Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
Это исследование интегрирует сетевую фармакологию и эксперименты in vivo для изучения возможных эффектов таблетки Yougui на лечение простатита. Анализ сетевой фармакологии и лечение YGP в модели простатита у крыс показали, что терапевтические эффекты YGP могут быть связаны с регуляцией воспалительных реакций, что указывает на противовоспалительное действие YGP при простатите.
Простатит — это распространённое урологическое заболевание с ограниченными вариантами лечения. Таблетка Yougui (YGP) показала потенциальную терапевтическую ценность, особенно при заболеваниях, связанных с воспалением. Целью этого исследования было оценить его эффекты и выяснить возможные лежащие механизмы. Активные компоненты YGP были скринингированы из TCMSP с использованием критериев пероральной биодоступности (OB ≥ 30%) и подобия препарата (DL ≥ 0,18), а также были собраны соответствующие мишени. Мишени, связанные с простатитом, были получены с помощью GeneCard, а перекрывающиеся мишени анализировались с помощью сетей взаимодействия белков и белка (PPI) и обогащения Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG). Было выявлено всего 126 активных соединений и 208 потенциальных мишеней, при этом 180 перекрывающихся целей связаны с простатитом. Анализ PPI выявил TP53, IL6, AKT1, TNF и IL1B как ключевые гены хаба. Обогащение KEGG показало участие воспалительных путей, включая сигнальные пути IL-17, TNF, MAPK и PI3K-Act. Модель простатита у крыс была установлена путём интрапростатической инъекции каррагинана. Для оценки терапевтического эффекта проводились гистологическое исследование и измерение фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и интерлейкина-6 (IL-6). Лечение YGP улучшило гистопатологию простаты и снизило уровень TNF-α и IL-6 на уровнях белка и мРНК. Эти результаты свидетельствуют о том, что YGP оказывает противовоспалительное действие при простатите, в то время как конкретные молекулярные механизмы ещё предстоит дополнительно подтвердить.
Простатит — это состояние, при котором предстательная железа воспаляется с отёком ираздражением 1. Он составляет примерно 25% глобальных урологических клиническихвстреч 2. Национальные институты здравоохранения (NIH) расточили простатит на четыре категории: острый бактериальный синдром, хронический бактериальный синдром, хронический простатит/хронический синдром тазовой боли (CP/CPPS) и бессимптомныйпростатит 3. Среди них наиболее распространённой формой является CP/CPPS, тесно связанная с устойчивым воспалением и дисрегуляцией иммунитета. Несмотря на достижения в понимании воспалительной природы простатита, текущие терапевтические стратегии остаются ограниченными, особенно для небактериальныхподтипов 4,5. Антибиотики широко применяются в клинической практике; однако их эффективность при небактериальном простатите вызывает большиеспоры 6. Другие методы лечения, от α-блокаторов до нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВС), в основном нацелены на облегчение симптомов, но часто показывают неоптимальные результаты, с незначительным риском желудочно-кишечных нарушений, ортостатической гипотензии и так далее 7,8,9,10. Эти ограничения подчёркивают необходимость альтернативных терапевтических подходов, которые могут эффективно модулировать воспаление при простатите.
Традиционная китайская медицина (ТКМ) может предлагать более широкий спектр терапевтических преимуществ с более благоприятным профилем безопасности ипереносимости 11. Таблетка Югуй (YGP), классическая формула, задокументированная в книге «Цзинъюэ Цюаньшу», эмпирически используется на протяжении веков для восстановления почечно-янг и облегчения связанных с ними заболеваний. Предыдущие исследования сообщали, что некоторые его составляющие обладают противовоспалительнымисвойствами 13,14,15,16. Клинические данные свидетельствуют о том, что YGP может эффективно облегчать симптомы простатита, хотя основной механизм остаётсянеясным 17. Сетевая фармакология служит мощным интегративным подходом, объединяющим системную биологию и фармакологию для раскрытия сложных механизмов традиционноймедицины 18. Выдвигалась гипотеза, что YGP может оказывать противовоспалительное действие, модулируя множество мишеней и связанных с воспалениями путей. Эти прогнозы были дополнительно оценены с помощью модели in vivo простатита, при которой простатит вызывался инъекцией каррагинана. После внедрения модели животных лечили YGP. Ткани предстательной железы были собраны для гистопатологического исследования с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (HE), а также для количественной оценки воспалительных маркеров с помощью ферментно-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA) и количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Пекинского университета китайской медицины (BUCM-2024110107-4103).
Коллекция активных компонентов и целей
YGP включает Rehmannia glutinosa, Aconitum carmichaelii, Cinnamomum cassia, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Cuscuta chinensis, Angelica sinensis, Eucommia ulmoides, Cervi Cornus Colla и Lycium barbarum. Эти названия трав вводились в базу данных и аналитическую платформу традиционных китайских медицинских систем фармакологии (TCMSP) для извлечения их соединений. Активные соединения были скринингированы с использованием критериев пероральной биодоступности (OB ≥ 30%) и подобия препарата (DL ≥ 0,18) 19,20,21. Соответствующие мишени каждого соединения были получены из TCMSP и стандартизированы в генные символы с помощью базы данных UniProt. Мишени, связанные с простатитом, были извлечены из базы данных GeneCards с использованием ключевого слова «простатит», а для включения в исследование были отобраны гены с показателем релевантности выше среднего.
Создание регулирующей сети YGP против простатита
Пересечение мишеней, связанных с YGP, и простатитом, было определено как набор потенциальных терапевтических целей. Эти мишени были импортированы в Cytoscape (версия 3.9.1) для построения сети соединений-мишеней заболеваний. Анализ топологии сети проводился с помощью плагина CytoHubba, и ключевые компоненты были определены на основе значений максимальной центральности клик (MCC) 22.
Анализ сетей взаимодействия белков и белков (PPI)
Перекрывающиеся цели импортировались в базу данных STRING (версия 11.5), при этом организм был настроен на Homo sapiens. Минимальный требуемый балл взаимодействия был установлен на уровне ≥ 0,7, а отключённые узлы былискрыты 23. Данные взаимодействия экспортировались в формате TSV и визуализировались в Cytoscape. Гены хаба были дополнительно идентифицированы с помощью плагина CytoHubba на основе центральной степени.
Анализ пути KEGG и обогащения GO
Общие мишени были загружены на платформу Metascape для анализа путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG). Входные и аналитические виды были установлены как Homo sapiens. Был проведён анализ обогащения путей KEGG. Пути дополнительно фильтровались на основе их связи с простатитом, определённой опубликованной литературой и аннотациями в базах данных. Оставшиеся пути ранжировались по их значениям Log P. Наверх обогащённые пути KEGG визуализировались с помощью пузырьковых графиков.
Молекулярная стыковка
Ключевые мишени были выбраны из сети PPI на основе центральной степени, а активные соединения идентифицированы из регуляторной сети YGP-prostatitis на основе значений MCC для последующего анализа стыковки. Структуры белков были получены из базы данных AlphaFold Protein Structure в формате PDB, а структуры лигандов были скачаны из TCMSP в формате mol224. Молекулярная стыковка проводилась с помощью онлайн-платформы CB-Dock225. До стыковки белковые структуры автоматически предварительно обрабатывались путём удаления молекул воды, добавления атомов водорода и заполнения недостающих остатков. Фиксировались аффинности связи, а тепловые карты создавались с помощью GraphPad Prism (версия 10.1.2). Трёхмерные структуры лиганд-белковых комплексов с наименьшими показателями Vina визуализировались с помощью ChimeraX, а двумерные диаграммы взаимодействия были сгенерированы с помощью LigPlus.
Подготовка из водного экстракта YGP
Растительные компоненты YGP были приготовлены в соответствии с традиционным соотношением формул, включая 24 г обработанного корня Rehmannia glutinosa (Shudihuang), 6 г обработанного латерального корня Aconitum carmichaelii (Fuzi), 6 г коры Cinnamomum cassia (Rougui), 12 г корневища Dioscorea напротив (Shanyao), 9 г плода Cornus officinalis (Shanzhuyu), 12 г семени Cuscuta chinensis (Tusizi), 12 г обработанного желатина из рогов Cervi Cornus Colla (Lujiaojiao), 12 г плода Lycium barbarum (Gouqi), 9 г корня Angelica sinensis (Danggui) и 12 г коры Eucommia ulmoides (Duzhong). Все травы, кроме Aconitum carmichaelii и Cervi Cornus Colla, замачивались в дистиллированной воде в 6 раз большей от общей массы на 30 минут, а Aconitum carmichaelii замачивался отдельно в 6-кратной дистиллированной воде. Aconitum carmichaelii сначала отварили с помощью электрического нагревательного устройства в течение 1 часа, после чего оставшиеся травы, за исключением Cervi Cornus Colla, добавлялись и дважды отваривались по 1 час в каждом цикле. Cervi Cornus Colla затем плавили в водяной бане при температуре 60–70 °C до полного растворения и включения в экстракт. После охлаждения напой фильтровали через двухслойную марлю, алицитировали, замораживали при -20 °C в течение 48 часов и лиофилизировали для получения порошкового экстракта.
Модель животных и экспериментальный дизайн
Самцы крыс рода Спраг-Доули (8 недель, вес 200–220 г) содержались в определённых условиях, свободных от патогенов, с 12-часовым циклом света и темноты и свободным доступом к корму и воде. Через неделю акклиматизации крыс случайным образом делили на три группы (n = 6 на группу): контрольные, модельные и YGP-группы. Хронический простатит был вызван интрапростативным введением 3% растворакаррагинана 26. Кратковременно крыс анестезировали изофлураном (3–4% для индукции и 1,5–2% для поддержания), а также был сделан разрез на середине живота, чтобы обнажить простату. В каждую вентральную долю простаты было введено всего 25 мкл раствора 3% каррагинана. Контрольная группа получила внутрипростатную инъекцию только обычного физиологического физиологического раствора. Послеоперационный пенициллин (2,5 × 105 U/кг) вводился внутримышечно в течение 3 дней.
Порошок лиофилизированного экстракта YGP был приготовлен из навара и восстановлен в 0,9% стерильном нормальном физиологическом растворе для получения равномерной суспензии для перорального гаважа (10,54 г/кг/сутки). Крысы из группы YGP получали пероральное введение экстракта YGP (10 мл/кг), а контрольные и модельные группы — эквивалентный объём 0,9% стерильного физиологического раствора. Через 4 недели крыс были анестезиированы пентобарбиталом натрием (50 мг/кг, интрабрюшинная инъекция), а ткани предстательной железы были взяты после жертвоприношения в соответствии с этическими нормами.
Гистопатологическое исследование
Ткани предстательной железы фиксировались в 4% параформальдегиде в течение 24 часа, обезвоживались с помощью градированного этанола (75% спирта 4 часа, 85% спирта 2 часа, 90% спирта 2 часа, 95% спирта 1 часа, абсолютный этанол 1 час), очищены в ксилоле и добавлены в парафин. Срезы (4–5 мкм) затем подвергались окрашиванию HE согласно стандартнымпроцедурам 27. Кратковременно срезы депарафинизировали, регидратировали, окрашили гематоксилином, дифференцировали и контрокрашивали эозином. После обезвоживания и монтажа срезы наблюдались под световым микроскопом для гистопатологической оценки.
Гистопатологическое воспаление оценивалось с помощью полуколичественной системы оценки, основанной на инфильтрации воспалительных клеток, пролиферации фибробластов, морфологии ацинаров и статусе секреции. Инфильтрация воспалительных клеток оценивалась как 0 (нет инфильтрации), 2 (лёгкая инфильтрация), 4 (умеренная инфильтрация) и 6 (тяжёлая инфильтрация). Пролиферация фибробластов оценивалась как 0 (отсутствует), 1 (лёгкая), 2 (умеренная) и 3 (тяжелая). Ацинарная морфология оценивалась как 0 (большой ацинарный просвет), 1 (умеренно уменьшенный просвет), 2 (заметно уменьшенный просвет) и 3 (окклюзия или исчезновение ацинарных просветов). Статус секреции оценивался как 0 (обильная секреция), 1 (умеренная секреция), 2 (скудная секреция) и 3 (отсутствие секреции). Общий гистопатологический балл рассчитывался как сумма всех четырёх параметров, при этом более высокие показатели указывали на более тяжёлое повреждение ткани предстательной железы ивоспаление 28.
ЭЛИЗА
Ткани предстательной железы (100 мг) промывались ледяным фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS) и гомогенизировались в буфере лизис, дополненном ингибиторами протеаз. Гомогенаты инкубировали при 4 °C в течение 30–120 минут и центрифугировали при 5000 × г в течение 15 минут при 4 °C для сбора супернатантов. Уровень белка TNF-α и IL-6 измерялся с помощью наборов ELISA согласно инструкции производителя. Стандарты и образцы добавлялись к пластинам с 96 лунками и инкубировали при 37 °C, после чего следовала последовательная инкубация с биотинилированными антителами и конъюгатами ферментов. После промывки добавляли раствор субстрата для проявления цвета, и реакция прерывалась стоп-раствором. Поглощение измерялось при 450 нм с помощью считывателя микропластин. Концентрации цитокинов рассчитывались на основе стандартных кривых.
qRT-PCR
Общая РНК была извлечена из тканей простаты методом на основе столбцов и количественно измерена поглощением на 260 и 280 нм для оценки чистоты. Образцы РНК были обратно транскрипированы в кДНК при 42 °C в течение 15 минут с помощью комплекта обратной транскрипции. qRT-PCR проводилась с использованием термоциклера при следующих условиях: начальная денатурация при 95 °C в течение 3 минут, затем 40 циклов при 95 °C в течение 10 с и 60 °C в течение 30 с. Последовательности праймеров, используемые в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице 1. Флуоресцентные сигналы собирались во время этапа отжига/расширения. Уровни экспрессии TNF-α и IL-6 были нормализованы до внутреннего референсного гена GAPDH. Относительная экспрессия генов рассчитывалась с помощью метода 2−ΔΔCt .
Статистический анализ
Все данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Статистический анализ проводился с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (версия 10.1.2). Распределение данных оценивалось на нормальность перед анализом. Различия между несколькими группами анализировались с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA), а затем последовал пост-хок тест Тьюки для множественных сравнений. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Идентификация биоактивных компонентов и целевых генов
Было выявлено всего 126 биоактивных компонентов в YGP, соответствующих критериям (OB ≥ 30% и DL ≥ 0,18). соответствующее 208 предсказанным целевых генам. База данных GeneCards дала 9 845 генов, связанных с простатитом. Анализ Венна выявил 180 перекрывающихся генов между предсказанными мишенями YGP и генами, связанными с простатитом, что позволяет предположить, что эти общие мишени могут опосредовать терапевтические...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Патологически простатит характеризуется повышенным присутствием воспалительных клеток в паренхиме предстательной железы илимезенхиме 28,29. В исследовании более 5 миллионов корейских мужчин, за которыми наблюдали в течение девяти лет, Ким и соавт. подтвердили с помощью многомерного анализа, что простатит значительно повышает риск развития ракапростаты 30. Однако текущее клиническое лечение остаётся огранич...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы не сообщают о конфликтах интересов в этой работе.
Авторы с благодарностью выражают признательность за финансовую поддержку от Фундаментальных исследовательских фондов центральных университетов (2022-JYB-JBZR-037).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4% параформальдегид | Beyotime | P0099-3L | |
| База данных структуры белков AlphaFold | База данных структуры белков AlphaFold | https://alphafold.ebi.ac.uk/ | |
| BeyoFast SYBR Green qPCR микс (2 раза) | Beyotime | D7260 | |
| Онлайн-платформа по биоинформатике | Онлайн-платформа по биоинформатике | http://www.bioinformatics.com.cn/ | |
| Каррагинан | OriLeaf | S30559 | |
| CB-DOCK2 | CB-DOCK2 | http://183.56.231.194:8001/cb-dock2/php/blinddock.php | |
| Цитоскейп | Цитоскейп | https://cytoscape.org/ | |
| GeneCards | GeneCards | https://www.genecards.org/ | |
| Гематоксилин и эозин (H& E) Набор для окрашивания | Beyotime | C0105S | |
| Метаскейп | Метаскейп | https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1 | |
| Нейтральный бальзам | Servicebio | WG10004160 | |
| Парафиновый воск (для вложения) | Servicebio | RP-15 | |
| Коктейль с ингибиторами протеазы (100 раз) | Эпизим | GRF101 | |
| Набор ELISA Rat IL-6 | Beyotime | PI328 | |
| Крыса TNF и альфа; Набор | Пекин 4A Биотех Ко., Лтд | CRE0003 | |
| Набор для изоляции РНК Animal Long RNA Long Equipment с спин-колонкой | Beyotime | R0026 | |
| СТРУНА | СТРУНА | https://string-db.org/ | |
| TCMSP | TCMSP | https://www.tcmsp-e.com/#/database | |
| Uniprot | Uniprot | https://www.uniprot.org/ |