В этом исследовании была разработана и предварительно подтверждена модель замедленного заживления ран на крысе при условиях гипобарической гипоксии на большой высоте.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
* These authors contributed equally
В этом исследовании была разработана и предварительно подтверждена модель замедленного заживления ран на крысе при условиях гипобарической гипоксии на большой высоте.
Высокогорные гипобарические состояния могут вызывать длительную гипоксию ран и замедление заживления, однако стандартизированные модели остаются редкими. В этом исследовании мы разработали модель задержки заживления раны и предварительно проверили её, симулировав гипоксию на большой высоте с помощью контролируемой гипобарической системы. Крысы содержались на имитируемых высотах от 3000 м (давление воздуха: 70,1 кПа, парциальное давление кислорода: 14,7 кПа) до 8000 м (давление воздуха: 35,6 кПа, парциальное кислородное давление: 7,5 кПа) для определения порогов безопасности, с оценкой окислительного напряжения и гипоксии кожи. Результаты показали повышенный риск смертности на имитируемой высоте 6000 м, при этом допуска наблюдается ниже 5000 м. Возвышенные высоты были связаны с усилением окислительного стресса и увеличением гипоксии кожи; Проявляли задержки в заживлении раны, зависящие от высоты, снижение перфузии, подавление ремоделирования коллагена и обострение воспалительных реакций. Несмотря на повышение сосудистых регенеративных факторов, плотность микрососудистых сосудов снизилась. В целом, это исследование разработало и предварительно подтвердило модель крыс, подходящую для изучения механизмов и вмешательств при хронических ранах, вызванных гипоксией на большой высоте.
Восстановление кожных ран представляет собой широкомасштабную и значимую клиническую проблему. От острой травмы до различных типов незаживающих ран — эти состояния создают постоянную нагрузку на системы здравоохранения и качество жизнипациентов 1,2,3,4,5,6. Заживление ран — это не единичное событие, а высокоскоординированный, перекрывающийся многоступенчатый процесс: воспалительные клетки, стромальные клетки, кератиноциты и микрососудистая система совместно восстанавливают барьеры и ремоделируют ткани под совместной регуляцией внеклеточного матрикса и разнообразных сигнальныхсетей 7,8,9,10 . Учитывая энергоёмкий характер ремонта и его крайнюю чувствительность к внутренней среде, изменения в системном метаболизме и физиологических состояниях — такие как повышенный окислительный стресс, дисрегуляция иммунитета и нарушенная микроциркуляторная перфузия — могут нарушать нормальный каскад восстановления в нескольких точках, приводя к длительному воспалению, недостаточной регенерации и аномальнойремоделированию 9,11,12,13,14,15.
Поступление кислородом является ключевым фактором, ограничивающим процессы восстановления ран, участвуя в энергетическом метаболизме и миграции/пролиферации клеток, а также модулируя ангиогенез и воспалительные реакции через пути сигнализациигипоксии 16,17,18. Временная гипоксия на ранней стадии раны стабилизирует фактор, вызываемый гипоксией, и запускает программы адаптивного восстановления. Однако, когда гипоксия становится чрезмерной или устойчивой, хотя сигналы ангиогенеза могут компенсироваться, они могут не привести к эффективной микрососудистой реконструкции. Тем временем смена фенотипов макрофагов и воспалительная регрессия становятся более подвержены дисбалансу, образуя порочный круг «дефицита гипоксии-воспаления-реваскуляризации»19,20,21,22. Это особенно актуально в высокогорных условиях: снижение атмосферного давления снижает парциальное давление вдохновляемого кислорода, вызывая устойчивую гипоксию, повышающую риск ухудшения заживления ран и осложнений, связанных синфекциями 23,24,25,26.
Воздействие на большие высоты вызывает выраженную гипоксическую стрессовую реакцию улюдей 27. Высокогорные условия могут привести к устойчивой гипоксии тканей, недостаточной перфузии и воспалительным реакциям в местахраны 28. Эти патофизиологические изменения могут нарушать процесс заживления, стимулируя чрезмерную реакцию кислорода, активируя протеазы и вызывая клеточное старение, одновременно нарушая функцию мезенхимальных стволовыхклеток 29,30. Исследования, непосредственно оценивающие влияние воздействия на большой высоте на заживление ран на коже человека, остаются ограниченными. Поэтому использование гипобарических гипоксических животных моделей может помочь подтвердить влияние факторов, связанных с высотой, на восстановление раны.
Предыдущие модели на животных на фиксированных высотах фиксировали задержку заживления ран; Однако эффекты, зависящие от высоты, порог безопасности при длительном воздействии гипобарических состояний и прямые свидетельства локальной кожной гипоксии остаютсянеясными 26. Кроме того, отсутствует систематическая оценка нарушений заживления, что ограничивает исследования основных механизмов и выявление потенциальных целейвмешательства 31. В этом исследовании мы разработали и предварительно валидировали модель кожной раны на основе гипобарической системы контроля для моделирования высокогорной гипобарической гипоксии в контролируемых условиях. Используя стратегию градуированного моделирования высоты, мы сначала определили запасы безопасности для устойчивого гипобарического воздействия и оценили биологические эффекты гипобарической гипоксии с помощью системных индикаторов. Что важно, мы дополнительно подтвердили in vivo то, что гипобарическая среда действительно вызывает локальное ограничение кислорода в коже. Впоследствии мы показали, что устойчивая гипобарическая гипоксия задерживает закрытие раны в зависимости от высоты, сопровождаясь гистологическими изменениями и аномалиями ключевых путей. В целом, это исследование разработало и предварительно подтвердило животную модельную платформу для хронических ран, связанных с гипоксией на большой высоте, что позволило выяснить механизмы и систематически оценить последующие терапевтическиестратегии 32.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все экспериментальные процедуры с участием животных были рассмотрены и одобрены этическими комитетами Университета электронных наук и технологий Китая (No 106142025091534170) и Армейского медицинского университета (No AMUWEC20265509). Графический рабочий процесс для экспериментального проектирования и анализа в данном исследовании показан на рисунке 1. Кроме того, реагенты и оборудование, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов.
Экспериментальные животные и этическое заявление
В этом исследовании использовались самцы крыс Sprague-Dawley (SD), приобретённые у Chengdu Dashuo Laboratory Animal Co., Ltd., Китай. Все животные проходили 7-дневный период акклиматизации в стандартных условиях перед экспериментами.
Критерии включения и исключения
Критерии включения животных были следующими: самцы SD крыс, возраст 6–8 недель, масса тела 200–250 г, выглядящие здоровыми и проявляющие нормальное поведение, а также свободные кожные поражения или инфекции.
Критерии исключения животных были следующими: раны с явной инфекцией по моделированию раны; раны с нестандартным заживлением или порезами; Смерть во время эксперимента или случайная смерть из-за анестезии.
Критерии исключения точек по данным были следующими: изображения ран с обширной коркой, волосяной обструкцией или неравномерным освещением; изображения лазерной спекл-контрастной визуализации (LSCI), показывающие артефакты движения; срезы тканей с явными морщинами, фрагментацией или отсутствующими целевыми участками; образцы сыворотки, показывающие явный гемолиз; Изображения иммунофлуоресценции (IF) или иммуногистохимии (IHC) с чрезмерным воздействием или неправильной локализацией антител
Обращение с исключениями:
Для всех исключённых животных или точек данных действительные данные были повторно получены в ходе дополнительных экспериментов, чтобы обеспечить окончательный допустимый размер выборки для каждой группы N ≥ 3 для всех анализов конечных точек.
Гипобарическая система управления и имитация высокогорной гипоксии
Смоделированная высоковысотная гипоксическая среда была создана с помощью гипобарической системы управления. Эта система позволяет точно регулировать давление воздуха в кабине для воспроизведения атмосферного давления, соответствующего разным высотам, тем самым снижая парциальное давление окружающего кислорода и вызывая контролируемое гипоксическое воздействие (рисунок 2A).
Давление в кабине было отрегулировано для имитации высот 3000 м, 4000 м, 5000 м, 6000 м, 7000 м и 8000 м, с подробными параметрами в таблице 1. В течение всего эксперимента крысы SD размещались группами в зависимости от их экспериментального распределения. Во время работы кабины постоянно контролировались внутреннее давление, температура и влажность, чтобы гарантировать, что, кроме давления, все условия окружающей среды сопоставимы со стандартными лабораторными помещениями. Жилая среда поддерживала температуру 22–24 °C, относительная влажность 50%–60%, цикл света и темноты в 12 часов, а также обеспечивал свободный доступ к стандартной еде и питьевой воде.
Оценка безопасности гипобарического воздействия и анализ выживаемости
Для оценки запасов безопасности при длительном гипобарическом воздействии крысы были индивидуально пронумерованы и случайным образом распределены по экспериментальным группам с использованием компьютерной последовательности случайных чисел (функция RAND в Excel). Распределение осуществлялось исследователем, не участвовавшим в последующем уходе за животными, сборе данных или оценке результатов. На основе эталонных исследований на животных с воздействием высотных градиентов размер выборки для каждой группы был установлен на уровне 1233. Крысы были разделены на нормоксическую контрольную группу (500 м над уровнем моря) и имитированные группы высот на высотах 3000 м, 4000 м, 5000 м, 6000 м, 7000 м и 8000 м. Крысы в каждой группе постоянно содержались в своих местах в течение 30 дней. Каждые 2 дня гипобарическая система управления кратковременно восстанавливается до уровня моря на 30 минут для очистки клеток и обеспечения еды и водой. Во время декомпрессии и рекомпрессии скорость колебания давления поддерживается примерно на уровне 300 м/мин для минимизации риска баротравмы. В этот период ежедневно наблюдалось и фиксировалось общее состояние всех крыс и любые случаи смертности. Кривые выживаемости были построены с помощью метода Каплана-Мейера, а также проводились лог-ранговые тесты для сравнения различий в выживаемости между группами.
Обнаружение маркеров, связанных с окислительным стрессом в сыворотке
На 21-й день гипобарического воздействия были взяты образцы венозной крови у крыс под анестезией. После стоянки при комнатной температуре сыворотка отделялась центрифугой (1 000 × г в течение 15 минут при 4 °C) и хранилась при -80 °C для последующего использования. В сыворотке измерялись уровни лактатдегидрогеназы (LDH), малондальдегида (MDA) и супероксиддисмутазы (SOD) с помощью соответствующих тестовых наборов.
Оценка гипоксических состояний в тканях кожи
Набор для обнаружения гипоксии использовался для оценки гипоксии в кожной ткани. Кратко: на 4-й и 7-й дни гипобарического воздействия крысам внутрибрюшинно вводили пимозид (60 мг/кг); Крыс усыпляли через час после инъекции, а для анализа взяли кожную ткань со спины. Подробная процедура эвтаназии следующая: согласно рекомендациям Американской ветеринарной медицинской ассоциации по эвтаназии, животное было помещено в индукционную камеру и введено анестезию с использованием кислорода, содержащего 4–5% изофлурана. После потери сознания концентрация изофлурана снижается до 2–3% и сохраняется не менее 10 минут. Перед проведением вывиха шейки матки в качестве подтверждающего метода необходимо убедиться, что сердцебиение и дыхание прекратились. Образцы тканей криоконсервировались в жидком азоте и хранили при -80 °C для последующего использования. Секции готовились с помощью микротома криостата. Окрашивание IF проводилось для маркировки гипоксических областей внутри ткани.
Все флуоресцентные изображения были получены с помощью автоматического слайд-сканера. Параметры флуоресценции были следующими: DAPI (длина волны возбуждения 365 нм ± 10 нм, длина волны излучения 440 нм ± 40 нм), Cy3 (длина волны возбуждения 542–566 нм, длина волны излучения 579–611 нм) и Cy5 (длина волны возбуждения 628 нм, длина волны излучения 692 нм). Сигналы гипоксии количественно анализировались с помощью программного обеспечения ImageJ.
Модель раны на коже полной толщины у крыс
Для оценки изменений в заживлении кожных ран при устойчивых гипобарических условиях крыс сначала группировали и аквикировали к их соответствующей среде, прежде чем было проведено моделирование ран. Крысы были индивидуально пронумерованы и случайным образом распределялись либо в нормоксальную контрольную группу, либо в гипобарические группы воздействия, имитируя высоты 3000 м, 4000 м и 5000 м с использованием компьютерной последовательности случайных чисел (функция RAND в Excel). Рандомизация проводилась исследователем, который не участвовал в последующем создании раны, послеоперационном уходе или оценке исхода. Подробные параметры для каждой группы следующие: нормоксическая контрольная группа находилась на высоте 500 м над уровнем моря (атмосферное давление: 101 кПа, парциальное кислородное давление: 21 кПа); группа 3000 м (70,1 кПа, 14,7 кПа); группа 4000 м (61,6 кПа, 13,1 кПа); и группу на 5000 м (54 кПа, 11,3 кПа).
После 7-дневного адаптационного периода крысы с синдромом SD были анестезиированы и поддержаны под анестезией путём вдыхания 2% изофлурана. Одновременно в отмеченное хирургическое место вводится локальная инфильтрационная инъекция 5% лидокаина с эпинефрином (коэффициент разбавления: 1:100 000) для обеспечения периоперационной анальгезии и гемостаза. С помощью биопсийного пунша (с круглым лезвием диаметром 10 мм у основания) создают кожный разрез. Прижимайте биопсию к спинной коже крысы, затем аккуратно поверните её так, чтобы круглый лезвие постепенно прорезал кожу, пока не достигнет поверхностной подкожной фасции. После удаления биопсийного пунша образуется регулярный круглый кожный разрез диаметром примерно 10 мм.
После образования раны крысы в каждой группе возвращались и содержались в их исходных условиях до экспериментальной конечной точки, обеспечивая происходящее заживание раны в заранее определённых условиях кислорода.
Макрооценка процесса заживления ран
Фотографии раны были сделаны на днях 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14 дней после ранения при равномерном освещении и постоянном расстоянии съёмки. Площадь раны измерялась с помощью изображения J. Кратко: изображения ран, полученные в каждую точку времени, импортировались в изображение J, калибровались по шкале, а края раны вручную обводились для определения площадираны 34. Заживление ран рассчитывалось следующим образом: заживление раны (%) = (начальная площадь раны − текущая область раны)/начальная площадь раны × 100%.
Оценка микроциркуляции раны
На 7-й день заживления раны с помощью системы LSCI оценивали микроциркуляционную кровоточную перфузию в области раны. Перед осмотром крыс анестезиировали с помощью вдыхания 2% изофлурана и закрепляли на операционном столе с контролируемой температурой для поддержания температуры тела. Область спинной раны была полностью открыта, а лазерный зонд был расположен вертикально примерно в 20 см выше раны. Мощность зонда была установлена на 110 мВт, частота дискретизации — на 30 Гц, а время экспозиции — на 3 секунды. В тёмных условиях получите псевдоцветное изображение области раны с перфузией кровотока. Используйте программное обеспечение LSCI, чтобы вручную обвести область раны на псевдоцветном изображении кровотока; Затем программа автоматически рассчитывает значение кровотока для этой области в течение 3-секундного периода (в произвольных единицах [A.U.]). Наконец, экспортируйте значения перфузии в соответствующее программное обеспечение для построения графиков.
Гистологическое окрашивание и анализ ремоделирования коллагена
Животных эвтаназировали в определённые моменты времени, а целые раны и окружающие ткани кожи извлекались, фиксировали, обезвоживались, встраивались в парафин и разделялись на секции. Гематоксилин и эозин (HE): используются для оценки ширины раны, степени реэпителизации и регенерированной толщины эпидермиса; Трихромное окрашивание Массона: используется для оценки осаждения коллагеновых волокон и расчёта доли объема коллагена; Красная окрашивание Sirius: используется для различения коллагена типа I (col i) и коллагена типа III (COL III) при поляризованной световой микроскопии и расчёта соотношения COL I/COL III.
Иммуногистохимическое окрашивание
Парафиновые срезы прошли девосковую депиляцию, регидратацию и забор антигена перед окрашиванием IHC или IF. Первичные антитела инкубировали ночью при 4 °C, после чего добавлялись соответствующие вторичные антитела. Специфическая информация об антителах и соответствующее разбавление приведены в Таблице материалов. Срезы IHC были разработаны с использованием DAB, а IF — флуоресцентные вторичные антитела с DAPI-контрокрашиванием ядер35,36. Все изображения были получены при одинаковых условиях и количественно оценены с помощью программного обеспечения ImageJ.
Статистический анализ
Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Для сравнения между несколькими группами в одну временную точку времени применялся односторонний анализ дисперсии (ANOVA), а при обнаружении значительной общей разницы для последующих межгрупповых анализов применялся тест множественных сравнений Тьюки. Для данных о заживлении ран, оценённых в нескольких временных точках, была проведена двусторонняя ANOVA с учетом группы лечения и времени как независимых факторов для оценки основных эффектов и их взаимодействия. Пост-хок анализы также проводились с использованием множественного сравнительного теста Тьюки. Для дальнейшей оценки статистической мощности в программном обеспечении G*Power был проведён постфактический анализ мощности на основе основной конечной точки (заживление раны на 14-й день).
Анализ выживаемости использовал метод Каплана-Мейера для построения кривых выживаемости, а для сравнения различий в выживаемости между группами применялись тесты по логарифми. Для парных сравнений между несколькими группами была применена коррекция Бонферрони для контроля риска ошибок типа I при множественных сравнениях. Все статистические тесты были двусторонними, при этом P < 0,05 считался статистически значимым.
Все оценки результатов, включая измерения области раны, гистологические и иммуногистохимические количественные анализы, а также анализы LSCI, были проведены одним исследователем, который был ослеплен заданиями по группе.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Валидация запасов безопасности при устойчивой гипоксии, вызванной низким давлением
Анализ выживаемости Каплана–Мейера показал постепенное снижение кривых выживаемости по мере увеличения смоделированной высоты, при этом события смертности впервые были зафиксированы в группе 6000 м (рисунок 2B). Парные сравнения с коррекцией Бонферрони не выявили статистически значимых различий в показателях выживаемости между контрольной группой и группами...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Высокогорные условия нарушают процесс заживления раны, вызывая гипоксию тканей, снижая кровообращение и воспалительные реакции, что, в свою очередь, способствует чрезмерному образованию реактивных кислородных видов, активации протеаз, старению клеток и нарушению функции мезенхимальных стволовыхклеток 27,28,29,30 . Учитывая текущие ограничения в исследованиях на...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.
Это исследование финансировалось Фондом фундаментальных исследований центральных университетов, UESTC (ZYGX2025YGLH006); Исследовательский проект в области здравоохранения провинции Сычуань (2025-205); Фонд естественных наук Шигатсе, Тибет, Китай (RKZ2024ZR-003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Автоматический слайд-сканер | Олимп | VS200 | Сканирование тканевых срезов |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | Servicebio | GC305010 | Блокирующий реагент для IHC/IF |
| Антитело к CD206 | Proteintech | 18704-1-AP | Обнаружение макрофагов M2 (разбавление 1:200) |
| Антитела к CD31 | Abcam | ab182981 | Обнаружение плотности микрососудов (разбавление 1:800) |
| Антитело к CD86 | HuaBio | ER1906-01 | Обнаружение макрофагов M1 (разбавление 1:200) |
| Антитела к CK19 | HuaBio | ET1601-6 | Оценка реэпителизации (Разбавление 1:200) |
| Комплект для подкладки DAB | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | Хромогенный субстрат для окрашивания IHC |
| FITC-конъюгированный козёлый антикроличий IgG | Servicebio | GB22303 | Флуоресцентное вторичное антитело к ПФ (разбавление 1:100) |
| G*Power | Университет Дуйсбурга-Эссена, Германия | www.gpower.hhu.de | Расчёт статистической мощности |
| Программное обеспечение GraphPad Prism | Программное обеспечение GraphPad | https://www.graphpad.com/ | Статистический анализ и генерация графов |
| Раствор для окрашивания гематоксилином | J& K Scientific | LM10N13 | H& E-окрашивание |
| HIF-1α Антитела | Bioss | BS-0737R | Обнаружение сигналов, связанных с гипоксией (разбавление 1:100) |
| IgG с сопряжённой с HRP-конъюгированной козой | Servicebio | GB23303 | Вторичное антитело к ИГК (разбавление 1:100) |
| Гипобарическая система управления | Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd. | LP-1500 | Используется для моделирования градуированной высокогорной гипобарической гипоксии |
| Набор гипоксипроба-1 | Hypoxyprobe Inc. | HP1-100 | Используется для обнаружения гипоксии in vivo |
| Комплект для усиления сигнала IF555 Tyramide | Servicebio | G1233 | Используется для усиленного усиления флуоресцентного сигнала |
| Антитела к ИЛ-10 | HuaBio | HA722032 | Обнаружение противовоспалительного цитокина (разбавление 1:100) |
| IL-1 и бета; Антитела | HuaBio | HA723965 | Обнаружение провоспалительного цитокина (разбавление 1:100) |
| Программное обеспечение ImageJ | Национальные институты здоровья (NIH), США | https://imagej.net/ij/download.html | Количественная оценка изображения |
| Изофлуран | RWD Life Science Co., Ltd. | R510-22-16 | |
| Антитело Ki-67 | HuaBio | HA721115 | Обнаружение пролиферации кератиноцитов (Разбавление 1:400) |
| Лазерная система визуализации кровотока с точки зрения и nbsp; | RWD Life Science Co., Ltd. | RFLSI ZW | Оценка Кровоточная перфузия |
| LDH Assay Kit | Нанкинский институт биоинженерии | A005-1-2 | Измерение LDH в сыворотке |
| Массон Набор для окрашивания Trichrome | Servicebio | G1006-100ML | Анализ осаждения коллагена |
| Набор для анализа MDA | Нанкинский институт биоинженерии | A003-1-1 | Оценка пероксидации липидов |
| Набор для окраски Sirius | Servicebio | G1078-100ML | Дифференциация коллагена I/III |
| Набор для анализа SOD | Нанкинский институт биоинженерии | A001-1-1 | Измерение активности SOD в сыворотке |
| TNF и альфа; Антитела | HuaBio | ER65189 | Обнаружение провоспалительного цитокина (Разбавление 1:200) |
| Антитело VEGF-A | HuaBio | ET1604-28 | Обнаружение сигналов, связанных с ангиогенезом (Разбавление 1:200) |