его на магнит, пока раствор не прояснится.
      5. Перенесите 46 мкл очищенной ДНК в новую трубку.
4. Предамплификация штрихкодированных ДНК.
   1. Добавьте 54 мкл предварительного усиления в каждый образец. Ненадолго смешайте пипеты и центрифугите.
   2. Инкубировать в термическом циклере (температура крышки 105 °C) по следующему протоколу: один цикл 72 °C в течение 5 минут; один цикл при температуре 98 °C в течение 3 минут; всего 7 циклов по 98 °C в течение 20 с, 63 °C 30 с, 72 °C в течение 1 минуты; один цикл 72 °C в течение 1 минуты; и удержание при 4 °C. Храните при 4 °C на ночь.
   3. На следующий день (3-й день) очистите предварительно амплифицированные ДНК парамагнитными шариками (1,6X), как описано в шаге 5.3.5. Добавьте 80,5 мкл буфера EB в трубку и перемешайте с помощью пипетирования. Инкубировать 2 минуты при 22 °C (комнатной температуры). Покрутите ненадолго и поставьте трубку на магнит, пока раствор не прояснится.
   4. Перенесите 80 мкл предварительно амплифицированных ДНК в новую трубку. Используйте 40 мкл для генерации библиотеки CUT&Tag. Сохраняйте оставшиеся предварительно амплифицированные ДНК при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 40 мкл оставшихся предамплифицированных ДНК будут использованы позже для экспрессии генов и библиотек пространственных штрих-кодов.

6. Подготовка библиотеки для CUT&Tag, экспрессии генов и пространственных штрихкодов

1. Подготовка библиотеки scCUT&Tag
   1. Перенесите 40 мкл предварительно амплифицированных ДНК в новую пробирку и добавьте 60 мкл ПЦР-смеси с индексом образца. Смешивайте с помощью пипетки и коротко прячите.
   2. Инкубировать в термическом циклере (температура крышки 105 °C) по следующему протоколу: один цикл при 98 °C в течение 45 секунд; всего 12 циклов: 98 °C в течение 20 с, 67 °C 30 с, 72 °C 20 с; один цикл 72 °C в течение 1 минуты; 4 °C для удержания).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное число циклов зависит от начального числа ядер и профилируемой метки гистона. Двенадцать циклов усиления использовались для маркировки H3K27ac в эксперименте.
   3. Двойной отбор и очистка ДНК с помощью парамагнитных шариков (0,6X, 1,55X)
      1. Добавьте 60 мкл парамагнитных шариков (0,6X) в каждый образец и перемешайте путём тщательной пипетации. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Покрутите ненадолго и поставьте трубку на магнит, пока раствор не прояснится.
      2. Перенесите 150 мкл супернатанта в новую трубку. Добавьте 95 мкл парамагнитных шариков (1,55X) в каждый образец (супернатант) и перемешайте с помощью пипетирования. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Поставьте трубку на магнит, пока раствор не выйдет. Удалите супернатант.
      3. Добавьте 300 мкл этанола 80% в пеллет. Подожди 30 секунд. Удалите этанол. Повтори ещё раз. Покрутите ненадолго и поставьте трубку на магнит. Удалите оставшийся супернатант.
      4. Снимите трубку с магнита. Добавьте 20,5 мкл буфера EB в трубку и смешайте с помощью пипетирования. Инкубировать 2 минуты при комнатной температуре. Вращайте и кладите его на магнит, пока раствор не прояснится.
      5. Перенесите 20 мкл очищенных и индексированных библиотек CUT&Tag в новые трубки.
2. Проверка качества для библиотеки CUT&Tag
   1. Анализ распределения размеров ДНК в библиотеке
      1. Смешайте 1 мкл очищенной библиотечной ДНК с 1 мкл буфера с низким содержанием TE.
      2. Смешайте разбавлённую ДНК с рабочим буфером Fragment Analyzer и проведите на приборе с помощью Высокочувствительного HS NGS Fragment Kit (1-6000 bp) (рисунок 3A).
   2. Оценить обогащение геномного локуса с H3K27ac-положительным до секвенирования и картирования.
      1. Смешайте 1 мкл очищенной библиотечной ДНК с 4 мкл воды без нуклеаз. Используйте 1 мкл разбавленной библиотечной ДНК для измерения qPCR для трёх геномных локусов.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для H3K27ac CUT&Tag положительный праймер был разработан из локуса Actb-TSS, а праймеры, направленные на T1-TSS и интергенный локус, служили отрицательными^{контролями 20} (Таблица 1). Геномная ДНК мышей использовалась в качестве входного контроля для нормализации эффективности ПЦР (рисунок 3B).
      2. Приготовьте в общей сложности 20 мкл реакционной смеси следующим образом: 1 мкл разбавленной библиотечной ДНК, 2 мкл смеси праймеров 10 мкм, 10 мкл 2X SYBR Green Master Mix и 7 мкл воды без нуклеазы.
      3. Запустите подготовленную qPCR-пластину на системе реального времени CFX Opus с использованием соответствующей программы циклирования для обнаружения SYBR Green.
3. Амплификация кДНК и пространственных штрихкодовых ДНК.
   1. Перенесите 35 мкл предварительно амплифицированных ДНК (шаг 5.4.4) в новую трубку и добавьте 65 мкл смеси реакций амплификации кДНК. Смешивайте с помощью пипетки и коротко прячите. Праймер, используемый для амплификации кДНК и пространственного штрихкода ДНК, называется Feature cDNA Primers 2.
   2. Инкубировать в термическом циклере (температура крышки 105 °C) по следующему протоколу: один цикл при 98 °C в течение 45 секунд; всего 8 циклов при температуре 98 °C в течение 20 секунд, 63 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 1 минуты; один цикл 72 °C в течение 1 минуты; 4 °C для удержания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное число циклов должно определяться исходя из типа клетки, содержания РНК и начального числа ядер. В этом эксперименте было проведено 8 циклов усиления.
   3. Очистка амплифицированных кДНК
      1. Двойной отбор и очистка ДНК парамагнитными шариками (0,6X, 2,0X), как описано в шаге 6.1.3. Добавьте 60 мкл парамагнитных шариков (0,6X) к каждому образцу и перемешайте с помощью пипетирования. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Положите магнит на раствор, пока он не пройдёт.
      2. Перенесите и сохраните 75 мкл супернатанта в новой трубке, не нарушая гранулу. Поддерживайте при комнатной температуре.
         ВНИМАНИЕ: Не выбрасывайте супернатант, так как он содержит ДНК, обогащённую для коротких фрагментов, которые будут использоваться для генерации библиотеки пространственных штрихкодов.
      3. Удалите оставшийся супернатант из гранулы. Промывайте 80% этанола два раза, как описано в шаге 6.1.3.
      4. Добавьте в трубку 40,5 мкл буфера EB и перемешайте с помощью пипетирования. Инкубировать 2 минуты при комнатной температуре. Покрутите его ненадолго и положите на магнит, пока раствор не прояснится.
      5. Перенесите 40 мкл амплифицированных кДНК в новую трубку. Сохраните её на льду, чтобы подготовить индексированную библиотеку экспрессии генов.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эта фракция обогащает ДНК для типичного размера кДНК.
   4. Очистка амплифицированных пространственных штрихкодных ДНК
      1. Добавьте 70 мкл парамагнитных шариков (2,0X) к 75 мкл ранее сохранённого супернатанта (Шаг 6.3.3.2). Смешивайте с помощью пипетки и коротко прячите. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Поставьте трубку на магнит, пока раствор не выйдет. Удалите супернатант.
      2. Промывайте 80% этанола два раза, как описано в шаге 6.1.3.
      3. Добавьте в трубку 40,5 мкл буфера EB и перемешайте с помощью пипетирования. Инкубировать 2 минуты при комнатной температуре. Покрутите его ненадолго и положите на магнит, пока раствор не прояснится.
      4. Перенесите 40 мкл амплифицированных и очищенных пространственных штрихкодных ДНК в новую трубку. Храните при −20 °C для последующего генерации индексированной библиотеки пространственных штрихкодов.
   5. Анализ размеров кДНК с помощью анализатора фрагментов. Смешайте 1 мкл амплифицированных кДНК с 1 мкл низкого буфера TE. Проверьте разбавленные ДНК с помощью Fragment Analyzer, как описано в шаге 6.2.1.
   6. Подготовка индексной библиотеки экспрессии генов
      1. Перенесите 10 мкл амплифицированных кДНК (шаг 6.3.3.5) в новую трубку. Добавьте 25 мкл буферного EB и 15 мкл фрагментационной смеси. Смешивайте, пипетируя на льду. Короткое вращение и переключение трубки в предварительно охлаждённый тепловой циклер при температуре 4 °C.
      2. Инкубировать в термическом циклере (температура крышки 65 °C), инициируя следующий протокол: один цикл 32 °C в течение 5 минут; один цикл при температуре 65 °C в течение 30 минут; 4 °C для удержания.
      3. Двойной выбор размера и очистка ДНК с помощью парамагнитных шариков (0,6X, 0,8X), как описано в шаге 6.1.3. Добавьте 50,5 мкл буфера EB и перемешайте с помощью пипетирования. Инкубировать 2 минуты при комнатной температуре. Покрутите его ненадолго и положите на магнит, пока раствор не прояснится.
      4. Перенесите 50 мкл образца в новую трубку. Добавьте 50 мкл смеси для лигирования адаптеров и перемешайте с помощью пипетирования. Покрутитесь ненадолго. Инкубировать в термоциклере (температура крышки 30 °C) по следующему протоколу: один цикл 20 °C в течение 15 минут и 4 °C для удержания.
      5. Очистка ДНК парамагнитными шариками (0,8X), как описано в шаге 5.3.5. Добавьте 30,5 мкл буфера EB и перемешайте с помощью пипетирования. Инкубировать 2 минуты при комнатной температуре. Покрутите его ненадолго и положите на магнит, пока раствор не прояснится. Перенесите 30 мкл образца в новую пробирку.
      6. Индекс ПЦР библиотеки экспрессии генов. Добавьте 50 мкл микса усилителя и 20 мкл индивидуального двойного индекса TT набора A к каждому образцу.
      7. Инкубировать в термическом циклере (температура крышки 105 °C) по следующему протоколу: один цикл при 98 °C в течение 45 секунд; всего 11 циклов при температуре 98 °C в течение 20 с, 54 °C 30 с, 72 °C в течение 20 с; один цикл 72 °C в течение 1 минуты; 4 °C для удержания.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное число циклов необходимо определить на основе типа клетки, содержания РНК и начального числа ядер. В этом эксперименте было использовано всего 11 циклов усиления.
      8. Двойной выбор размера и очистка ДНК с помощью парамагнитных шариков (0,6X, 0,8X), как описано в шаге 6.1.3. Добавьте 35,5 мкл буфера EB в трубку и перемешайте с помощью пипетирования. Инкубировать 2 минуты при комнатной температуре. Покрутите его ненадолго и положите на магнит, пока раствор не прояснится.
      9. Перенесите 35 мкл очищенной и индексированной библиотеки экспрессии генов в новую пробирку.
4. Анализ распределения размеров ДНК в библиотеке экспрессии генов. Смешайте 1 мкл библиотечных ДНК с 1 мкл буфера с низким содержанием TE. Пропустить разбавленные ДНК, как описано в шаге 6.2.1. (Рисунок 3A).
5. Подготовка индексированной библиотеки штрихкодов
   1. Подготовьте в общей сложности 100 мкл ПЦР-смеси с индексом образца следующим образом: 50 мкл Amp Mix (из GEM-X Single-Cell 3' Feature Barcode Kit), 25 мкл буфера EB, 20 мкл праймера из двойной индексной пластины TT Set A, и 1 мкл очищенных пространственных штрихкодных ДНК (шаг 6.3.4.4), разбавленных в 4 мкл буфера EB.
   2. Инкубировать в термическом циклере (температура крышки 105 °C) по следующему протоколу: один цикл при 98 °C в течение 45 секунд; всего 7 циклов по 98 °C в течение 20 с, 54 °C 30 с, 72 °C 20 с; 72 °C в течение 1 минуты; 4 °C для удержания.
   3. Очистка ДНК с помощью парамагнитных шариков (1.2X), как описано в шаге 5.3.5. Добавьте в трубку 35,5 мкл буфера EB и перемешайте с помощью пипетирования. Инкубировать 2 минуты при комнатной температуре. Поставьте трубку на магнит, пока раствор не станет чистым.
   4. Перенесите 35 мкл очищенных и индексированных пространственных библиотек штрихкодов в новую трубку. Храните при 4 °C до 72 часов или при −20 °C для длительного хранения.
6. Проверьте распределение размеров ДНК в индексированной библиотеке пространственных штрихкодов. Смешайте 1 мкл очищенной библиотечной ДНК с 1 мкл буфера с низким содержанием TE. Пропустите разбавленные ДНК с помощью Fragment Analyzer, как описано в шаге 6.2.1 (рисунок 3A).

Рисунок 3: Оценка контроля качества индексированных библиотек. (A) Профили размеров в амплифицированных ДНК и индексированных библиотеках. ДНК анализируется с помощью фрагментоанализатора для оценки качества и распределения размеров ДНК. Показаны репрезентативные профили для индексированной библиотеки CUT&Tag, амплифицированная ДНК, используемая для экспрессии генов и подготовки библиотеки пространственных штрих-кодов, индексированная библиотека экспрессии генов и индексированная библиотека пространственных штрихкодов. (B) Библиотека CUT&Tag анализируется с помощью qPCR для оценки обогащения геномного региона H3K27ac-положительного (то есть ACTB) по фоновым сигналам H3K27ac-отрицательного (то есть T1 и интергенного локуса). Разница сложний между положительными/отрицательными областями рассчитывается как^{обогащение 21}. Обогатение сложками больше 10 считается идеальным в данном^{анализе 20}. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

7. Последовательность библиотек

1. Секвенируйте библиотеку пространственных штрихкодов Trekker на глубине 5 000 пар чтения на захваченный ядро.
2. Секвенируйте библиотеку H3K27ac CUT&Tag на глубине 25 000 пар чтения на захваченный ядро.
3. Секвенируйте библиотеку экспрессии генов на глубине не менее 20 000 пар чтения на захваченный ядро.

8. Биоинформатика и анализ данных

1. Обработка экспрессии генов и считывания CUT&Tag с помощью Cell Ranger ARC v2.0.2 с --min-atac-count=100 и --min-gex-count=1000. Интегрировать выходы ARC Cell Ranger с информацией штрихкодов Trekker с помощью конвейера Trekker v1.3.0 с параметрами по умолчанию для назначения пространственных позиций.
2. Проводите контроль качества с помощью Signac. Клетки, соответствующие любому из следующих критериев, были исключены из дальнейшего анализа: для CUT&Tag общее количество фрагментов ≥ 1 000 000 или ≤ 100, а для обогащения TSS ≤ 2; для экспрессии генов общее количество UMI ≥ 100 000 или ≤ 1 000, а общее число обнаруженных генов ≥ 10 284 или ≤ 200.
3. Удалять дублеты с помощью scDblFinder для экспрессии генов и AMULET для CUT&Tag. Клетки, соответствующие любому из следующих критериев, классифицировались как дублеты: (1) балл scDblFinder ≥ 0,6; (2) оценка scDblFinder ≥ 0,3 и AMULET ≤ 0,01; и (3) в кластерах с высоким процентом дублетов.
4. Нормализуйте данные экспрессии генов с помощью LogNormalize и CUT&Tag с помощью TF-IDF. Вычислить вложения РНК PCA и CUT&Tag LSI, используя размеры LSI 2–50 для хроматиновой модальности. Постройте взвешенный граф ближайших соседей с помощью FindMultiModalNeighbors и генерируйте вложения UMAP на основе графа мультимодальных соседей.
5. Аннотировать данные Trekker после QC с помощью передачи меток Seurat на основе FindTransferAnchors и стратегии проекционного отображения PCA с стандартными параметрами. В качестве справочника использовались данные scRNA-seq из Атласа ABC (версия 20230630). Предсказания типов клеток, несовместимые с известной анатомией тканей, были удалены в ходе ручного курирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипты для биоинформатического анализа доступны на GitHub: https://github.com/Liuy12/Mouse_Brain_Trekker_Multiome_Cuttag

Results

Используя корональный срез (толщиной 25 мкм, примерно 70% покрытия пространственной плитки диаметром 10 × 10 мм) свежезамороженной мышиной мозговой ткани, описанный здесь рабочий процесс стабильно давал 50 100 ядер высокого качества (SD = 12 200, n = 8), что достаточно для низкого профилирования одноклеточного мультиомического профилирования (рисунок 1). После пространственного штрихкодирования тканевого среза ядра были выделены с помощью мягкой диссоциации тканей и дополнительно очищены с помощью комплекта для одиночной изоляции Invent. Эта процедура привела к минимальному загрязнению мусора и низкому уровню ядреной агрегации, что позволило создать препараты ядер, подходящие для одноклеточных анализов. Репрезентативные изображения изолированных ядер показаны на рисунке 2.

Для последующих анализов с одним ядром, включая мультиомное профилирование CUT&Tag (экспрессия CUT&Tag + ген), обычно здесь обрабатывалось около 50 000 ядер. Для максимизации ядерного восстановления был реализован упрощённый, оптимизированный протокол CUT&Tag с низким входом с использованием прямого таргетирования и маркировки антител–pA/Tn5, что минимизировало время инкубации и промывание^{шагов 19}. С помощью этого подхода было извлечено примерно 25 000 помеченных ядер, что соответствует среднему выходу 48,3% (SD = 6,1, n = 3). Эти ядра впоследствии использовались для штрихкодирования одной клетки с помощью 10x гелевых шариков Genomics Chromium Multiome. Для генерации GEM было выбрано примерно 15 000 ядер с ожиданием восстановления ~10 000 пространственно индексированных ядер после фильтрации качества. Основываясь на пространственном декодировании штрихкодов Trekker, 81,3% ядер (SD = 9, n = 3) из одноячейкового набора данных можно было с уверенностью назначить пространственные позиции внутри тайла.

Пространственный мультиомный рабочий процесс Trekker–CUT&Tag генерирует три индексные библиотеки: CUT&Tag, библиотеки экспрессии генов и пространственных штрих-кодов. Предварительно амплифицированная штрихкодированная ДНК делилась на две порции, каждая из которых использовалась для подготовки библиотеки в соответствии с химией захвата мишень на гелевых шариках. Библиотеки CUT&Tag были непосредственно амплифицированы из предварительно амплифицированной ДНК и демонстрировали распределение размеров фрагментов, характерные для маркировки CUT&Tag, соответствующие ДНК без нуклеосом и нуклеосомам (рисунок 3A). Библиотека показала хорошее обогащение локуса H3K27ac-положительного Actb по сравнению с отрицательными геномными локусами H3K27ac^{в 20,21} (то есть 68-кратная разница, превышая 10-кратную порогову, ранее установленную для хроматина-иммунопреципитационного анализа H3K27ac²⁰) (Рисунок 3B). Для экспрессии генов и библиотек пространственных штрихкодов предварительно амплифицированная ДНК сначала была усилена по протоколу амплификации 10x Genomics, а затем разделялась на две фракции по размеру фрагмента с помощью парамагнитной очистки шариков. Индексированная библиотека пространственных штрихкодов была подготовлена из доля, обогащённой для более коротких фрагментов, и демонстрировала резкий пик при ожидаемом размере фрагмента. Библиотеки экспрессии генов показали характерное распределение размеров, сосредоточенное вокруг амплифицированных фрагментов кДНК (рисунок 3A).

Рисунок 4: Одноклеточное и пространственное представление пространственного мультиомного анализа Trekker–CUT&Tag в ткани мозга мышей. (A) Идентификация типов клеток с помощью одноклеточного анализа. Графики равномерного приближения и проекции многообразия (UMAP) показывают аннотированные популяции клеток, полученные только из H3K27ac CUT&Tag, только экспрессии генов и интегрированного мультиомного набора данных (CUT&Tag + экспрессия генов). (B) Пространственное представление пространственных мультиомных данных Trekker–CUT&Tag. Ядра из интегрированного мультиомного набора данных присваиваются пространственным координатам с помощью штрихкодов Trekker, что позволяет выявить анатомически организованное распределение типов клеток по секции мозговой ткани мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Секвенирование и картирование библиотек экспрессии CUT&Tag и генов выполнялись с помощью Cell Ranger ARC v2.0.2 в соответствии с 10-кратными рекомендациями Genomics, а пространственные библиотеки штрихкодов обрабатывались с помощью Trekker v1.3.0 согласно рекомендациям Takara Trekker. Предложенные опции одноячейкового отображения ATAC-seq были применены к библиотекам CUT&Tag. Для CUT&Tag были созданы одноядзерные наборы данных, только для экспрессии генов и комбинированного мультиома (CUT&Tag + экспрессия генов). Клетки с общим UMI для CUT&Tag (≥ 1 000 000 или ≤ 100) или экспрессией генов (≥ 100 000 или ≤ 1000) были отфильтрованы с помощью Signac²². Прогнозирование дублета проводилось с использованием комбинации scDblFinder²³ для экспрессии генов и^{AMULET 24} для CUT&Tag. Клетки, соответствующие одному из следующих критериев, были удалены: 1) scDblFinder.score > 0,6; 2) scDblFinder.score от 0,3 до 0,6, а amulet.score < 0,01. Аннотация типов клеток проводилась с помощью FindTransferAnchors²⁵ от Seurat на основе эталонных^{данных 26} из Allen Brain Cell Atlas. Для библиотеки экспрессии генов в этом исследовании медианный уровень UMI на клетку составлял 15 378, а медианный уровень генов на клетку — 4 378. Для библиотеки CUT&Tag было обнаружено 11 860 клеток, медиана — 6 631 высококачественный фрагмент на клетку и балл обогащения TSS — 7,66. Для библиотеки пространственных штрихкодов Trekker 92,43% ядер имели пространственные позиции, а 51,54% ядер — в одном пространственном месте. Исходные данные секвенирования и обработанные данные вторичного анализа доступны через GEO под номером GSE327406. Последний аннотированный объект Seurat после QC доступен на Zenodo под номером присоединения 19475899. Репрезентативные вложения UMAP с аннотациями ячеек показаны на рисунке 4A. Связывая отдельные штрих-коды с пространственными штрих-кодами, отдельные ядра возвращались к их пространственному расположению внутри ткани для создания пространственной карты (рисунок 4B). Эта карта близко совпадает с анатомическими особенностями, наблюдаемыми в соседних секциях, и совпадает с корональным срезом мозга в Allen Brain Atlas²⁷, стандартном справочнике по анатомии мозга мышей. Совместный анализ пространственной экспрессии генов и профилей H3K27ac с одноклеточным разрешением позволил выявить основные типы клеток мозга и выявил анатомически организованные закономерности клеточного распределения по срезу ткани.

Discussion

Этот протокол описывает пространственный мультиомный рабочий процесс Trekker–CUT&Tag, который интегрирует пространственное штрихкодирование, низковводное профилирование CUT&Tag H3K27ac, одновременный захват нескольких молекулярных целей на 10x одноклеточных многоклеточных гелевых шариках Genomics и подготовку библиотеки для секвенирования Illumina. Сочетая пространственное индексирование с одноклеточными эпигеномными и транскриптомическими показаниями, этот подход решает фундаментальное ограничение традиционных одноклеточных многоклеточных анализов, в которых отсутствует нативный тканевой контекст. Это исследование успешно демонстрирует возможность пространственного мультиомного профилирования CUT&Tag (H3K27ac CUT&Tag + экспрессия генов) и закладывает основу для пространственного копрофилирования экспрессии генов и регуляторных мишеней, таких как гистонные метки и белки, ассоциированные с хроматином.

Строгий контроль качества на нескольких этапах рабочего процесса необходим для успешной реализации этого рабочего процесса (см. рисунок 1). Хотя описанная здесь процедура начинается с этапов после сечения, качество самого среза ткани критически важно для достижения оптимального результата. Толщина сечения должна корректироваться в зависимости от типа ткани и ожидаемой клеточной структуры. Во время диссоциации тканей и изоляции ядер максимизация выхода ядер при сохранении целостности ядра критически важна для общей эффективности одноклеточных многотомных тестов на основе Trekker. Низкая выходность ядер может быть вызвана неоптимальной диссоциацией тканей, неэффективной изоляцией ядер или недостаточной толщиной срезов. Плохая целостность ядерной энергии может возникать из-за чрезмерных механических нарушений, длительного времени обработки или чрезмерного срыва. Изоляция ядер является важной точкой устранения неполадок для успешной реализации одноячеточного мультиомного рабочего процесса на базе Trekker. Поэтому перед началом одноклеточного мультиомного анализа на основе Треккера настоятельно рекомендуется тканино-специфическая оптимизация протокола изоляции ядер. Изолированные ядра следует оценивать количественно и качественно. Подсчёт ядер с помощью ядерных красителей позволяет оценить выход, а микроскопическое исследование позволяет оценить целостность ядерной мембраны, агрегацию и наличие неядерного мусора. После подготовки библиотеки все библиотеки должны быть оценены на распределение размеров фрагментов и отсутствие адаптерных димеров. Для библиотек CUT&Tag обогащение целевых геномных областей на фоне должно оцениваться с помощью количественной ПЦР, что даёт раннюю оценку специфичности анализа и общего качества библиотеки до секвенирования. Контроль качества после секвенирования не менее важен для точной интерпретации пространственных мультиомных данных. Показатели, такие как скорости картирования, количество фрагментов на ядро, обогащение стартового участка транскрипции, баллы фрагментов в пик для CUT&Tag, сложность генов и глубина чтения на клетку, должны оцениваться в соответствии с рекомендованными рекомендациями от 10x Genomics и Takara Trekker. Совместная оценка этих метрик как в эпигеномных, так и в транскриптомных модальностях позволяет выявлять технические артефакты и обеспечивает надёжную интеграцию пространственной, эпигеномной и транскрипционной информации.

Хотя в этом исследовании демонстрируется осуществимость подхода штрих-кода на основе Trekker в сочетании с одноклеточным мультиомным анализом CUT&Tag, описанный подход также имеет свои ограничения. Например, метод в настоящее время ограничен только свежезамороженной тканью, и его осуществимость доказана только для профилирования одной модификации гистона (H3K27ac) в одном типе ткани (мышиный мозг) без биологических репликатов. Кроме того, подход основан на двух проприетарных коммерческих платформах (Takara Trekker и 10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome). Для оценки более широкой применимости, эффективности, обобщаемости и воспроизводимости этой технологии потребуется дальнейшая оценка по различным типам тканей и дополнительные эпигенетические отметки.

В заключение, пространственный мультиомный протокол Trekker–CUT&Tag, представленный здесь, демонстрирует возможность пространственно разрешенного одноклеточного копрофилирования эпигеномных и транскриптомных признаков. Сочетая пространственное штрихкодирование с устоявшейся одноклеточной мультиомной химией, она позволяет механистически исследовать регуляцию генов в целостной тканевой архитектуре и предоставляет мощную платформу для будущих приложений в пространственной биологии. Значимые потенциальные применения включают оценку влияния различных экспериментальных и экологических стимулов на эпигенетический контроль экспрессии генов у определённых типов клеток — например, влияние стимуляций нервов может быть проанализировано на определённые типы нейронов в центральной и периферической нервной системах, либо влияние инфильтрационных провоспалительных и противовоспалительных иммунных клеток на близлежащие клетки может быть выявлено при воспалительных заболеваниях и раках.