Экзогенный митохондриальный перенос в дифференцирующих коричневых адипоцитах и преадипоцитах с дефицитом AGPAT2

Краткое содержание

Экзогенные митохондрии человеческого и мышиного происхождения могут быть внутренне интернированы путём дифференцирования преадипоцитов и отслеживаться на протяжении всей адипогенной дифференцировки с помощью визуализации и генетических инструментов. Хотя эти митохондрии физически взаимодействуют с эндогенной митохондриальной сетью, они не увеличивают экспрессию маркеров, связанных с зрелыми коричневыми адипоцитами.

Аннотация

Митохондрии являются ключевыми сигнальными узлами; Однако вопрос остаётся открытым, требуется ли механистическое расширение митохондриальной массы для дифференциации. AGPAT2 катализирует превращение лизофосфатидовой кислоты в фосфатидовую кислоту, а её дефицит приводит к дефициту жировой ткани и нарушению адипогенеза, связанному с уменьшением митохондриальной массы. Влияние расширения митохондрийной массы на адипогенез оценивалось путём переноса экзогенных митохондрий в дифференцирующиеся коричневые адипоциты. Также изучалось, может ли перенос митохондрий спасти нарушенную адипогенез клеток с дефицитом AGPAT2. Митохондрии человека и мыши были успешно перенесены и интегрированы в эндогенную митохондриальную сеть дифференцирующих преадипоцитов мышей и сохранялись на протяжении всего коричневого адипогенеза. Для сохранения переносимых митохондрий требовалась адипогенная дифференцировка. Перенос митохондрий не изменил экспрессию молекулярных маркеров зрелых коричневых адипоцитов или содержание липидных капель, хотя повлиял на относительное распределение размера липидных капель в зависимости от вида. В преадипоцитах ^Agpat2-/- перенос митохондрий не спас адипогенез, что указывает на то, что расширение массы митохондрий недостаточно для обращения механизмов, приводящих к липодистрофии в этой модели. Эти результаты показывают, что, хотя экзогенные митохондрии человека и мыши могут быть включены в митохондриальную сеть дифференцирующих адипоцитов, они напрямую не влияют на адипогенную программу.

Введение

Помимо основных биоэнергетических функций, митохондрии служат сигнальными центрами в различных клеточных процессах, включая дифференцировку^клеток 1,2,3,4. Коричневая жировая ткань (BAT) обладает заметно высокой митохондриальной массой, поддерживающей её термогенную активность, что подчёркивает её роль в энергетическом балансе всего тела и в патогенезе^{ожирения 5}. Хотя масса митохондрий регулируется балансом между биогенезом и митофагией, остаётся неясным, необходимо ли расширение митохондрийной массы при дифференцировке коричневых адипоцитов функционально для адипогенеза или является лишь следствием этого процесса.

Физиологический перенос митохондрий между клетками был задокументирован как in vitro, так и in vivo, где способствует адаптации тканей при патологических условиях, включая дисфункцию жировой ткани, связанную с ожирением и инсулинорезистентностью^6,7. Кроме того, искусственный перенос митохондрий in vitro показал, что повышает дыхательные способности реципиентных^{клеток 8}. В совокупности эти результаты подтверждают идею, что перенос митохондрий может изменять клеточную метаболическую функцию и способствовать адаптации тканей в условиях биоэнергетического^{стресса 9,10,11}. В сравнении с фармакологическими или генетическими стратегиями, стимулирующими эндогенный митохондриальный биогенез за счёт активации транскрипционных программ ядра и митохондрии, митохондриальный перенос напрямую доставляет органеллы к клетки-реципиентам, позволяя быстро модифицировать массу митохондрий независимо от транскрипционных^{манипуляций 12,13}. Этот подход критически важен для коррекции дефектов при митохондриальных заболеваниях, но также позволяет изучать действие митохондрий без возможных побочных эффектов фармакологических или генетических^{подходов 14}.

В настоящем исследовании мы изучали эффект искусственного увеличения митохондриальной массы за счёт экзогенного митохондриального переноса при дифференцировании коричневых адипоцитов. Этот подход позволил напрямую оценить влияние митохондриальной массы на адипогенную программу. Для этого протоколы переноса митохондрий, изначально разработанные для мезенхимальных стволовых клеток, были адаптированы¹⁵ с использованием как человеческих печеночных клеток, так и мышиных преадипоцитов в качестве митохондриальных доноров. Был разработан метод отслеживания человеческих митохондрий в дифференцирующих мышиных клетках с использованием генетических инструментов в сочетании с методами визуализации, что показало, что митохондрии обоих источников интегрируются в эндогенную митохондриальную сеть и сохраняются на протяжении всей адипогенной дифференцировки.

Для моделирования дефектного адипогенеза, связанного с низкой митохондриальной массой, были использованы дифференцированные коричневые адипоциты, полученные из мышей с дефицитом 1-ацилглицерол-3-фосфат-O-ацилтрансферазы 2 (AGPAT2) (Agpat2^-/-). AGPAT2 сильно экспрессируется в жировой ткани, где катализирует образование фосфатидовой кислоты в пути биосинтеза глицеролипидов. Дефицит AGPAT2 вызывает тяжёлую липодистрофию как у людей, так и у мышей и ухудшает адипогенез в белых и коричневых моделях адипоцитов в связи с уменьшением массы митохондрий 16,17,18. Включение экзогенных митохондрий в дифференцирующие преадипоциты немного изменило распределение размера липидных капель, но не увеличило экспрессию зрелых коричневых маркеров адипоцитов и не спасло адипогенное нарушение преадипоцитов Agpat2^-/- преадипоцитов.

Протокол

Процедуры на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных при Папском католическом университете Чили, протокол 210609003. В этом исследовании использовались неонатальные мыши дикого типа и Agpat2^-/ - P0.5 обоих полов, происходящие из смешанного генетического фона C57BL/6J и 129J. Средства индивидуальной защиты (СИЗ): Носите лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки. См. дополнительный файл 1 для дополнительной информации о протоколе и таблицу 1 для буферов, необходимых для этого протокола.

Все токсичные химические отходы, образующиеся в ходе подготовки к электронной микроскопии, фиксации параформальдегида и экстракции нуклеиновых кислот, должны быть строго разделены на специально обозначенные, чётко маркированные потоки в соответствии с институциональными нормами по охране окружающей среды и безопасности (EHS). Ни при каких обстоятельствах эти реагенты не должны сбрасываться в лабораторную раковину или общественную канализационную систему. Все опасные химические отходы, образующиеся, должны быть разделены согласно институциональным классификациям EHS.

1. Культура клеток

1. Выделение, дифференцировка и поддержание первичных адипоцитов (iBAT)
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. Дополнительный файл 1 для краткого описания процедур и таблицу 1 для состава требуемых решений. Полное и подробное объяснение нашего протокола дифференцировки коричневой адипогенной дифференцировки in vitro можно найти в Figueroa et ^al.19.
   1. Изолировать преадипоциты из межлопаточной коричневой жировой ткани (iBAT) новорождённых мышей (P0.5) после хирургических и ферментативных процедур пищеварения, описанных Figueroa и ^др.19.
   2. Дифференцировать и поддерживать культуру коричневых адипоцитов согласно дифференциационному коктейлю и графику обмена средами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для успешной адипогенной дифференцировки крайне важно, чтобы культуры достигли слияния 90–100% до начала адипогенной индукции.
2. Культура HepG2
   1. Культивировать клетки HepG2 в DMEM с добавлением сыворотки плода 10% бычьей крупной рогатой скрынки, 100 U/mL пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина B. Поддерживать клетки при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%_CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки растут кластерами и могут казаться субслияющими, несмотря на высокую плотность из-за многослойного роста.

2. Изоляция и перенос митохондрий

1. Митохондриальная изоляция
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы в шкафу для биобезопасности при 4 °C или на льду. Используйте препарат в течение 2 часов.
   1. Семя 2 × 10⁶ донорских клеток (HepG2 или преадипоциты) в 100-мм сосках для культуры. Выращивать клетки до тех пор, пока они не достигнут слияния 80% (HepG2) или 100% (преадипоциты).
   2. Окрашивайте донорские клетки 100 нМ MitoTracker Deep Red FM в среде без FBS в течение 30 минут при 37 °C в инкубаторе с 5%_CO2 .
   3. Промыйте клетки 2 раза с формой для роста, чтобы удалить лишний краситель.
   4. Отделить клетки с помощью трипсина, собрать суспензию и центрифугировать при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
   5. Ресуспензировать гранулу в 1 мл буфера изоляции митохондрий (MIB) с добавлением BSA, ингибиторов протеазы и ингибиторов фосфатазы. Разрушить плазматическую мембрану, пропустив суспензию через туберкулиновый шприц 5 раз. Гомогенизуйте суспензию, пропуская её через инсулиновый шприц не менее 10 раз, пока раствор не станет светло-коричневым и не будет видимых комков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа западного блота аликвот 50 мкл от общего лисата и храните при -20 °C.
2. Центрифугуйте гомогенат при 900 × г в течение 11 минут при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если супернатант после спина 900 × g не мутный, клеточный лизис, скорее всего, неполный.
   1. Соберите супернатант и центрифугу при 10 000 × г в течение 10 минут при 4 °C для гранулирования митохондрий. Промывайте митохондриальные гранулы 3 раза с MIB с добавлением BSA.
   2. Проведите финальную подвеску в 100 мкл MIB без BSA. Количественно определите концентрацию белка с помощью анализа на BCA.
3. Анализ митохондриального переноса (MTA) в преадипоцитах
   1. Реципиенты семян преадипоцитов на 5 × 10⁵ клеток/скважину в пластинах с 12 лунками (с 18 мм коверскользами для микроскопии) за 24 часа до анализа.
   2. Добавляйте изолированные донорские митохондрии непосредственно в среду-реципиент с соотношением 10 мкг митохондриального белка на 10⁵ клеток. Аккуратно покачивайте пластины, чтобы распределить митохондрии. Инкубировать клетки в течение 24–120 часов (соответственно 1, 3 и 5 дням дифференцировки) при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂ перед анализом.

3. Потребление митохондриального кислорода и эффективность MTA

1. Митохондриальная респирометрия
   1. Установите внешнюю циркулирующую водяную ванну на 25 °C и обеспечьте стабильное тепловое равновесие в оболочке камеры перед началом любых измерений.
   2. Проведите двухточечную калибровку жидкостной фазы с помощью программного обеспечения прибора.
      1. Калибровка насыщения воздухом (High Point): Добавьте в камеру 500 мкл насыщенной воздухом деминерализированной воды. Установите магнитный мешаль на 60 об/мин и записывайте сигнал до стабилизации на плато (>1 500 мВ).
      2. Калибровка с нулевым кислородом (Low Point): Добавьте небольшое количество (~3 мм диаметром) сульфита натрия в камеру, чтобы вытеснить оставшийся воздух. Записывайте до тех пор, пока сигнал не снизится до стабильного базового плато (~1% базального сигнала, ~20 мВ).
   3. Инициировать запись в реальном времени (общее время выполнения: ~10 мин).
   4. Записывайте 3 минуты до достижения стабильного линейного показания.
   5. Ресуспендировать изолированные митохондрии в 200 мкл митохондриального анализного буфера (MAS⁾²⁰ с добавлением 5 мМ глутамата и 2,5 мМ малата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящей работы гранула полного митохондрий была извлечена из двух клеточных пластин диаметром 100 мм.
   6. Перенесите подвеску в камеру оксиграфа и плотно закройте герметичный поршень камеры, убедившись, что не осталось пузырьков воздуха.
   7. Фиксируйте потребление кислорода в течение 3 минут.
   8. Добавьте 150 мкм АДФ для запуска митохондриального дыхания и измерения дыхания, связанного с синтезом АТФ, в течение 3 минут.
   9. Ручно определите стабильные линейные сегменты, соответствующие каждой дыхательной фазе. Извлечь автоматические значения наклона, вычисленные программным обеспечением, выраженные в скоростях потребления кислорода в nmol∙^mL-1∙^min-1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для очистки межпластинной камеры промыйте камеру 2 раза 1 мл деминерализированной воды и убедитесь, что внутри всё полностью сухо. Добавьте 100 мкл PBS в камеру перед переходом к следующей пластине.
2. Проточная цитометрия
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все образцы на льду на протяжении всей процедуры, чтобы сохранить целостность клеток и биоэнергетики.
   1. Изолировать митохондрии и провести анализ переноса митохондрий (MTA), как описано в разделах 2.1 и 2.2 соответственно, в 35-мм сосисках, используя донорские клетки, ранее маркированные MitoTracker Deep Red FM.
   2. Аспирируйте культурную среду и промывайте монослой клетки один раз 1 мл стерильного PBS.
   3. Добавьте 500 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируете чашки при 37 °C до полного отслоения клеток под микроскопом.
   4. Нейтрализуйте трипсин, добавив 1 мл полного среднего раствора (DMEM с 10% FBS). Перенесите весь объём в коническую трубку объёмом 15 мл и центрифугуйте при 300 × г на 5 минут при 4 °C.
   5. Сбросьте супернатант аспирацией и оставьте клеточную гранулу. Повторно суспензируйте гранулу в 500 мкл ледяного PBS с помощью аккуратной пипетки.
   6. Анализируйте образцы с помощью потокового цитометра, оснащённого лазером 640 нм (см. дополнительный файл 1 для подробностей о взятии и анализе потоковой цитометрии).
      1. Определите популяцию ячеек с помощью графиков прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) и примените стратегию гейтинга для исключения мусора и дублетов ячейки.
      2. Количественно определить интенсивность флуоресценции в дальнем красном канале (эмиссионный фильтр 670/30 нм) для обнаружения внутренне помеченных митохондрий MitoTracker.
      3. Проведите анализ с помощью Floreada.io (см. дополнительный файл 1 для подробностей протокола гейтинга).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Включите отрицательный контроль (реципиентные клетки без MTA) для установки базовой линии фоновой автофлуоресценции.
3. Конфокальная и электронная микроскопия
   1. Анализ живых клеток визуализации
      1. Семена первичных преадипоцитов, полученных от новорождённых мышей P0.5, в 12-колодцевые пластины с 18-мм покрытиями, в соответствии с специфической плотностью клеток и требованиями к среде, описанным в Разделе 1.
      2. Изолировать митохондрии и провести анализ переноса митохондрий (MTA) с использованием донорских клеток, ранее маркированных MitoTracker Deep Red FM, как указано в разделе 2.
      3. Поддерживайте культуры получателя в увлажнённом инкубаторе при 37 °C с 5%_CO2 в течение 24 часов, чтобы обеспечить поглощение митохондриями.
      4. Подготовьте рабочий раствор MitoTracker Green на 70 нм, разбавляя бульон в среде без FBS.
      5. Аспирируйте растительную среду из 12-колодцевых пластин и замените её раствором MitoTracker Green на 70 нм. Инкубировать пластины в течение 25 минут при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%_CO2 , чтобы компенсировать общую митохондриальную сеть.
      6. Снимите раствор для окраски и промой наклейки 2 раза с помощью 1 мл тёплой, полной культурной среды.
      7. Замените финальный объём на полноценную среду без фенола, чтобы минимизировать фоновую автофлуоресценцию во время сбывания.
      8. Перенесите накладки или пластину на стадию конфокального микроскопа. Настройте инкубационную камеру микроскопа так, чтобы поддерживать постоянную температуру 37 °C и 5%_CO2.
      9. Снимайте изображения немедленно, используя соответствующие настройки возбуждения/излучения как для дальнего красного (MitoTracker Deep Red FM), так и зелёного (MitoTracker Green) каналов. См. дополнительный файл 1 для получения дополнительной информации.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы окрашивания и обработки при слабом освещении, чтобы предотвратить фотоотбеливание флюорофоров. Для оптимального разрешения морфологии митохондрий используйте масляный иммерсионный объектив (60x или 100x) с высокочисленной апертурой (NA).
   2. Конфокальный иммунофлуоресцентный анализ с фиксированными клетками
      ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации клеток токсичные параформальдегидные и глутаральдегидные растворы классифицируются как негалогенированные органические вещества. Побочные продукты экстракции нуклеиновых кислот требуют строгой сегрегации: смеси фенол/хлороформ должны утилизироваться как галогенированные органические вещества, тогда как буферы на основе гуанидиния классифицируются как коррозионные органики.
      1. Семена первичных преадипоцитов, полученных от неонатальных мышей P0.5, в 12-колодные пластинки с 12-мм покрытиями, как описано в Разделе 1.
      2. Изолировать митохондрии и провести анализ переноса митохондрий (MTA) в соответствии с процедурами, указанными в разделе 2.
      3. Инкубировать культуры в течение 24 часов, чтобы обеспечить поглощение митохондриями.
      4. Индуцировать бурую адипогенную дифференцировку, следуя протоколу, описанному в дополнительном файле 1 , и обратитесь к Таблице 1 для описания состава требуемых буферов.
      5. Фиксируйте клетки на 7-й день дифференцировки (168 ч). Аспирируйте посевную среду и добавьте 500 мкл 4% параформальдегида (PFA) на каждую скважину. Инкубировать 20 минут при комнатной температуре.
      6. Промывайте сливки 2 раза, добавляя 1 мл ледяного PBS на каждую скважину. Пермеабилизуйте и блокируйте клетки, инкубировав покрытия в PBS, содержащие 0,05% сапонина и 0,2% BSA, в течение 1 часа при комнатной температуре. Поставьте пластину на орбитальный шейкер под лёгкое перемешивание.
      7. Промой клетки дважды 1 мл PBS. Окрашивайте ядра и липидные капли одновременно. Нанесите 1 мкг/мл Hoechst 33342 и 1 мкг/мл BODIPY, приготовленный в буфере блокировки/проницаемости. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре, чтобы тарелка была защищена от света.
      8. Помой накладки 2 раза с 1 мл ледяного PBS. Крепите чехлы на чистые стеклянные стекла. Нанесите 10 мкл крепления на затвор и разместите ковбой с элементом ячейки вниз на монтажный материал. Дайте образцам высохнуть на ночь в тёмной температуре при комнатной температуре перед съёмкой.
      9. Получайте изображения с помощью конфокального микроскопа. Используйте два флуоресцентных канала, откалиброванных для спектров излучения Hoechst и BODIPY. См. дополнительный файл 1 для получения дополнительной информации о изображениях.
      10. Проведите анализ липидных капель с помощью ImageJ v1.54. Откройте канал липидных капель, вручную определите отдельные капли с помощью инструментов Freehand selections и ROI Manager, а также вычислите область капель с помощью Analyze | Измеряйте команду.
      11. Обрабатывайте и анализируйте полученные данные с помощью скриптов R, предоставленных в дополнительном файле 2 в среде RStudio v4.5.2.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте ровно пять изображений на каждое покрытие с увеличением в 10 раз, чтобы обеспечить репрезентативную выборку. Используйте версию R 4.5.2 или выше для совместимости с предоставленными скриптами.
   3. Трансмиссионная электронная микроскопия (TEM)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для побочных продуктов электронной микроскопии высокотоксичные тетроксиды осмия и буферы натрия какодилата с мышьяком должны собираться как токсичные отходы тяжелых металлов, тогда как уранилацетат управляется отдельно как радиоактивные отходы в соответствии с институциональными протоколами радиационной безопасности.
      1. Центрифугуйте изолированные митохондрии из раздела 2 при 10 000 × г в течение 10 минут при 4 °C, чтобы получить компактную гранулу.
      2. Фиксируйте гранулу, добавив 2,5% глутаральдегид в буфер натрия какодилата с концентрацией 0,1 млн (pH 7,0). Инкубировать 2 часа при 4 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда работайте с растворами глутаральдегида и выполняйте начальные этапы фиксации внутри химического выхлопчика. Наденьте нитриловые перчатки и очки для защиты глаз. Избегайте контакта с источниками нагрева, так как нагретый глутаральдегид выделяет сильно раздражающие пары.
      3. Промыйте митохондриальную подготовку в течение 3 × 10 минут с буфером натрия какодилата 0,05 м и кратковременно центрифугайте, чтобы удержать гранулу между сменами буфера.
      4. Постфиксируйте образец, добавив 1% водного тетроксида осмия (_{OsO 4}). Инкубировать 15 минут при комнатной температуре.
         ПРИМЕЧАНИЕ: тетроксид осмия должен открываться и обрабатываться только внутри сертифицированного, полностью функционирующего химического вышка. Наденьте лабораторный халат, защитные очки или полностью защитный щит, а также толстые или двойно-нитриловые перчатки (меняйте перчатки немедленно, если появится всплеск, так как_{OsO 4} со временем может проникать в жидкий нитрил).
      5. Промой образец в течение 3 × 5 минут с двойной дистиллированной водой. Покрасьте гранулу 1% водного уранилацетата в течение 15 минут.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте на одноразовой бумаге с пластиковой подкладкой. Выделите отдельную зону лаборатории для радиоактивного окрашивания. Наденьте двойные перчатки, лабораторный халат и защитные очки. Тщательно мойте руки после завершения процедуры.
      6. Обезвожить препарат с помощью серии градированного этанола. Инкубировать гранулы в 30%, 50%, 70%, 95% и 100% этаноле в течение 5 минут при каждой концентрации.
      7. Встраивайте митохондриальные фракции. Инкубировать в растворе эпона и этанола 1:1 в течение 30 минут, затем чистой смолой эпона в течение 1 часа.
      8. Перенесите образцы в встраивающие формы и полимеризуйте в духовке при температуре 60 °C на 48 часов.
      9. Прикрепите смоляные блоки к ультрамикротому и вырежьте ультратонкие срезы (80 нм).
      10. Собирайте секции по сеткам. Покрасьте решётку 1% водным уранилацетатом в течение 4 минут. Прополосните двойным дистиллированным водой.
      11. Окрашивайте свинцовым цитратом в течение 5 минут по методу^{Рейнольдса 21}. Тщательно прополоскай. Визуализируйте сетки с помощью TEM. См. дополнительный файл 1 для подробностей о методе Рейнольдса и получении изображений TEM.

4. Молекулярная квантификация

1. Стандартная кривая митохондриальной ДНК (mtDNA)
   1. Посеять клетки HepG2 в пять культурных чаш по 100 мм. Инкубировать культуры, пока они не достигнут 80% слияния.
   2. Изолировать митохондрии от собранных клеток, следуя технической процедуре, описанной в разделе 2.
   3. Извлечение полной ДНК из полученной митохондриальной гранулы с помощью метода кислоты-гуанидиний-фенол-хлороформ, описанного в разделе 4.2.6. Измерьте концентрацию ДНК и оцените чистоту (соотношения A₂₆₀/_A280 и (_{A 260}/_{A 230} ) с помощью микрообъёмного UV-Vis спектрофотометра.
   4. Подготовьте серию разбавления, используя воду без нуклеазы в качестве разбавления. Разбавить ДНК-запас для получения окончательных результатов 1, ^10-1, ^10-2, ^10-3, ^10-4 и ^10-5 нг на объём реакции. Вихрь каждого разбавления в течение 5 секунд для обеспечения полной однородности перед переходом к следующему этапу серии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Корректируйте диапазон концентраций стандартной кривой в зависимости от конкретной концентрации образца и итогового объёма реакции ПЦР.
2. Обнаружение мтДНК человека в клетках реципиента
   1. Семена первичных преадипоцитов, полученных из мышей P0.5, в посуды для культур диаметром 60 мм, с учетом плотности и условий среды, указанных в разделе 1.
   2. Изолировать митохондрии из клеток донорского HepG2 и провести анализ переноса митохондрий (MTA), как подробно описано во втором разделе.
   3. Инкубировать культуры в течение 24 часов при 37 °C и 5%_CO2.
   4. Индуцировать бурую адипогенную дифференцировку в течение 24–120 часов (на 1, 3 и 5 днях), следуя протоколу обмена средами, описанному в разделе 1.
   5. Аспирируйте посевную среду и промывайте клетки 2 мл ледяного PBS.
   6. Извлечение полной ДНК с помощью метода кислоты-гуанидиний-фенол-хлороформ²².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте аликвоты и проводите фазовое разделение внутри выхлопной вытяжки, чтобы избежать вдыхания токсичных феноловых паров. Используйте перчатки с двойным нитрилом или надёжные химически устойчивые перчатки.
   7. Проведите разделение фаз и сбросьте всю водную фазу, расположенную над межфазой.
      КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Полностью удалить водную фазу, чтобы предотвратить загрязнение и обеспечить высокую чистоту ДНК для последующих qPCR.
   8. Добавьте 0,3 мл 100% этанола на 1 мл первоначального реагента для экстракции. Закрывайте трубку и энергично смешивайте с помощью инверсии.
   9. Дайте постоять 3 минуты при комнатной температуре и центрифугировать при 2000 × г в течение 5 минут при 4 °C для гранулирования ДНК.
   10. Перенесите супернатант фенол-этанола в отдельную трубку для потенциального выделения белка. Ресуспензировать ДНК-гранулу в 1 мл цитрат натрия (в 10% этаноле, pH 8,5) на 1 мл используемого экстракционного реагента.
   11. Дайте постоять 30 минут при комнатной температуре, несколько раз аккуратно перевернуть, и центрифугировать при 2 000 × г в течение 5 минут при 4 °C. Отбросьте супернатант.
   12. Повторите промывку с цитратом натрия ещё два раза.
   13. Промыйте полученную гранулу 2 мл этанола 75% на 1 мл первоначального реагента для экстракции.
   14. Дайте постоять 20 минут при комнатной температуре и центрифугировать при 2000 × г в течение 5 минут при 4 °C.
   15. Сбросьте супернатант и высушите гранулы на воздухе на 10 минут. Растворите ДНК, добавляя 0,3–0,6 мл 8 мМ NaOH и многократно пипетируйте, пока гранула не исчезнет.
   16. Центрифугуйте при 12 000 × г в течение 10 минут при 4 °C, чтобы удалить нерастворимый мусор. Переведите супернатант в стерильную трубку и отрегулируйте pH до 7–8 с помощью HEPES.
   17. Измеряйте концентрацию и чистоту ДНК (((A(260)/A(280) и (A(260)/A(230)) с помощью микрообъёмного UV-Vis спектрофотометра.
   18. Разведите шаблон до конечного количества 15 нг общей ДНК в воде без нуклеаз. Проведите количественное измерение ПЦР в реальном времени (qPCR) для митохондриальной ДНК человека с использованием оптических пластин с 96 ямецами, как указано в разделе 4.3.
   19. Анализируйте результаты амплификации, применяя логарифмическую регрессионную модель.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите логарифмический регрессионный анализ, используя концентрацию ДНК и соответствующие значения порогового цикла (Ct) в качестве переменных.
3. RT-qPCR для экспрессии генов
   1. Подготовка и дифференцировка клеток
      1. Семена первичных преадипоцитов, полученных от новорождённых мышей P0.5, в 60-мм культурных чашах, как подробно описано в разделе 1.1.
      2. Изолировать митохондрии и провести анализ переноса митохондрий (MTA) в соответствии с процедурами, изложенными в разделе 2. Инкубировать культуры в течение 24 часов.
      3. Индуцировать коричневый адипогенез в течение 24–120 часов (отбор проб на 1, 3 и 5 день дифференцировки) согласно протоколу в разделе 1.
   2. Полная изоляция РНК
      1. Удалите культурную среду и добавьте 1 мл кислотного гуанидиния-фенол-хлороформного экстрактанта на каждые 1 ×^{10 6} клеток непосредственно в чашку. Гомогенизуйте образцы повторяющим пипетирование, пока лизат не станет однородным.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте аликвоты и проводите фазовое разделение внутри выхлопной вытяжки, чтобы избежать вдыхания токсичных феноловых паров. Используйте перчатки с двойным нитрилом или надёжные химически устойчивые перчатки.
      2. Добавьте 0,2 мл хлороформ на 1 мл экстракторного реагента. Надёжно закрывайте трубки и энергично трясите вручную в течение 15 секунд. Дайте постоять 3 минуты при комнатной температуре и центрифугировать при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
      3. Аккуратно перенесите верхнюю водную фазу в новую трубку без нуклеазы. Избегайте контакта с интерфазой. Держите образцы на льду.
      4. Добавьте 0,5 мл изопропанола на 1 мл экстракторного реагента. Аккуратно перемешайте инверсией и инкубуйте 10 минут при комнатной температуре.
      5. Центрифугу при 12 000 × г в течение 10 минут при 4 °C для гранулирования РНК. Отбросьте супернатант инверсией.
      6. Промой РНК-гранулу 1 мл 75% этанола. Кратковременный вихрь и центрифуга при 7 500 × г в течение 5 минут при 4 °C.
      7. Сбросьте супернатант и высушите РНК-гранулу на воздухе 10 минут при комнатной температуре. Суспензируйте гранулу в 30 мкл воды без нуклеаз. Инкубировать образцы при 60 °C в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное растворение.
      8. Определите концентрацию и чистоту РНК (соотношения_{A 260}/_{A 280} ) с помощью микрообъёмного UV-Vis спектрофотометра.
      9. Проверьте целостность РНК с помощью агарозного гелевого электрофореза.
   3. Обработка DNase
      1. Добавьте 0,1 объёма 10× буфера ДНКаз и 1 мкл фермента ДНКазы в каждый образец РНК. Аккуратно перемешивайте, пипетируйте. Инкубировать реакции при 37 °C в течение 30 минут.
      2. Реагент для инактивации ДНКазы повторно суспензируете движением или вихрями, пока суспензия не станет однородной. Добавьте реагент для инактивации (0,1 тома образца РНК или 2 мкл, в зависимости от того, что больше) и тщательно перемешайте. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Прокрутите трубки три раза в этот период, чтобы реагент оставался в подвешенном состоянии.
      3. Центрифуга при 10 000 × г в течение 1,5 минуты. Перенесите супернатант, содержащий РНК, в новую трубку.
         КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Убедитесь, что не переносится реагент для инактивации ДНКазы, так как он подавляет последующий синтез кДНК.
   4. Обратная транскрипция (RT)
      1. Измерить обработанную РНК и разбавить в воде без нуклеазы для использования до 2 мкг общей РНК на реакцию 20 мкл.
      2. Готовьте мастер-смесь RT на льду, следуя инструкциям производителя. Раздайте смесь в реактивные пробирки и добавьте образцы РНК.
      3. Загрузите в термоциклер и запустите программу обратной транскрипции согласно указанию производителя комплекта.
   5. Количественное ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)
      1. Используйте cDNA, сгенерированную в разделе 4.3.4, в качестве шаблона для ПЦР. Разбавить кДНК в воде без нуклеазы до рабочей концентрации 20 нг на реакцию 10 мкл. Держите все реагенты на льду.
      2. Приготовьте мастер-смесь с SYBR Green, праймерами и водой без нуклеаз. Включите избыточный объём для потерь при пипетировании. В каждую ямку оптической qPCR-пластины введите по 10 мкл реакционной смеси.
      3. Запечатайте пластину оптической клейкой пленкой и ненадолго центрифугайте, чтобы собрать жидкость на дне. Загрузите пластину в ПЦР-прибор в реальном времени и выполните усиление в режиме быстрого циклирования.
      4. Определите значения порогового цикла (Ct) и выполните относительную количественную оценку с помощью метода ΔΔCt. Включите анализ кривой плавления в конце запуска для проверки специфичности амплификации.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализуйте количество мРНК до уровней 36B4 как эндогенный ген, управляющий хозяйством. Запускайте qPCR-пластины в течение 2 часов после установки; в противном случае храните запечатанные пластины при 4 °C.
4. Вестерн блот
   1. Количественно определить концентрацию белка из цельных клеток и митохондриальных экстрактов (см. разделы 2.1.8 и 2.1.12) с помощью анализа BCA.
   2. Подготовьте 30 мкг белка на образец и добавьте соответствующий объём буфера загрузки образца SDS-PAGE (например, буфер Laemmli).
   3. Денатурируйте образцы, нагревая при 95 °C в течение 5 минут (или соблюдайте определённые температурные требования для мембранных белков).
   4. Загрузите образцы в колодцы полиакриламидного геля. Отделяйте белки электрофорезом гель-натрия додецилсульфата и полиакриламида (SDS-PAGE) при постоянном напряжении (например, 80–120 В), пока фронт красителя не достигнет низа геля.
   5. Активируйте мембрану PVDF, погрузив её в 100% метанол на 1 минуту, затем уравновесьте в буфере переноса.
   6. Соберите трансферный сэндвич, чтобы избежать воздушных пузырьков между гелем и мембраной.
   7. Переносите белки на мембрану PVDF путём электроблотинга на 400 мА в течение 2 часов. Поддерживайте систему при температуре 4 °C на протяжении всего процесса.
   8. Блокировать неспецифические участки связывания, инкубируя мембрану в 5% обезжиренном молоке, приготовленном в Tris-буферном физиологическом растворе с 0,1% Tween 20 (TBS-T) в течение 1 часа при комнатной температуре.
   9. Инкубировать мембрану первичными антителами (разбавлёнными в блокирующем растворе 1:1 000) за ночь при 4 °C при мягком перемешивании.
   10. Промывайте мембрану 3 × 15 минут TBS-T.
   11. Инкубировать с помощью вторичных антител, конъюгированных пероксидазой хрена (HRP), в течение 2 часов при комнатной температуре.
   12. Промыйте мембрану три раза TBS-T, затем последнюю 5-минутную промывку с 1× ст. л.
   13. Визуализируйте белковые полоски с помощью субстрата с улучшенной хемилюминесценцией (ECL). Захватывайте сигнал с помощью цифровой системы визуализации.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Скорректируйте процент геля полиакриламида (например, 8%, 10% или 12%) в зависимости от молекулярной массы целевых белков. Если в электротрансферном устройстве отсутствует активная система охлаждения, заменяйте контейнеры со льдом каждый час и держите камеру погружённой в ледяную ванну. Храните мембраны в 1× TBS при 4 °C, если визуализация задерживается.

Результаты

Извлечение митохондрий и структурная и дыхательная целостность

Для оценки влияния увеличения митохондриальной массы на коричневый адипогенез был проведён митохондриальный трансферный анализ (МТА) в недифференцированных преадипоцитах (рисунок 1A). Митохондрии были выделены из первичных мышиных преадипоцитов (mMito) и из клеточной линии гепатита гепатита человека (hMito). Вестерн-блот показал, что оба препарата были...

Обсуждение

Биологические последствия переноса митохондрий в адипогенезе

Наши результаты показывают, что хотя экзогенные митохондрии как человеческих, так и мышиных источников могут быть включены в эндогенную митохондриальную сеть дифференцирующих преадипоцитов, искусственное увеличение митохондриальной массы недостаточно для запуска коричневой адипогенной программы. Эти данные свидетельствуют о том, что митохондриальное расширение, характерное для бурог...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100 мм пластинка	SPL Life Science	10101SPL
10x Tris/Glycine Buffer	BioRad	1610734
12 мм стеклянные предметные стёкла	Marienfeld	111520
12-лунная пластинка	SPL Life Science	30012SPL
16% водный раствор параформальдегида	Invitrogen	28908
18 мм стеклянные предметные стёкла	HART	-
24-лунная пластинка	SPL Life Science	30024SPL
3,3',5-Трииодотреониновый натрий (T3)	Sigma	T6397
3-Изобутил-1-метилксантин (IBMX)	Calbiochem	410957
30% акриламид/Бис раствор, 37.5:1	BioRad	1610158
35 мм пластинка	SPL Life Science	20035SPL
6-лунная пластинка	SPL Life Science	30006SPL
60 мм культуральная чаша	SPL Life Science	20060SPL	Используется для экспериментов с первичными предадипоцитами и ДНК/qPCR; поставщик/каталог не указан
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder	Maestrogen	02102-250
ACK буфер для лизиса	Gibco	A10492-01
Actrapid 100 МЕ/мл (инсулин)	Novo Nordisk	A10AB01
АДФ	Merck	117105
Агароза	FERMELO BIOTEC	FER00AL200G	Используется для проверки целостности РНК; поставщик/каталог не указан
Перекись аммония	BioRad	1610700
Анти-кроличи IgG, связанный с HRP антитело	Cell Signaling	7074
Анти-крысичь IgG, связанный с HRP антитело	Cell Signaling	7077
Антибиотик-антимикотический	Gibco	15240062
Инвертированный микроскоп Axio Observer	Carl Zeiss	431007-9901-000	Добавлено из Дополнительных методов
Комплект для анализа белков BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	D49328
BD Cytometer Setup and Tracking beads	BD Biosciences	-	Добавлено из Дополнительных методов; каталог не указан
BD FACSDiva Software v8.0.3	BD Biosciences	-	Добавлено из Дополнительных методов
BD LSRFortessa X-20 клеточный анализатор	BD Biosciences	-	Существующая запись стандартизирована для соответствия дополнительному файлу
BioRender	BioRender	-	Используется для создания рабочего процесса на рисунке 1
Блокировщик для блоттинга	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
Белок сывороточный альбумин бычий (BSA)	Sigma	A1470
CaCl2	Calbiochem	208291
Комплект для обратной транскрипции cDNA	Invitrogen	4374966
Клеточный фильтр 100 мкм, нейлон	Falcon	352360
Клеточный фильтр 40 мкм, нейлон	Falcon	352340
Коллагеназа типа II	Gibco	17101-015
Дексаметазон	Sigma	D4902
DMEM порошок, высокая глюкоза, пируват	Thermo Scientific	12800017
DMEM/F-12, без фенольного красного	Thermo Scientific	21041025
DMEM/F-12, порошок	Gibco	12500062
ДМСО	Sigma	D8418	Растворитель для индукционной среды; поставщик/каталог не указан
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Абсолютный этанол	Merck	100983
Этиленгликоль-бис(β-аминоэтил эфир)-N,N,N',N'-тетраацетат тетранатриевая соль (EGTA)	Merck	324626
FAST SYBR MASTER MIX	Thermo Scientific	4385612
FCCP	Sigma	C2920
Фета́льная сыворотка бычья	Capricorn Scientific	BS-16A
Floreada.io	Floreada.io	-	Программное обеспечение для анализа цитометрии потоков
Fluoromount-G	Thermo Scientific	7984-25
GAPDH антитело	Santa Cruz	sc-32233
Глюкоза	Gibco	15023-021
Глутамат	Sigma	G1626
25% водный раствор глутаральдегида	Electron Microscopy Sciences	16210
Коший анти-мышиный IgG (H+L) вторичное антитело, HRP	Invitrogen	62-6520
GraphPad Prism v10.6.1	GraphPad Software	-	Программное обеспечение для статистического/логарифмического регрессионного анализа
Halt Коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз 100X	Thermo Scientific	78442