Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
Секвитерпена лактон XTT эффективно ослабляет воспалительные реакции, вызванные липополисахаридами (LPS), у макрофагов. XTT нацелено на IKKα/β для подавления сигнализации NF-κB без нарушения активации MAPK, тем самым оказывая мощный противовоспалительный эффект in vitro.
Дисрегуляция каскада ядерного фактора-κB (NF-κB) тесно связана с прогрессированием воспалительных заболеваний. Киназы IκB (IKK) хорошо зарекомендовали себя как центральные модуляторы активности NF-κB, что делает их привлекательными кандидатами для лечения воспалительных патологий. Задокументировано, что сесквитерпен лактон 1β-гидроксил-5α-хлор-8-эпи-ксантатин (XTT) оказывает устойчивое противораковое действие. Однако его противовоспалительная активность и лежащие в основе молекулярные механизмы остаются неясными. В этой работе XTT значительно подавил синтез оксида азота (NO) и простагландина E2 (PGE2) в макрофагах RAW264.7, активируемых липополисахаридами (LPS). XTT также значительно снизил уровень индуцируемой оксидсинтазы азота (iNOS), циклооксигеназы-2 (COX2), фактора некроза опухоли-α (TNF-α), интерлейкина-1β (IL-1β) и интерлейкина-6 (IL-6). Кроме того, XTT понижал уровень белка iNOS и COX2, выработанные при лечении LPS. На механистическом уровне XTT существенно не изменил активность каскада митоген-активированной протеинкиназы (MAPK). В то же время XTT сильно блокировал фосфорилирование, спровоцируемое LPS, и разрушение ингибирирующего κBα (IκBα), взаимодействуя с IKKα/β, тем самым нарушая ядерную транслокацию NF-κB. В совокупности эти данные показывают, что XTT вызывает сильные противовоспалительные эффекты in vitro, нацеливаясь на IKKα/β и блокируя сигнализацию NF-κB. Эти результаты свидетельствуют о том, что XTT может служить перспективным свинцовым соединением для разработки противовоспалительных средств. Для подтверждения прямого ингибирования IKKα/β и терапевтического потенциала требуются дальнейшие биохимические и in vivo исследования.
Воспаление — это строго регулируемый биологический процесс, который позволяет организмам реагировать на инфекции, повреждение тканей и другие экологическиевызовы. 1. Хотя острые воспалительные реакции обычно являются защитными, устойчивая активация воспалительных путей может нарушать гомеостаз тканей и способствовать возникновению и прогрессированию хронических заболеваний, включая воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и ревматоидный артрит (РА)2. Множество внутриклеточных сигнальных сетей участвуют в регуляции воспалительных процессов, среди которых путь ядерного фактора-κB (NF-κB) является одним из самых широкоизученных.
Члены семейства NF-κB, включая p50, p52, p65 (RelA), RelB и c-Rel, функционируют как димерные транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию генов, участвующих в иммунитете ивоспалении 4,5. При базальных условиях димеры NF-κB остаются неактивными в цитоплазме из-за ассоциации с ингибиторами белков κB (IκB). После стимуляции воспалительных медиаторов, таких как липополисахарид (LPS) или фактор некроза опухолей α (TNF-α), комплекс IκBкиназы (IKK) активируется и фосфорилирует IκBα, что приводит к его убиквитинации и деградации. Этот процесс позволяет комплексам NF-κB накапливаться в ядре и инициировать транскрипцию воспалительных медиаторов ицитокинов 6. Поскольку чрезмерная или устойчивая активация NF-κB тесно связана с различными воспалительными и аутоиммунными заболеваниями, фармакологическое вмешательство на уровне сигнализации IKK вызывает значительныйинтерес 7,8,9.
Натуральные продукты давно являются жизненно важными источниками для разработки лекарств, включая противовоспалительныепрепараты 10. 1β-гидроксил-5α-хлоро-8-эпи-ксантатин (XTT) — это сесквитерпеновый лактон, выделенный из Xanthiumsibiricum 11,12. Предыдущие исследования показали, что XTT подавляет пролиферацию клеток и запускает апоптоз в клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека посредством активации ERK/p38 MAPK и ингибирования JAK2/STAT3, вызванного истощениемглутатиона 13. Однако противовоспалительный потенциал XTT и связанные с ним молекулярные механизмы до сих пор плохо изучены.
Текущие результаты показывают, что XTT проявляет значительный противовоспалительный эффект in vitro. Механистические исследования показывают, что XTT взаимодействует с IKKα/β и подавляет сигнализацию NF-κB, тем самым подавляя воспалительные реакции у активированных макрофагов. Эти данные свидетельствуют о том, что XTT может представлять собой перспективное свинцовое соединение для разработки противовоспалительных препаратов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В этом исследовании участвовали только установленные коммерческие клеточные линии и не были включены участники на людях, клинические образцы или эксперименты на животных. Поэтому одобрение институциональной этики и информированное согласие не требовались. Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями по безопасности лабораторных учреждений. Опасные реагенты обрабатывались в специально отведённых вытяжках с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ). Химические и биологические отходы утилизировались в соответствии с институциональными правилами. Химикаты, наборы и реагенты, используемые в протоколе, перечислены в Таблице материалов.
1. Культура клеток
Макрофаги мышей RAW264.7, клетки шейки матки HeLa и HEK293T эмбриональных почечных клеток человека были приобретены в Клеточном банке Китайской академии наук (Шанхай, Китай). Все клетки содержались в модифицированной среде Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco, содержащей 10% плодовой бычий сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина. Среда культуры была установлена на уровне 37 °C с 5% CO₂ и насыщенной влажностью.
2. Анализ жизнеспособности клеток
Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью анализа Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Клетки RAW264.7 (2,5 × 104 ячейки/скважину) были покрыты пластинами на 96 лунок и культивированы ночью при 37 °C. Затем клетки обрабатывались различными концентрациями XTT в течение 24 часов с LPS или без него (0,5 мкг/мл). Концентрация ЛПС и продолжительность лечения были оптимизированы в предварительных экспериментах для индуцирования умеренных воспалительных реакций без значительной цитотоксичности. Впоследствии в каждую скважину добавляли по 10 мкл реактива CCK-8, и пластина поддерживалась при 37 °C в течение 2 часов. Поглощение измерялось при 540 нм с помощью считывателя микропластин.
3. Определение уровней NO и PGE₂ в клеточной культурной среде
Клетки RAW264.7 были покрыты в пластины с 24 лунками с плотностью 2,5 × 105 клеток на колодец и культивированы ночью при 37 °C. Клетки предварительно обработали XTT в течение 2 часов перед стимуляцией LPS или TNF-α (15 нг/мл) ещё 24 часа. Двухчасовой период до лечения был выбран для обеспечения адекватного взаимодействия между XTT и клеточными мишенями перед воспалительным вызовом. Уровни оксида азота (NO) и простагландина E₂ (PGE₂) в культурной среде были количественно измерены согласно протоколам производителя.
4. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (qRT-PCR)
Клетки RAW264.7 (2 × 10по 6 клеток) были обработаны в пластины с 6 лунками за ночь и предварительно обработаны различными дозами XTT в течение 2 часов перед вызовом LPS (0,5 мкг/мл) в течение 24 часов. Общая РНК была выделена с помощью реагента TRIzol согласно инструкциям производителя. Концентрация и чистота РНК оценивались с помощью спектрофотометра, а для дальнейших анализов использовались образцы с соотношением A260/A280 >1,8.
Общая РНК (2 мкг) была обратно транскрибирована в кДНК в итоговом реакционном объёме 20 мкл с использованием набора для синтеза кДНК. Количественная ПЦР в реальном времени проводилась с использованием химии SYBR Green на системе обнаружения ПЦР в реальном времени. Последовательности праймеров были следующими:
iNOS вперед: 5′-GGA TCT TCC CAG GCA ACC A-3′
iNOS реверс: 5′-AAT CCA CAA CTC GCT CCA AGA TT-3′
COX2 вперед: 5′-CAA CAC CTG AGC GGT TAC-3′
Реверс COX2: 5′-GTT CCA GGA GGA TGG AGT-3′
IL-1β вперед: 5′-GCC TTG GGC CTC AAA GGA AAG AAT C-3′
IL-1β реверс: 5′-GGA AGA CAC AGA TTC CAT GGT GAA G-3′
IL-6 Форвард: 5′-TGG AGT CAC AGA AGG AGT GGC TAA G-3′
IL-6 реверс: 5′-TCT GAC CAC AGT GAG GAA TGT CCA C-3′
TNF-α вперед: 5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT-3′
TNF-α реверс: 5′-GGC TAC AGG CTT GTC ACT C-3′
GAPDH Форвард: 5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3′
GAPDH реверс: 5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′
Процедура усиления ПЦР проводилась следующим образом: начальная денатурация при 95 °C в течение 5 минут, затем 39 циклов при температуре 95 °C в течение 15 с и при 60 °C в течение 30 секунд. Относительные уровни экспрессии генов рассчитывались с использованием метода 2−ΔΔCt с GAPDH в качестве внутреннего контроля.
5. Вестерн-блоттинг
После лечения клетки RAW264.7 были гомогенизированы в буфере RIPA, содержащем ингибиторы протеазы и фосфатазы. Эти ингибиторы готовили свежими непосредственно перед использованием, чтобы предотвратить деградацию и дефосфорилирование белка. Общий уровень белка был количественно измерен с помощью набора BCA. Равные количества белка отделялись электрофорезом геля с помощью 10% натрия додецилсульфата-полиакриламида и передавались на мембраны нитроцеллюлозы. После переноса мембраны инкубировали с 5% обезжиренным молоком, приготовленным в TBST, содержащем Tween-20 (TBST), для блокировки, а затем проследили первичными антителами (разбавление 1:1 000) ночью при 4 °C. Затем мембраны исследовали вторичными антителами, конъюгированными пероксидазой хрена (разбавление 1:5 000) в течение 1 часа при комнатной температуре. Белковые полосы были обнаружены с помощью системы обнаружения хемилюминесценцией, а интенсивность полос анализировалась с помощью денситометрической количественной оценки.
6. Иммунофлуоресцентный анализ
Клетки HeLa были посеяны в пластины с 6 лунками и предварительно обработаны XTT (8 мкм) в течение 4 часов перед стимуляцией TNF-α (15 нг/мл) в течение 30 минут. Этот 4-часовой прединкубационный период был выбран для максимизации поражения цели перед активацией NF-κB. Клетки фиксировались с помощью 4% параформальдегида в течение 15 минут и пермеабилизировали с помощью 0,25% тритона X-100 в течение 15 минут при комнатной температуре. После блокировки 2% бычьей сыворотки из бычьей сыворотки (BSA) и 10% козьей сыворотки, разбавленной в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), клетки инкубировали первичным антителом против p65 (разбавление 1:250) в течение ночи при 4 °C, после чего проводились зондирование с TRITC-конъюгированным вторичным антителом (разбавление 1:1 000) в течение 1 часа при комнатной температуре. Ядра были заменены DAPI (0,5 мкг/мл) в течение 5 минут в темноте. Флуоресцентные изображения были сделаны с помощью флуоресцентного микроскопа. Клетки HeLa были выбраны потому, что их большое соотношение цитоплазмы к ядру облегчает визуализацию ядерной транслокации p65.
7. Цитоплазматическое и ядерное фракционирование
Клетки HeLa были предварительно инкубированы XTT в течение 4 часов, а затем стимулированы TNF-α (15 нг/мл) в течение 30 минут. Клетки собирались, промывались холодным PBS и обработаны для экстракции цитоплазматического и ядерного белка с помощью коммерческого набора для ядерной и цитоплазматической экстракции белков согласно инструкции производителя. Все процедуры проводились на льду для сохранения целостности белка.
8. Клеточный термальный сдвиг (CETSA)
CETSA проводился как описаноранее 14. Примерно 1 × 107 клеток HeLa были собраны и повторно суспендированы в 500 мкл холодных PBS, содержащих ингибиторы протеаз, после чего лизировали через три цикла замораживания и оттаивания в жидком азоте. Клеточные лизаты центрифугировали при 20 000 × г в течение 15 минут при 4 °C. Полученные супернатанты были равномерно распределены на две группы и обработаны либо XTT (100 мкм), либо DMSO в течение 1 часа при комнатной температуре. XTT (100 мкм) применялся для повышения чувствительности к обнаружению в экспериментах ETSA. Образцы затем были аликотированы в семь пробирок и нагревались при указанных температурах в течение 3 минут, после чего инкубировали при комнатной температуре ещё 3 минуты. Для иммуноблоттинга были собраны растворимые белковые частицы.
9. Молекулярная стыковка
Анализ молекулярного стыковки был проведён как описановыше 14. Кристаллические структуры IKKβ (PDB ID: 3BRT и 4KIK) были извлечены из Белкового банка данных (PDB). Белковые структуры предварительно обрабатывались с помощью PyMOL (версия 2.3.4) для удаления молекул воды, исходных лигандов и примесей, а затем добавления атомов водорода. Были рассчитаны тарифы Gasteiger, а активные карманы идентифицированы с помощью AutoDock Tools (версия 1.5.6). Структуры белков затем сохранялись в формате PDBQT.
Структура XTT была сгенерирована в Chem3D (версия 15.1) и оптимизирована за счёт минимизации энергии. Полугибкая стыковка выполнялась с использованием AutoDock Vina (версия 1.1.2). Сетчатые коробки были созданы так, чтобы полностью закрывать активные карманы, в то время как все остальные параметры оставались на стандартных настройках. Для анализа были выбраны стыковочные позы с наименьшими энергиями связывания и наиболее стабильными конформациями. Энергии связывания ниже −5 ккал/моль считались признаком сильной связывающей связи согласно опубликованным критериям. PyMOL также применялся для визуализации режимов связывания и оценки водородных связей, гидрофобных взаимодействий, взаимодействий ван-дер-Ваальса и потенциальных сайтов связывания.
10. Статистический анализ
Все статистические анализы проводились с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.0. Данные представлены как среднее ± стандартную ошибку среднего значения (SEM) из трёх независимых экспериментов. Статистическая значимость оценивалась с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA), за которым следовал пост-хок тест Даннетта. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
XTT ингибировал выработку NO и PGE₂ в макрофагах RAW264.7, стимулируемых LPS- или TNF-α
Чтобы определить, независимо ли противовоспалительные эффекты XTT от цитотоксичности, была оценена жизнеспособность клеток RAW264.7 после обработки XTT при наличии или отсутствии LPS. Существенного снижения жизнеспособности клеток при концентрациях от 0,5 до 8 мкм не было обнаружено, что свидетельствует о хорошей переносимости соединения в экспериментальных условиях (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Секвитерпеновые лактоны — это класс натуральных продуктов с разнообразными фармакологическими свойствами, включая антисептиковые, противовоспалительные и антипиретические и детоксикационныеэффекты 15. Предыдущие исследования показали, что XTT, секвитерпеновый лактон, выделенный из Xanthium sibiricum, обладает мощным антипролиферативным и про-апоптотическим эффектом в клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека13. В этой работе оце...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 82004031), исследовательским проектом Сычуаньского провинциального управления традиционной китайской медицины (No 2024MS566) и Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (No 2023YFC3504402).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Enhanced chemiluminescence reagent D20A2:D21A2:D22A2:D23A2: D24A2:D25A2:D26A2:D27A2:D28A2: D29A2:D30A2:D29 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P90720 | luminescent signal detection |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies | Signalway Antibody (Nanjing) | L30118 | specifically binds to the primary antibody |
| p65 primary antibody | Bioworld | BS4139 | specifically recognizes NF-κB p65 subunit protein |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | SCR_018042 |
| 0.45 μM Ployvinylidence fluoride membrane | Millipore | PR05509 | adsorb protein molecules |
| 1β-hydroxyl-5α-chloro-8-epi-xanthatin | Chengdu Institute of Biology | natural monomeric compounds | |
| All-in-One cDNA Synthesis SuperMix | Bimake (Shanghai) | B24408 | reverse-transcribe |
| BAY11-7082 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | SF0011 | IκB/IKK inhibitor |
| Bcl2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 32012 | AB_3751037 |
| Bicinchoninic Acid (BCA) kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0010S | total protein quantification |
| CCK-8 agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C0038 | cell viability measurement |
| Chemiluminescence detection system | Millipore, Bedford, USA | P90720 | acquire and process luminesence signals |
| COX-2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 33345 | AB_3676692 |
| DMSO | Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd. | A100231-0500 | solubilize compounds |
| GAPDH antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41549 | AB_3751036 |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | image acquisition and analysis |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | gradient annealing temperature |
| Griess agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | S0021S | NO quantification |
| Human cervical carcinoma HeLa cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-504 | Human-derived cells |
| Human TNF-α | Novus Biologicals | 210-TA | pro-inflammatory cytokines |
| iNOS antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 48309 | AB_2943634 |
| Laser Confocal Inverted Microscope | Olympus | FV1000 | SCR_016840 |
| LPS ( E.coli 055:B5) | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd | L6529 | establish inflammatory models |
| Murine macrophage RAW264.7 cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-5036 | Mouse-derived cells |
| Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0027 | separate cytoplasmic and nuclear proteins |
| PD98059 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1177 | MEK inhibitor |
| P-ERK (Thr202/Thr185) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 12548 | detect the phosphorylation level of ERK protein |
| p-IKKα/β (Ser176/Ser177) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11931 | AB_3751034 |
| p-IκBα (phospho-Ser32)antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13776 | AB_3751033 |
| p-JNK (T183/T221) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13371 | AB_3718662 |
| p-p38 MAPK (Thr180) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11581 | AB_3751032 |
| Prostaglandin E2 Parameter Assay Kit | R&D Systems | KGE004B | AB_2894942 |
| PS1145 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S7691 | specific IKK inhibitor |
| Rapid SDS-PAGE Gel Preparation Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | protein separation |
| Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 | SCR_018064 |
| RIPA buffer | Bimake (Shanghai) | P0013C | cell lysis |
| SB203580 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1076 | p38 MAPK inhibitor |
| SP600125 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1460 | JNK inhibitor |
| SYBR Green | Bimake (Shanghai) | B21202 | For real-time quantitative |
| TRITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | A0568 | AB_2893016 |
| TRITC-conjugated second antibody | Beijing Baiao Leibo Technology Co., Ltd. | ZN1992 | AB_3751143 |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | total RNA isolation |
| Vinculin antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41534 | AB_3751035 |