Оптически прозрачное окно черепа (HOTS) на голове для глубокой транскраниальной съёмки коры мыши

Краткое содержание

Этот протокол описывает окно с оптически прозрачным черепом (HOTS), установленное на голове, основанное на оптимизированной двухэтапной процедуре очистки черепа. Этот подход даёт высокопрозрачный череп, позволяющий снимать кору головного мозга взрослой мыши с помощью двух фотонов на глубинах до ~800 мкм.

Аннотация

Высокоразрешающая двухфотонная съёмка коры мозга взрослой мыши сильно ограничена рассеянием света от черепа, которое ослабляет сигналы и ограничивает глубину изображения in vivo. Хотя методы очищения черепа были разработаны для обеспечения оптического доступа к коре через целый череп, их практическая эффективность ограничена ограниченным временем очистки и неоптимальными коктейлями очищения. Здесь мы представляем подробный протокол реализации окна с оптически прозрачным черепом (HOTS), установленного на голове. В этом подходе для поддержания растворов очищения черепа использовалась на голове, что позволяло избежать длительного наркоза или физического ограничения и обеспечивало длительное очищение черепа (несколько часов) у бодрствующих, свободно ведущих себя мышей. Кроме того, была проведена двухэтапная процедура очищения с использованием реагентов (HOTS-S1: 10% масса/в ЭДТА, 15% масс/в D-манноза, 10% масс/в сульфолана, 0,5% масс/в Твин 20; HOTS-S2: 70% масса/в D-манноза, 5% массы/в сульфолана, 0,5% масс/в в Среднем возрасте 20), оптимизировано с помощью систематического химического скрининга. Мы предлагаем пошаговый протокол, включающий экспонирование и стабилизацию черепа, создание и установку крышки, установленной на голове, доставку и обновление очищающих реагентов, а также последующую подготовку к визуализации. У мышей возрастом 6 недель (~20 г) протокол HOTS регулярно создаёт высокопрозрачный череп, поддерживающий двухфотонную визуализацию корковых структур на глубинах до ~800 мкм ниже pia, что приближается к производительности окон с открытым черепом. Окно HOTS позволяет проводить структурную визуализацию у мышей Thy1-GFP-M и функциональную кальциевую визуализацию у мышей Thy1-GCaMP6s. Мы считаем, что как удобный и минимально инвазивный подход окно HOTS значительно способствует глубокой транскраниальной визуализации и оптогенетическим, фотофармакологическим и другим световым манипуляциям in vivo.

Введение

Интравитальный мониторинг кортикальных нейронов необходим для понимания структуры и функций^{мозга 1}. Двухфотонная микроскопия (TPM) является ключевым инструментом для таких in vivo ^{исследований 2,3}. Однако качество изображения и глубина резко ограничены сильным рассеянием света от непрозрачного черепа, лежащего над корой ^4,5.

Окна с открытым^{черепом 6} и с утонченным^{черепом 7,8} значительно улучшили оптический доступ к коре и широко используются, но оба подхода имеют свои ограничения. Окна с открытым черепом могут вызывать острые повреждения мозга и воспалительные^{реакции 9,10}, тогда как истончение черепа технически сложно и трудно достичь равномерной^{толщины 11,12}.

Методы оптической очистки черепа in vivo предлагают минимально инвазивную альтернативу, позволяющую делать двухфотонную визуализацию с аксональным разрешением у взрослых мышей. Однако достижимая глубина изображения остаётся ограниченной (обычно 150–400 мкм ниже pia)12,13,14,15. На практике очищение черепа обычно ограничивается коротким периодом под наркозом с жёсткой фиксацией головы, а систематическая оптимизация коктейлей для очищения для состава костей черепа остаётся недостаточно^{изученной} 12,13,14,15.

Чтобы преодолеть эти ограничения, мы ранее разработали окно с оптически прозрачным черепом (HOTS), установленное на голове, поддерживающее длительное офлайн-очищение черепа у свободно ведущих себя мышей (рисунок 1A)¹⁶. Этот подход использует двухэтапную процедуру очистки с использованием реагентов (S1 и S2), которые были оптимизированы систематическим химическим скринингом в нашей предыдущей работе¹⁶. Систематическая оптимизация клиринговых реагентов и характеристика эффективности клиринга, обратимости, биобезопасности и эффективности визуализации in vivo окна HOTS были описаны в нашей предыдущей^{работе 16}, которая также показала благоприятный астроглиальный ответ после лечения HOTS. Здесь мы представляем пошаговый протокол установления окна HOTS для обеспечения глубокой транскраниальной двухфотонной визуализации у взрослых мышей. В репрезентативной подготовке глубины изображения достигают ~800 мкм ниже пиа, что почти соответствует тем, что можно достичь с открытыми окнами. Окно HOTS позволяет проводить глубокую структурную визуализацию у мышей Thy1-GFP-M и функциональную кальциевую визуализацию у бодрствующих мышей Thy1-GCaMP6s.

Протокол

Все процедуры по уходу за животными и экспериментальные процедуры были одобрены Гуандунским провинциальным комитетом по уходу и использованию животных и выполнялись в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике экспериментов на животных Шэньчжэньского института передовых технологий Китайской академии наук. Реагенты и оборудование, используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для мышей в возрасте 6 недель (масса тела ~20 г), у которых толщина черепа составляет примерно 100 мкм.

1. Подготовка растворов для очищения черепа

1. Приготовьте раствор для очищения черепа S1 (10% масса/в ЭДТА, 15% масс/в D-манноза, 10% масс/в сульфолан, 0,5% масс/в Твин 20; RI: 1,38; конечный pH: 7.0-7.4)
   1. Весит 0,35 г гидроксида натрия (NaOH). Добавьте её в 20 мл деионизированной воды в стакан и перемешайте до полного растворения. Это повышает pH раствора, способствуя последующему растворению ЭДТА.
      ПРИМЕЧАНИЕ: NaOH — коррозия. Наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторный халат, защитные очки) и держите их в капюшоне с химическим паром.
   2. Добавьте 4 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в раствор NaOH. Поставьте стакан в водяную ванну при температуре 40 °C и постоянно помешивайте, пока EDTA полностью не растворится.
   3. Охладите смесь до комнатной температуры. Добавьте в раствор 6 г D-маннозы, 4 г сульфолана и 0,2 г Tween 20. Перемешивайте при комнатной температуре, пока все компоненты полностью не растворятся.
   4. Добавьте деионизированную воду, чтобы получить итоговый объём до 40 мл. Тщательно перемешайте, чтобы получить S1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: S1 можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
2. Приготовьте раствор для очищения черепа S2 (70% масс/в D-маннозы, 5% масс/в сульфолана, 0,5% масс/в Твин 20; окончательный RI: 1,44; конечный pH: 7,0-7,4)
   1. Взвесьте 28 г D-маннозы, 2 г сульфолана и 0,2 г Tween 20 и переложите их в чистый стакан.
   2. Добавьте деионизированную воду примерно до 30 мл и перемешайте при комнатной температуре, пока все компоненты полностью не растворятся.
   3. Добавьте деионизированную воду, чтобы увеличить итоговый объём до 40 мл, и тщательно перемешайте, чтобы получить S2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкое нагрев (25–30 °C) и непрерывное перемешивание ускоряют растворение D-маннозы. S2 можно хранить при комнатной температуре несколько месяцев.

2. Подготовка к операции

1. Автоклавуйте все хирургические инструменты и тщательно стерилизуйте рабочее пространство 75% алкоголем.
2. Анестезия мыши путём внутрибрюшнической инъекции 1% (w/v) пентобарбитала натрия (150–200 мкл на 20 г массы тела).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие обратимые анестетики могут использоваться в качестве альтернативы пентобарбиталу натрия.
3. Контролируйте глубину анестезии с помощью теста на рефлекторный рефлекс на пальце ног и убедитесь, что мышь полностью анестезирована перед началом операции.
4. Поместите мышь в стереотаксичную раму и закрепите голову ушными планками.
5. Поддерживайте температуру тела на уровне 37 °C с помощью грелки.
6. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить пересыхание роговицы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно следите за дыханием и рефлексами, чтобы избежать передозировки анестезией и подавления дыхания.

3. Операция и установка налобной пластины

1. Экспозиция и очистка черепа (Рисунок 1Ba)
   1. Удалите кожу головы по всей поверхности спинного черепа с помощью тонких щипцов и хирургических ножниц. Обрезайте кожу латерально, чтобы обнажать края височных мышц и сзади к мышцам шеи.
   2. Аккуратно удалите надкостник с поверхности черепа с помощью тонких щипцов.
   3. Очистите поверхность черепа влажным аппликатором с хлопковым наконечником и высушите череп мягким потоком воздуха.
   4. Если требуется точная локализация функциональных областей коры головного мозга, на поверхности черепа с помощью стереотаксического аппарата отметьте точки отсчёта с интервалом 1 мм.
2. Нанесение зубного цемента и головной пластины (рисунок 1Bb)
   1. Подготовьте зубной цемент согласно инструкциям производителя. Рекомендуется использовать зубные цементы с прочной адгезией и долговечностью, подходящие для длительной фиксации, чтобы обеспечить стабильное крепление.
   2. Нанесите тонкий слой зубного цемента на открытую поверхность черепа и окружающие ткани для защиты, оставив область, предназначенную для окна очистки, без покрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После смешивания порошковых и жидких компонентов зубного цемента в соотношении объёма 1:1 подождите примерно 10 секунд, пока цемент прилипнет к кончику зубочистки перед нанесением. Это снижает плавность и улучшает управляемость. Во время нанесения наносите цемент от края к отведённому окну и полностью не пускайте цемента. Очищенная область определяется границей зубного герметика (зубного цемента и мягкого вкладышного материала) на поверхности черепа. Поэтому его размер можно регулировать, но он ограничен черепными швами или размером шапочки. Для обычного применения в одном полушарии очищенная область обычно имеет диаметр ~3–5 мм.
   3. Закрепите к черепу небольшой титановый наголовной пластину (для фиксации головы на индивидуальном держателе при последующем съёмке) с помощью зубного цемента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для фиксации головы могут использоваться разные конструкции наголовной пластины. В этом исследовании успешно использовались как коммерчески доступные головные пластины, так и индивидуальные двухотверстиеные титановые пластины. Независимо от конструкции, головная пластина должна обеспечивать достаточную механическую устойчивость для последующего съёмки и не препятствовать предполагаемому окну для зачистки/съёмки.

4. Создание окна HOTS

1. Запечатайте череп самозастывающим мягким подкладочным материалом для зубов (рисунок 1Bc)
   1. После полного затвердевания зубного цемента примерно на 5 минут покройте цементный слой, исключая область с окном очистки, тонким слоем самозатвердяющего мягкого зубного вкладышного материала, чтобы создать непрерывное уплотнение над черепом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкий вкладыш улучшает герметизацию и снижает утечку при длительном воздействии очищающих реагентов.
   2. Сформируйте самозатвердевающий мягкий зубной вкладыш плавно вокруг запланированного края окна, создавая плоскую герметичную поверхность для крышки.
2. Крепление крышки (рисунок 1Bd)
   1. Отрежьте головку одноразовой пластиковой пипетки (полиэтилен, PE), чтобы получить небольшую цилиндрическую крышку с закрытой верхом и открытым дном. PE демонстрирует хорошую химическую стабильность и не демонстрирует видимого разрушения или реакции с растворами очистки S1 или S2 во время процедуры очистки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колпачка, вырезанная из головки раздаточной пипетки объёмом 1 мл, обычно имеет диаметр ~12 мм и высоту ~10–14 мм.
   2. Наместите крышку на специально отведённое окно и аккуратно прижмите её к мягкому материалу подкладки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колпачок больше очищенной области, и часть черепа под ней, которая не используется для очищенной области, может быть нанесена зубным герметиком для защиты черепа от очищения.
   3. Закрепите крышку с помощью дополнительного мягкого подкладки вокруг основания, убедившись, что соединение между крышкой и черепом полностью запечатано.
   4. Используйте шприц объёмом 1 мл с иглой 26 G, чтобы проколоть одно или несколько небольших отверстий в стенке крышки, чтобы служить портами для введения и удаления растворов для очистки.
   5. Дайте мягкому материалу полностью затвердеть. Убедитесь, что крышка прочно закреплена и на интерфейсе не осталось видимых зазоров.
   6. Вынимите мышь из стереотаксичной рамки и поместите её в тёплую клетку до полного восстановления после анестезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это подходящая точка остановки. Проведите процедуру очищения черепа после полного затвердевания зубного цемента и мягкого вкладышного материала. В нашей практике окно HOTS можно установить во второй половине дня, а затем очищать череп утром, когда мышь полностью восстановится после операции. В качестве альтернативы очистку черепа можно начать примерно через 15 минут после установки окна HOTS. Во время установки окон HOTS череп остаётся структурно целым, хотя надостность удаляется.

5. Очищение черепа у бодрствующих мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время уборки мышь остаётся бодрствующей и свободно ведёт себя в своей клетке. Кратковременную анестезию изофлурана используйте только для введения раствора и обмена через крышку, установленную на голове.

1. Начальная загрузка S1
   1. Поместите мышь в индукционную камеру и введите кратковременную анестезию с 3–4% изофлурана в воздухе при расходе 300–500 мл/мин, пока мышь не станет неподвижной. Поддерживающая анестезия не применялась.
   2. Аккуратно фиксируйте мышь и стабилизируйте колпачок на голове вручную.
   3. Используйте шприц объёмом 1 мл с иглой 26 G, чтобы медленно ввести примерно 1 мл S1 в крышку, установленную на головке.
   4. Верните мышь в домашнюю клетку и позвольте S1 воздействовать на череп в течение 2 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инкубации S1 и S2 размещайте мышь индивидуально в стандартной клетке.
2. Свежий первый сезон
   1. Через 2 часа после первоначальной загрузки S1 снова кратковременно анестезируйте мышь изофлураном.
   2. Аспирируйте S1 из крышки с помощью шприца на 1 мл.
   3. Заполните крышку свежим S1 с помощью шприца на 1 мл.
   4. Верните мышь в клетку и дайте S1 действовать ещё 2 часа.
   5. Повторяйте шаги 5.2.1–5.2.4 через 4 часа после первоначальной загрузки, чтобы выполнить вторую замену S1.
   6. После второй замены позвольте S1 продолжать действовать до достижения общего времени экспозиции S1 в 6 час.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол (1 мл S1 на 6 ч) оптимизирован для мышей в возрасте 6 недель (~20 г). Для пожилых животных с толстыми черепами время инкубации S1 может постепенно увеличиваться. Любая корректировка должна сопровождаться тщательным контролем за благополучием животных и качеством конечной визуализации, чтобы избежать чрезмерного размягчения черепа.
3. Применение S2
   1. После 6 часов обработки S1 кратковременно анестезируйте мышь изофлураном.
   2. Аспирируйте S1 из крышки шприцом на 1 мл и замените на 0,7 мл S2.
   3. Верните мышь в клетку и позвольте S2 воздействовать на череп в течение 1 часа для дополнительной прозрачности и обеспечения сопоставления показателей преломления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В таких условиях совместная фаза очистки S1 и S2 обычно завершается в течение 7 часов (6 часов S1 + 1 ч S2). Успешное очищение характеризуется видимой прозрачной поверхностью черепа без кровотечения. Череп может немного смягчаться после очищения; При мягком прикличии тонким щипцом он должен проявлять лёгкую поддержку, но оставаться структурно целостным. Избегайте чрезмерного давления на поверхность черепа.

6. Подготовка к визуализации

1. Анестезия и фиксация головы для визуализации
   1. В конце инкубации S2 анестезируйте мышь путём внутрибрюшнической инъекции 1% (w/v) пентобарбитала натрия при 150–200 мкл на 20 г массы тела.
   2. Подтвердите адекватную анестезию с помощью теста на рефлектор на сжатие пальцев.
   3. Починьте головку мыши, прикрутив титановую пластину к индивидуально разработанному держателю головки.
   4. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить пересыхание во время визуализации.
   5. Поддерживайте температуру тела на уровне ~37 °C с помощью грелки.
2. Обнажение очищенной поверхности черепа (рисунок 1B, e,Bf)
   1. Аспирируйте раствор S2 из крышки с помощью шприца.
   2. Аккуратно разрежьте пластиковую крышку тонкими ножницами и снимите её щипцем, избегая чрезмерного давления на череп.
   3. Аккуратно снимите мягкую подкладку вокруг окна для очистки, чтобы полностью обнажить очищенную область черепа.
   4. Нанесите небольшую каплю раствора S2 непосредственно на очищенный череп, чтобы она служила средой для погружения с показателем преломления во время визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались стандартные объективы для погружения в воду, включая объектив 16×/NA 0.8 (N16XLWD-PF, Nikon) и объектив 25×/NA 1.1 (N25X-APO-MP, Nikon). При использовании S2 в качестве погружения корректирующий воротник объектива, если он доступен, на соответствующую уровню показателя преломления S2, чтобы уменьшить сферические аберрации. В этих экспериментах очищенный череп сохранял достаточную оптическую чистоту для примерно 2 часа двухфотонной съёмки, при этом при наблюдении дендритного позвоночника не было заметного ухудшения качества изображения. Примерно через 2 дня потребовалась повторная очистка для дальнейшей визуализации, и время повторной очистки было значительно короче, чем при первоначальном очищении, что позволяло эффективно проводить повторную съёмку с одного и того же животного.
3. Бодрствующая фиксированная голова (опционально)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для бодрствующей визуализации привычьте мышь к фиксации головы перед экспериментом. Кратко анестезируйте мышь изофлураном, затем закрепите имплантированную головную пластину на держателе на 15–30 минут за сеанс и повторите это 2–3 дня.
   1. Используйте кратковременную анестезию изофлурана для облегчения обращения. Закрепите к держателю только имплантированную головную пластину, позволяя корпусу свободно двигаться по ходовому колесу или платформе.
   2. Следуйте шагам 6.2.1–6.2.4, чтобы открыть очищенную поверхность черепа, и примените S2 перед снимком.

7. Восстановление

1. После визуализации аккуратно аспирируйте и удалите остатки раствора S2 с поверхности черепа.
2. Промывайте очищенную область черепа фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), чтобы способствовать постепенному восстановлению естественного непрозрачного состояния черепа.
3. Аккуратно высушите остаточную жидкость из черепа и окружающих тканей стерильными ватными палочками, чтобы избежать механических повреждений кости.
4. Если животное сохраняется в живом для последующих экспериментов, нанесите слой биосовместимого герметика Kwik-Cast (WPI) на окно черепа для защиты кости в период выживания.
5. Дайте защитному слою полностью затвердеть.
6. Отсоедините мышь от держателя для головы и поместите её в тёплую клетку. Следите за животным, пока оно полностью не восстановится после наркоза, затем возвращайте его в домашнюю клетку.

Результаты

Следуя протоколу, окно с оптически прозрачным черепом (HOTS) на голове позволяет проводить глубокое транскраниальное двухфотонное изображение у взрослых мышей, сохраняя целостность черепа. Успешная подготовка характеризуется двумя ключевыми результатами: (1) кортикальная сосудистая система становится чётко видимой сквозь череп при очищении (рисунок1B f), и (2) очищенный череп при лёгком давлении показывает небольшую вмятину, что указывает на...

Обсуждение

Метод HOTS использует окно с оптически прозрачным черепом (HOTS), установленное на голове, которое сочетает крышку с очищающими реагентами с двухступенчатой процедурой очищения черепа для повышения прозрачности черепа у взрослых мышей при сохранении целостности черепа. Согласно стандартному протоколу (6 ч у S1 и 1 час в S2 для 6-недельных мышей) получившееся окно надёжно поддерживало глубокое транскраниальное двухфотонное изображение и позволяло визуализировать структуры на расстоянии ~8...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Одноразовая пипетка объёмом 1 мл	Beijing Biotopped  Наука   & Технологии  Co., Ltd.	Н/Д
Зубной цемент	Шанхайская стоматологическая компания Rongxiang Dental Materials Co., Ltd.	Н/Д
D-манноза	Маклин	D813082
EDTA	Аладдин	El 16428
Изофлуран	Задний привод	Н/Д
Kwik-Cast	WPI	Н/Д	Биосовместимый герметик
Нет,	Маклин	S832169
Самоотверждающийся        стоматология и bsp;         Мягкий подкладочный материал	Yangmahu Biotechnology (Hebi) Co., Ltd.	Н/Д
Пентобарбитал натрия	Биопайк	Н/Д
Стереотаксический аппарат	Задний привод	Н/Д
Стерильный одноразовый шприц	Минанк	Н/Д	1 мл; Игла 26 г
Сульфолан	Маклин	S817950
Мыши Thy1-GFP-M		Н/Д	Предоставлено  Профессор Ян Чжань
Thyl-GCaMP6s  мыши	Лаборатория Джексона
Tween 20	Сигма-Ветек	V900548
Объект погружения в воду;	Nikon	N25X-APO-MP	25 и раз;/NA 1.1 objective
Объект погружения в воду;	Nikon	N16XLWD-PF	16 и раз;/НА 0,8 объектива