Методическая статья

Визуализация без меток в реальном времени и количественный анализ морфодинамики макрофагов с использованием оптической дифракционной томографии

DOI:

10.3791/71209

⸱

9 июня 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sichuan Provincial Key Laboratory of Innovation and Efficient Utilization of Chinese Medicine Germplasm Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Yangtze Delta Institute of Optoelectronics, Peking University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает рабочий процесс на основе оптической дифракционной томографии без меток для визуализации в реальном времени и количественного анализа морфодинамики макрофагов. Метод позволяет непрерывно отслеживать морфологию и миграцию отдельных клеток, обеспечивая временные измерения прогнозируемой площади, периметра и средней скорости миграции во время долгосрочной визуализации живых клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование устанавливает рабочий процесс на основе оптической дифракционной томографии (ODT) без меток для изображения и анализа живых клеток с целью наблюдения морфологических изменений макрофагов, зависящих от времени. Метод позволяет непрерывно фиксировать морфологию и движение отдельных клеток в течение длительного времени при стабильных условиях окружающей среды, а также выделять количественные параметры, включая прогнозируемую площадь, периметр и среднюю скорость миграции. Этот рабочий процесс предоставляет практический подход к фиксации динамического клеточного поведения на уровне одной клетки без экзогенной маркировки. Используя макрофаги RAW264.7 в качестве модели, таймлапс-визуализация проводилась под стимуляцией липополисахаридов с предварительным лечением байкалином для фиксации динамических изменений клеток в различных условиях. Репрезентативные клетки были выбраны для отслеживания и количественного анализа. Результаты показывают, что такой рабочий процесс поддерживает стабильное долгосрочное отслеживание отдельных клеток и отражает временные изменения в морфологии и подвижности клеток. Этот подход обеспечивает метод наблюдения динамического клеточного поведения без меток в ответ на различные стимулы и может служить полезным дополнением к традиционным анализам на основе конечных точек. Он также может быть применим к другим типам клеток с адхерентными элементами для изучения морфодинамики клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макрофаги играют центральную роль в врожденных иммунных ответах и гомеостазе тканей, а их функциональные состояния могут динамически меняться в ответ на микроэкологические стимулы. Традиционно макрофаги описываются как обладающие провоспалительными или противовоспалительными/репарационнымифенотипами 1,2. Однако всё больше данных указывает на то, что активация макрофагов — это непрерывный и пластический процесс, а не дискретное бинарное состояние3,4. Под разными стимулами макрофаги претерпевают постепенные изменения со временем, сопровождающиеся изменениями в морфологии клеток и миграционномповедении. Поэтому временная характеристика морфологических и миграционных изменений на уровне одной клетки предоставляет важный подход для изучения динамических клеточных ответов.

Современные подходы к изучению состояний макрофагов в основном опираются на иммуноокрашивание, потоковую цитометрию и транскриптомические или протеомныеанализы 6. Эти методы обычно основаны на фиксированных образцах или дискретных временных точках, что ограничивает их способность отслеживать непрерывные изменения в одной и той же ячейке при живыхусловиях 7. Флуоресцентная визуализация живых клеток позволяет проводить динамические наблюдения, но может подвергаться фототоксичности и фотоотбелению во время долгосрочныхэкспериментов 8,9. Оптическая дифракционная томография (ОДТ) — это метод визуализации без меток, который восстанавливает трёхмерное распределение показателей преломления клеток для получения количественной структурной информации10. Поскольку ODT не требует экзогенной маркировки, он подходит для долгосрочной визуализации живых клеток и снижает возмущение клеточного поведения. В последние годы ODT применяется для динамических исследований различных моделейклеток 11, при этом предыдущие исследования в основном сосредоточены на возможностях визуализации и структурной характеристике. В отличие от этого, данное исследование устанавливает стандартизированный, свободный от меток рабочий процесс для долгосрочного, временно разрешенного анализа морфодинамики макрофагов на одной клеточке при определённом условии стимуляции in vitro.

Рабочий процесс демонстрируется с помощью модели макрофагов in vitro RAW264.7 с стимуляцией липополисахаридами (LPS) и предобработкой бакалином (BAI). BAI использовался как репрезентативный экспериментальный модулятор для установления определённого условия демонстрации рабочего процесса. Непрерывная визуализация позволяет извлекать количественные параметры отдельных ячейок, включая проецируемую площадь, периметр и среднюю скорость миграции, что позволяет временно определять морфологические и поведенческие изменения. Этот подход предназначен для описательного анализа динамических фенотипических изменений, а не для определения функциональных состояний или поляризации, и может служить дополнением к конечным анализам, предоставляя временную информацию. Рабочий процесс валидируется в этой системе моделей и потенциально применим к другим типам адгезентных ячеек.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура макрофагов

ВНИМАНИЕ: Выполняйте все процедуры в шкафу для биобезопасности, надевая лабораторные перчатки и халат.

  1. Приготовьте полную сельскохозяйственную среду (высокоглюкозную модифицированную среду Dulbecco Eagle Medium (DMEM), дополненную 10% плодовой сывороткой для крупного рогатого рогатого скота (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином).
  2. Разморозить флакон с макрофаговыми клетками RAW264.7 в водяной бане при температуре 37 °C менее 1 минуты.
  3. Переносите клеточную суспензию в DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненную 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином.
  4. Центрифугу при 300 × г в течение 5 минут.
  5. Отбросьте супернатант.
  6. Восстановите клетки в свежей полной среде.
  7. Семенные клетки в 60-мм тарелки по 2–5 × 105 клеток на тарелку.
  8. Инкубировать клетки при 37 °C с 5% CO₂.
  9. Не меняйте среду в течение 12–24 часов после размораживания.
  10. Заменяйте среду каждые 2–3 дня.
  11. Мониторинг морфологии клеток с помощью инвертированного микроскопа.
  12. Проходные клетки при слиянии 80–90% путём мягкой пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования трипсина. Используйте ячейки в пассажах 6–18. Выбирайте клетки с однородной морфологией и без вакуолизации для экспериментов. Линия клеток была аутентифицирована с помощью профилирования STR и подвергнута тестированию контроля качества. Подробные отчёты и краткое изложение на английском языке приведены в дополнительных файлах.

2. Лечение клеток

  1. Собирайте клетки в логарифмической фазе роста с помощью мягкой пипетки.
  2. Суспензировать клетки в полной среде.
  3. Измеряйте плотность ячеек с помощью счётчика ячеек.
  4. Отрегулируйте плотность ячеек на 4 × 104 клеток/мл.
  5. В каждую 35-мм тарелку посейте по 2 мл клеточной суспензии.
  6. Распределите тарелки на две группы: (i) группа LPS, (ii) группа BAI + LPS.
  7. Инкубировать клетки при 37 °C с 5% CO₂ в течение 12–16 часов.
  8. Подготовьте 50 мМ стандартного решения BAI в DMSO. Храните раствор BAI при −20 °C.
  9. Добавьте BAI в группу BAI + LPS до конечной концентрации 100 мкм. Разведите раствор BAI непосредственно в культурной среде для достижения конечной рабочей концентрации.
  10. Добавьте равный объём DMSO в группу LPS.
  11. Приготовьте раствор LPS (1 мг/мл) в полной среде.
  12. Добавьте LPS в обе группы до конечной концентрации 1 мкг/мл. Разведите раствор LPS непосредственно в культурной среде для достижения конечной рабочей концентрации.
  13. Немедленно приступайте к визуализации и не меняйте среду во время съёмки.

3. Оптическая дифракционная томография

  1. Включите систему визуализации ODT и запустите модуль управления окружающей средой.
  2. Установите температуру сцены на 37 °C.
  3. Установите концентрацию CO₂ на 5%.
  4. Позвольте системе уравновеситься минимум 20 минут.
  5. Откройте программное обеспечение для приобретений.
  6. Разместите культурное блюдо на этапе визуализации.
  7. Используйте объектив 60x (NA = 1.42) для поиска ячеек.
  8. Выберите изолированные клетки с чёткими границами для визуализации.
  9. Установите интервал визуализации на 8 минут.
  10. Установите общее количество кадров на 181.
  11. Включите функцию автофокуса для сохранения фокуса во время таймлапс-съёмки.
  12. Запускайте таймлапс-сбор.
  13. Отслеживайте стабильность системы во время захвата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего эксперимента применялась стабилизация автофокуса для минимизации дрейфа фокуса.

4. Реконструкция изображения и количественный анализ

  1. После получения изображений программа автоматически выполняет восстановление изображения.
  2. Используя встроенный стандартный алгоритм.
  3. Ждите, пока индикатор прогресса не завершится.
  4. Откройте программное обеспечение для анализа (Intellyseg, версия 2.1.0).
  5. Импортируйте исходный набор данных, выбрав Импорт необработанных данных.
  6. Просматриваю папку Target.
  7. Выберите целевой файл и импортируйте набор данных.
  8. Нажмите «Ячейка», чтобы выполнить автоматическую сегментацию с использованием согласованных настроек между наборамиданных 13.
  9. Выбирайте ячейки по следующим критериям: (i) отсутствие пересечения с соседними ячейками, (ii) не контакт с границами изображений, (iii) непрерывно отслеживаемая на протяжении всех временных рядов.
  10. Выберите фиксированное количество ячеек (n = 8) на поле обзора для согласованного анализа между наборами данных.
  11. Откройте модуль «Долгосрочное отслеживание».
  12. Вводите стартовый и конечный кадр.
  13. Нажмите «Track», чтобы начать отслеживание, которое основано на согласованности положения ячеек междупоследовательными кадрами 14.
  14. При необходимости ручное исправление ошибок отслеживания для обеспечения непрерывности траектории: (i) Кликните правой кнопкой мыши по неправильным маскам и выберите «Удалить элемент», (ii) Откройте «Ручную сегментацию», (iii) Выберите «Ячейку» и нажмите «Добавить», (iv) Используйте «Клик» или «Ячейку» для добавления правильных масок.
  15. Нажмите «Экспорт», затем выберите «Экспорт данных».
  16. Выберите «Экспорт видео» и элементы выхода.
  17. Вводите начальные и конечные кадры.
  18. Выберите путь сохранения и формат файла.
  19. Нажмите «OK», чтобы экспортировать видео.
  20. Нажмите «Экспорт», затем выберите «Система графиков».
  21. Выберите «Track Chart».
  22. Выберите категорию сегментации «Ячейка».
  23. Вводите диапазон трекинг-кадров.
  24. Выберите параметры выхода (например, площадь, периметр).
  25. Нажмите «Экспортировать изображение или Excel» и сохранить файл.
  26. Рассчитайте среднюю скорость миграции (мкм/ч) для каждой ячейки на основе смещения центроидов по всем временным рядам.

5. Представление данных

  1. Количественные измерения представлены описательно. Статистический вывод не проводился. Каждая группа лечения включала пять независимых образцов.
    Обзор экспериментального рабочего процесса показан на рисунке 1. Ключевые реагенты, приборы и программное обеспечение перечислены в Таблице материалов. Условия визуализации приведены в таблице 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для оценки эффективности рабочего процесса на основе ODT было проведено таймлапс-визуализация для двух групп лечения (LPS и BAI + LPS), с пятью независимыми образцами на каждую группу. Все образцы были получены при одинаковых условиях визуализации. Из-за высокой нагрузки, связанной с долгосрочным отслеживанием отдельных клеток и количественным анализом, для анализа и визуализации из каждой группы была выбрана одна представительная выборка. Результаты представлены описательно и не предназначены для статистического вывода....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование устанавливает рабочий процесс на основе ODT без меток для непрерывной визуализации и количественного анализа морфодинамики макрофагов на уровне отдельных клеток. Этот подход позволяет измерять прогнозируемую площадь, периметр и среднюю скорость миграции во время долгосрочной визуализации живых клеток. Плотность посева клеток является ключевым фактором, влияющим на сегментацию и отслеживание эффективности. Высокая плотность приводит к перекрытию ячеек, тогда как низкая пл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что Цзе-цзе Чжу и Яньцин Ян связаны с компанией Pellucid Optics (Nantong) Co., Ltd. Система визуализации ODT, использованная в этом исследовании, связана с этой компанией. Однако эта принадлежность не повлияла на проектирование, сбор данных, анализ или интерпретацию результатов. Оставшиеся авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (U24A20790), Министерством науки и технологий (2022YFF0712500 и 2023YFF0722600) и Департаментом науки и технологий провинции Цзянсу (BK20250540).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ODT imaging systemPellucid OpticsMH-PanoViewИспользуется для анализа живых клеток без меток
Программное обеспечение для сбора данныхPellucid Optics Lucida-Pano v2.1.0Используется для получения изображений
Аналитическое программное обеспечениеPellucid Optics Intellyseg v2.1.0Используется для реконструкции изображений, сегментации и отслеживания
RAW264.7Wuhan Zishan Biotechnology STCC20020PЛинии клеток макрофагов мышей, используемые для ин-витро поляризации и исследований изображений.
Байкалин (BAI)Shanghai Yuanye JB246114Используется для предварительной обработки клеток
Липополисахарид (LPS)SolarbioL8880Используется для стимуляции макрофагов
Среда DMEMGibcoC11995500BTСреда для культуры клеток
Фета́льная сы́воротка бы́чьяProcell164210Добавка для культуры клеток
Пенициллин и стрептомицин (100x)ProcellPB180120Антибиотики для культуры клеток
60 мм культуральный стаканCorningCLS430166Используется для культуры клеток
Стакан с 35 мм стеклянным дномCellvisD35-10-1.5-NИспользуется для ODT изображений
Инвертированный микроскопOLYMPUSCKX53Используется для рутинного наблюдения клеток и мониторинга в процессе культивирования.
Счётчик клетокRWD Life ScienceC100Используется для определения плотности клеток

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RAW264 7
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи