Многоцентровая потоковая цитометрия для острого миелоидного лейкоза Измеримого остаточного заболевания с LAIP/DfN и CD34+CD38 — популяций, обогащённых лейкемическими стволовыми клетками

Краткое содержание

Этот протокол описывает многоцентровую потоковую цитометрию для измеримого остаточного заболевания при остром миелоидном лейкозе с использованием анализа иммунофенотипа/дифференциального (LAIP/DfN) и фенотипически определённых популяций CD34⁺CD38⁻ лейкемических стволовых клеток.

Аннотация

Для оценки ответа на лечение в клинических испытаниях острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) рекомендуется для оценки ответа на лечение в рамках клинических исследований острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) согласно рекомендациям ELN 2025. Целью этого исследования было внедрение стандартизированного наблюдения пациентов с использованием гармонизированного подхода потока MRD в 30 французских гематологических лабораториях, участвующих в клинических испытаниях ОМЛ. Для получения сопоставимых результатов сеть разработала рекомендации от процедур с влажной лабораторией до клинических отчетов. Мы разработали панель из трёх трубок с обязательными 8-цветными общими маркерами на пробирку, согласно рекомендациям ELN, для выявления иммунофенотиповых/отличных от нормы (LAIP/DfN) моделей в объёмных клетках и популяциях, обогащённых лейкемическими стволовыми клетками (LSC), в фракции CD34⁺CD38⁻ . Была использована основа CD34/CD38/CD45/CD117, дополненная маркерами линии для первой трубки, маркерами, ассоциированными с LSC для второй трубки, а также моноцитарными и дифференциационными маркерами для третьей трубки. Эта панель может использоваться в форматах 8, 10 и 12 цветов и реализована на нескольких традиционных платформах потоковых цитометров. Мы предлагаем настройки потокового цитометра, адаптированные к каждой платформе.

Гармонизация чувствительности между четырьмя платформами проводилась с использованием радужных бусинок с 8 пиками. Иммунокрашивание проводилось после объёмного лизиса. Для выявления смещения между платформами индекс окрашивания тестировался с использованием свежих здоровых образцов костного мозга параллельно на четырёх платформах. Обычные образцы качества костного мозга для контроля качества костного мозга были обменены между лабораториями для оценки качества по влажной внешности (EQA) с целью проверки всех этапов протокола. Наконец, стандартизация стратегии анализа данных, полученной в центрах, была оценена с помощью сухого EQA путем обмена файлами данных MRD FCS. Осуществимость такого многоцентрового подхода требует гармонизации чувствительности приборов и подготовки образцов, а также обучения и систематического обучения аналитических операторов.

Введение

Измеримое остаточное заболевание (МРД) — это небольшое количество лейкемических клеток, которые сохраняются во время или после лечения и не обнаруживаются по морфологии, особенно в случаях полной ремиссии с менее 5% бластов в костном мозге. Мониторинг МРД рекомендуется для оценки ответа на лечение в клинических исследованиях острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) согласно рекомендациям^{ELN 2025 1}. Помимо методов молекулярной биологии, включая обратную транскриптазу ПЦР (RT-qPCR) и секвенирование следующего поколения (NGS), мультипараметрическая потоковая цитометрия (MFC) является широко используемым^{подходом 2}.

Для получения последовательных результатов MRD, особенно в клинических испытаниях, возможны две стратегии: централизация измерения MRD в одной лаборатории или внедрение протокола, обеспечивающего воспроизводимость между различными лабораториями, участвующими в определении MRD. Количество образцов, размер исследования и возможности лабораторий обрабатывать большие или меньшие объёмы образцов могут определить выбор между этими стратегиями. Если выбирается многоцентровая стратегия, необходимо учитывать различия между платформами цитометров и необходимость сопоставимого анализа на разных участках.

Для этой цели мы описываем стандартизированный многоцентровый и многоплатформенный подход к потоку MRD, сочетающий анализ иммунофенотипов, ассоциированных с лейкемией/диференциальных от нормы (LAIP/DfN), и фенотипически определённое обнаружение CD34⁺CD38⁻ лейкемических стволовых клеток (LSC), реализованное в 30 французских гематологических лабораториях на основе рекомендаций ELN и предыдущих отчетов ^3,4.

Потоковая цитометрия позволяет определить при постановке диагноза «подпись» лейкемии, включающую специфическую экспрессию маркеров на бластах пациента: LAIP. После лечения поток MRD позволяет отслеживать выявленные LAIP при постановке диагноза. Поскольку лейкемические бласты могут эволюционировать и модифицировать иммунофенотип под терапевтическим давлением, необходимо систематически внедрять вторую стратегию: подход DfN, который основан на выявлении клеток с характеристиками, отличающими их от нормального гемопоэза. Эта техника также позволяет обнаруживать появление новых маркеров на бластах в ходе заболевания и его лечения.

Во французской группе потоков AML дизайн панели основывался на ранее опубликованном исследовании HOVON определения паттерна лейкемических клеток. Универсального маркера LSC или LAIP нет, поэтому мы разработали панель из трёх трубок, позволяющую одновременно идентифицировать популяции LAIP, DfN и CD34⁺CD38⁻ LSC. Во всех трубках использовалась основа CD34/CD38/CD45/CD117, дополненная маркерами линии в первой трубке, маркерами, ассоциированными с LSC, во второй трубке, и моноцитарными маркерами линии или дифференцировки в третьей трубке для завершения определения LAIP при ОМЛ с помощью моноцитарных бластотов. Все три пробирки берутся при постановке диагноза и в последующих образцах.

Учитывая патофизиологию лейкемогенеза, внимание переключилось с изучения объёма бласта на выявление наиболее незрелых фракций как популяций, обогащённых лейкемическими стволовыми клетками. Дик и коллеги продемонстрировали гетерогенность лейкемии, описав CD34⁺CD38⁻ LSC с потенциалом вызывать лейкемию у иммунодефицитных^{мышей 5,6}. При количественной оценке LSC при диагностике и последующем нагляде предпринимаются усилия по стандартизации панелей антител и стратегий анализа в рабочей группе ELN^{DAVID 1,7}. В настоящее время две панели — HOVON и ALFA — используют дихотомические LSC-маркеры для отличия популяций, обогащённых LSC, от нормальных гемопоэтических стволовых клеток в пространстве CD34⁺CD38^{− 8,9}.

Описанный здесь метод сочетает стандартизированную подготовку образцов, общее проектирование панелей антител, адаптированные к платформе настройки чувствительности, анализ LAIP/DfN и CD34⁺CD38⁻ LSC, внешнюю оценку качества и гармонизированную клиническую отчетность для многоцентрового мониторинга потока МРД по ОМЛ.

Протокол

Протокол следует рекомендациям и руководящим принципам этических комитетов Французских университетских больниц. Все пациенты подписали информированное согласие согласно французскому законодательству. Протокол исследования был утверждён Комитетом по этике человека CHU Лион и Этическим комитетом Институционального обзорного совета Лилльского CHU в соответствии с Декларацией Хельсинки (обсерватория HDF-AML, CNIL 2214454v0). Для аллотрансплантата доноры включались в европейскую интернет-базу данных ProMISE и предоставляли информированное согласие на сбор своих персональных данных. Извлечение и анализ данных проводились в соответствии с местным Этическим комитетом (CNIL2093819). Все файлы потока FCS, используемые для сетевого обзора, были полностью анонимизированы с помощью скрипта на Python.

1. Настройка цитометра

1. Определите целевые значения, адаптированные к каждому цитометру, используя радужные бусины с 8 пиками.
2. Устанавливайте каждую машину согласно целевых значениям, указанным в Таблице 1. Убедитесь, что каждый канал достигает целевого значения ± 5%. Систематически проверяйте эту настройку, чтобы поддерживать продольную чувствительность каждой платформы.
3. Установите компенсационную матрицу с помощью однократных трубок для каждого антитела, используя компенсирующие шарики и/или клетки в зависимости от каждой платформы.
4. Сохраняйте матрицу настройки и компенсации в виде анализа или протокола, идентифицируемого как MRD LAIP/DfN, LSC и MonoGran (T1, T2, T3). Используйте этот анализ или протокол для количественной оценки потока MRD по AML.

2. Процедура мокрой лаборатории

1. Аспират костного мозга
   1. Собрать 1-2 мл костного мозга ЭДТА при диагностике и в точках мониторинга, включая MRD1, MRD2, MRD3, MRD4 и рецидив.
   2. Отправьте трубки в лабораторию опорного потока в течение 24-48 часов.
2. Подготовка мазка костного мозга к морфологическому исследованию
   1. Поместите каплю аспирации костного мозга на стеклянный стекло. Аккуратно размазывайте образец с помощью накладки или другого слайда.
   2. После 30 минут сушки покрасьте мазок May-Grünwald-Ghimsa (Дополнительный файл 1).
3. Объёмный лизис
   1. Добавьте 15 мл лизингового раствора_{NH 4}Cl к 1-2 мл образца костного мозга. Аккуратно перемешайте и инкубуйте 10 минут при комнатной температуре.
   2. Центрифугуйте при 450 × г при комнатной температуре 5 минут и выбросьте супернатант.
   3. Суспензировать клеточную гранулу в 10 мл PBS/0,1% BSA. Центрифугуйте при 450 × г при комнатной температуре в течение 5 минут и сбросьте супернатант.
   4. Суспензировать клеточную гранулу в концентрации 30 × 10⁶ WBC/mL в PBS.
4. Иммунокрашивание клеточной суспензии
   1. Распределить моноклональные антитела в пробирках T1, T2 и T3 в соответствии с платформой (Таблица 2). Укажите клон, объём, каталог и поставщика для каждого антитела в таблице антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого тюбика, использующего ярко-фиолетовые красители, используйте Brilliant Mortar Buffer перед добавлением антител.
   2. Добавьте 2-3 ×10^{по 6} лизированных клеток в каждой трубке в 100 мкл суспензии клетки. Инкубировать клетки антителами в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре.
   3. Промой клетки 3 мл PBS. Центрифугите 5 минут при 450 × г и выбросьте супернатант.
   4. Повторно суспензировать окрашенные клетки в 300 мкл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Могут использоваться готово смешанные коктейли с антителами или валидированные сухие пробирки.

3. Получение потокового цитометра

1. Откройте MRD анализ или протокол приобретения с адаптированной матрицей настройки и компенсации для измерения MRD, LAIP/DfN и LSC.
2. При постановке диагноза и в образцах МРД в каждой пробирке получайте минимум от 500 000 до 1 000 000 лейкоцитов, чтобы улучшить кластеризацию клеток MRD и повысить уверенность в низкоуровневом MRD.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения LSC необходимо получить минимум 1 000 000 лейкоцитов в трубке 2, чтобы обеспечить адекватную чувствительность для количественной оценки LSC (LOQ 0,002% и LOD 0,001%)^10,11.
3. Сохраняйте файлы данных FCS из образцов диагностики и MRD. Фиксируйте дату приобретения и идентификацию пациента для облегчения последующего анализа MRD и LSC.

4. Стратегия анализа

1. Используйте общий шаблон и общую последовательность точечного графика, включающую заранее определённую гармонизированную стратегию гейтинга, адаптированную к программному обеспечению анализа, используемому в каждом центре.
2. Примените стратегию гейтинга для выявления лейкемических клеток с помощью трёх подходов: анализ LAIP, DfN и LSC ^{в фракции} CD34⁺CD38.
3. Выявлять и исключать потенциальные неспецифические события и нормальные физиологические популяции, включая базофилы, плазмацитоидные дендритные клетки, гематогоны, плазматические клетки, эритробласты, сгустки тромбоцитов, обломки и нелизированные эритроциты.

5. Определение LAIP/DfN и физиологических популяций

1. Для захвата LAIP массовыми взрывами нарисуйте одноэлементный элемент на основе FSC-W и FSC-H.
2. Нарисуйте гейт с живыми ячейками на основе FSC и SSC.
3. Нарисуйте взрывной затвор на CD45^{в затемнении}/SSC.
4. Нарисуйте элемент примитивного маркера с помощью CD34/CD117.
5. Используйте фиксированные бипараметрические точечные графики для отображения соответствующих LAIP-элементов, включая LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7 и LAIP8.
6. Физиологические популяции
   1. Гематогоны затвора с использованием следующей последовательности: живые ячейки, MNC на точечном графике FSC/SSC, точечный график CD19/SSC и точечный график CD34/CD38. Бэк-гейт с помощью CD45/SSC.
   2. Базофилы с использованием следующей последовательности: живые клетки, MNC на точечном графике FSC/SSC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA^-), без исключения гематогонов CD19⁺ . Бэк-гейт с помощью CD45/SSC.
   3. Затвор плазмацитоидных дендритных клеток по следующей последовательности: живые клетки, MNC на точечном графике FSC/SSC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA⁺), исключая гематогены CD19⁺ . Бэк-гейт с помощью CD45/SSC.
   4. Определите эритробласты, сгустки тромбоцитов, обломки и нелизированные эритроциты с помощью точечного графика CD36/CD45. Бэк-гейт с использованием CD45/SSC и FSC/SSC.
7. Подход LAIP
   1. Определите MRD в CD34⁺ ИЛИ CD117⁺ примитивном AML с использованием булевых операторов следующим образом: LAIP1 И LAIP2 И LAIP3 И LAIP4 И LAIP5 И LAIP6 И LAIP7 И LAIP8 И НЕ чистые CD36^яркие+/CD45 И одиночные ячейки И живые ячейки И CD34^+/CD117^+/ примитивные маркеры И (CD45/SSC blast gate ИЛИ MNC CD34⁺) (рисунок 1).
   2. Определите MRD в CD34-CD117-AML с использованием булевых операторов следующим образом: LAIP1 И LAIP2 И LAIP3 И LAIP4 И LAIP5 И LAIP6 И LAIP7 И LAIP8 И НЕ чистые CD36^ярки+/CD45 И отдельные ячейки И живые ячейки И CD34CD117 и CD45/SSC blast затвор (рисунок 2).
8. Подход DfN
   1. Используйте тот же шаблон, что и подход LAIP, и примените пустое пространство, определённое на эталонных образцах костного мозга (Таблица 3).
   2. Определите аномальные популяции, когда кластер аномальных клеток отделён от нормальных клеток на 0,5 десятилетия по логарифмичной^{шкале 12}.
   3. Чтобы захватить DfN массовыми взрывами, рисуйте живые ячейки с помощью FSC/SSC.
   4. Рисуйте отдельные ячейки, удаляя дублеты в зависимости от пика FSC/площади SSC.
   5. Нарисуйте элементы MNC с помощью FSC/SSC.
   6. Примените очистительный гейт для удаления лимфоцитов с помощью CD45/CD36/SSC.
   7. Установите уборочный шлюпка, чтобы удалить эритропласты и мусор с помощью CD45/CD36.
   8. Используйте два входных элемента — CD34⁺/CD45/SSC и CD117⁺/CD45/SSC — чтобы определить пустые блоки согласно предыдущим^{публикациям 12, 13}.
   9. Каждый пустой блок DfN определяется по внутренним контрольным популяциям, включая лимфоциты для маркеров перекрестной линии и нормальные миелоидные прекурсоры для маркеров потери, снижения или переэкспрессии.
   10. Сравните пустые коробки с эталонными образцами костного мозга, включая регенерирующий, воспалительный и здоровый донорский костный мозг.

6. Определение ^{популяции} LSC CD34⁺CD38

1. Идентифицировать клетки, обогащённые LSC, при постановке диагноза ^{в пространстве} CD34⁺CD38 на основе маркеров LSC с дихотомической экспрессией и отсутствием экспрессии в нормальных гемопоэтических стволовых клетках здорового костного мозга.
2. Определите входной элемент LSC как MNC34⁺ с помощью следующей последовательности гейтинга: живые ячейки, одиночные ячейки, MNC и CD34⁺ в точечном графике CD45/CD34.
3. Определите долю CD34⁺CD38^- (P6) с помощью строгого порога, основанного на уровне флуоресценции CD38 минус один (FMO).
4. Определите клетки, обогащённые LSC, в трубке 1 фракции P6, используя булевые операторы следующим образом: P6CD7⁺ ИЛИ P6CD33⁺ ИЛИ P6CD19⁺ ИЛИ P6CD56⁺ , НЕ чистые CD36^яркие+ и одиночные клетки И живые клетки, И MNC И MNC CD34⁺.
5. Определите клетки, обогащённые LSC, в трубке 2 фракции P6, используя булевые операторы следующим образом: ^P6CD45RA+ ИЛИ P6MIX⁺ ИЛИ ^P6CD123+ И НЕ чистые CD36^яркие+ и одиночные клетки И живые клетки, И MNC И MNC CD34⁺.
6. Используйте CD36 для очистки неспецифических событий в финальной MRD LSC (рисунок 3).

7. Определение порога CD38^- в популяции CD34⁺

1. Установите канал CD38 достаточно высоко, чтобы отличать ^{популяции} CD38 от популяций CD38⁺ с хорошим разрешением.
2. Определите P6 как CD34⁺CD38^-, P7 как CD34⁺CD38^low, а P8 как CD34⁺CD38^high.
3. Настройка канала CD38 основывается на популяциях CD38-ярких групп, определяя плазматические клетки как самую яркую, а гематогены — в зависимости от диапазона измерений каждой платформы.
4. Определите популяцию CD34⁺CD38^- (P6) с использованием подхода CD38 FMO, валидированного изоклонным контролем CD38.
5. Определите^низкую популяцию CD34⁺CD38 (P7) с помощью гематогоноотрицательного уровня.
6. Определите^{высокую} популяцию CD34⁺CD38 (P8) с использованием уровня гематогоной положительной положительности и отрицательного уровня плазматических клеток (рисунок 4).
7. Используйте одинаковый порог CD38^- для всех гармонизированных групп, используя надёжные методы, такие как CD38-FMO или изоклонный CD38-контроль.
8. Используйте как минимум один аномальный иммунофенотип ^{в фракции} CD34⁺CD38 для определения клеток, обогащённых LSC. Включайте маркеры LSC, такие как CLL1/TIM3/CD97/CD45RA/CD123, или маркеры родословной, например CD7/CD19/CD56/CD33.
9. Применяйте следующие пороги: чувствительность к анализу LOQ ^10-4 и LOD ^10-5; Положительный результат LSC при диагнозе ≥ 1% бластов CD45/SSC; а положительный показатель LSC при последующем МРД ≥ 0,01% от WBC.

8. Гармонизированный отчёт о клиническом потоке

1. При каждом результате указывайте следующую информацию: качество костного мозга, стратегия идентификации MRD, описание LAIP, LOD и LOQ, пороги и интерпретация результатов.
2. Гемодилюция и представительность костного мозга
   1. Оценивайте гемодилюцию для каждого клинического отчёта о потоке MRD, чтобы оценить устойчивость результата.
   2. При применимости используйте один из описанных ранее методов гемодилюции (Таблица 4)^{7,14,15,16,17,18,19,20,21}.
   3. В качестве дополнительного подхода рассчитывайте репрезентативность костного мозга, используя наблюдаемое соотношение CD34/WBC45 по сравнению с ожидаемым соотношением, наблюдаемым в эталонных образцах костного мозга (рисунок 5).
   4. Используйте следующую формулу:
      P: процент чистоты = 100 × (н/л - с) / (м - с)
      s: доля клеток MNC CD34⁺ в нормальной периферической крыви: 0,0005
      m: доля клеток MNC CD34⁺ в нормальном костном мозге: 0,035
      L: количество лейкоцитов WBC45⁺ в образце пациента с MRD
      n: количество клеток MNC CD34⁺ в образце пациента с MRD
   5. Сообщите о репрезентативности костного мозга как о качественной оценке образца. Не используйте это значение для нормализации результатов MRD.
   6. Интерпретируем репрезентацию костного мозга следующим образом: 100% до 10%, низкое влияние на долю CD34⁺ клеток костного мозга; 10% против 1%, предупреждение о интерпретации результатов МРД; и < 1%, неинтерпретируемый результат.
3. Количественная оценка LSC при постановке диагноза
   1. Сообщите профиль, используемый для идентификации клеток, обогащённых LSC, например, CD34⁺CD38-CD90-CD45RA^+MIX+(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Результаты LSC при постановке диагноза сообщают о наблюдаемом проценте бластов CD45/SSC.
   3. Используйте LSC ≥ 1% от общего числа взрывов как порог плохого прогноза.
4. Продолжение MRD от LAIP/DfN
   1. Сообщите профиль LAIP, используемый для идентификации MRD, например, CD34⁺CD38^dim+CD13^+/-CD33⁺⁺CD117⁺CD7⁺.
   2. Сообщите о чувствительности анализа как о наименее чувствительном значении между техническим порогом и значением устойчивости, наблюдаемым для профиля LAIP по сравнению с эталонными образцами костного мозга.
   3. Используйте минимальный кластер из 50 клеток из полученных событий лейкоцитой в качестве предела количественной оценки. Например, при 500 000 клеток лейкоцитов, LOQ составляет 0,01% (1 × ^10-4).
   4. Сообщите результаты LAIP/DfN как положительные, отрицательные, обнаруживаемые, но ниже клинического порога или не обнаруживаемые.
   5. Положительный показатель LAIP/DfN составляет ≥ 0,1%, выраженный в проценте от общего числа лейкоцитов CD45⁺ .
   6. Сообщайте о негативе LAIP/DfN как < 0,1%.
   7. Для обнаруживаемых, но недостаточно пороговых результатов указывайте репрезентативное значение и порог чувствительности.
   8. Для необнаруживаемых результатов сообщите, что результат уступает порогу чувствительности анализа, и при необходимости добавьте комментарий, например, гемодилюцию, низкую специфичность LAIP или недостаточный технический порог.
5. Продолжение MRD от LSC
   1. Сообщите профиль, используемый для идентификации клеток, обогащённых LSC, например, CD34⁺CD38-CD90-CD45RA^+MIX+(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Используйте минимальный кластер из 20 ячеек среди полученных событий лейкоцитов в качестве предела количественной оценки. Например, при 1 000 000 ячейках лейкоцитов, LOQ составляет 0,002% (2 × ^10-5).
   3. Сообщайте результаты LSC как положительные, отрицательные, обнаруживаемые, но ниже клинического порога или не обнаруживаемые.
   4. Положительный показатель LSC составляет ≥ 0,01%, выраженный в проценте от общего числа лейкоцитов CD45⁺ .
   5. Отчёт о негативе LSC как < 0,01%.
   6. Для обнаруживаемых, но недостаточно пороговых результатов указывайте репрезентативное значение и порог чувствительности.
   7. Для невыявленных результатов сообщите, что результат уступает порогу чувствительности анализа, и при необходимости добавить комментарий, например, гемодилюцию, низкую специфичность LSC или недостаточный технический порог.
6. Интегрировать интерпретацию потока MRD с предыдущими точками времени мониторинга. Указывать на модуляцию фенотипического профиля во время лечения и динамику потока МРД, включая репозитив, увеличение, стабильность или снижение.
7. Пересылайте результаты запрашивающему клиницисту и исследователю, используя отчёт о клиническом потоке в соответствии с временными рамками лаборатории референтного потока.
8. Краткое изложение гармонизированного отчёта о клиническом потоке с использованием следующих пунктов: качество костного мозга, стратегия идентификации MRD, описание LAIP, LOD и LOQ, пороги и интерпретация как положительный MRD, MRD отрицательный со значением LOD или MRD, обнаруженный, но неизмеримый по MRD.

Результаты

Зеркалирование платформы

Для первоначального двухплатформного сравнения между CANTO и NAVIOS настройки напряжения корректировались путём получения некомпенсированных 8-пиковых радужных шариков для достижения заранее определённых целевых значений MFI. Целевые значения с эталонной платформы CANTO были перенесены на вторую платформу NAVIOS с помощью следующего преобразования: новая MFI target = эталонная MFI цель/256²². Для выявления смещения между платформами параллельно тестировали 10 новых образцов регенеративного костного мозга EDTA. Индекс окрашивания между положительными и отрицательными популяциями сравнивался между образцами и платформами и показал сопоставимую сепарацию (Дополнительный файл — рисунок S3).

В ходе исследования платформы постепенно модернизировались с 8- и 10-цветных конфигураций до LYRIC и DxFLEX 12- и 13-цветных (Дополнительный файл 1). Зеркальное изображение было расширено на четырёх платформах с использованием радужных бусин с 8 пиками и окрашенного здорового костного мозга, полученного той же панелью. Пиковое перекрытие проверялось путём корректировки только логарифмических шкал представления. После применения определённых настроек узоры окрашивания клеток перекрывались, при этом основное отличие заключалось в перемещении облаков клеток по логарифмическим шкалам (рисунок 6 и дополнительный файл — рисунок S4 и рисунок S5).

Оценка качества и воспроизводимость в лабораториях потоков

После внедрения первоначальной стандартной операционной процедуры и её обновлений во время модернизации платформы регулярно проводилась оценка качества «влажная внешность» (EQA) с использованием новых эталонных образцов костного мозга, переданных между участвующими центрами. Wet EQA использовался для проверки процедуры wet-lab, настроек платформы и общей стратегии гейтинг-анализа. В зарегистрированные популяции были обнаружены клетки MNC CD34⁺ в знаменателе WBC CD45⁺ и клетки P6 CD34⁺CD38⁻ в знаменателье WBC CD45⁺ . Результаты анализировались с помощью z-балла и/или графического представления (рисунок 7).

С 2017 года было проведено пять серьёзных этапов EQA, в которых участвовали соответственно 22, 15, 17, 26 и 25 лабораторий. Для клеток %CD34⁺CD38⁻ в клетках WBC CD45⁺ и %MNC CD34⁺ в WBC CD45⁺ результаты были следующими: EQA1, средние значения 0,015% и 1,01% (SD 0,09% и 0,24%); EQA2 — 0,09% и 1,02% (SD 0,046% и 0,36%); EQA3 — 0,097% и 1,46% (SD 0,024% и 0,32%); EQA4 — 0,024% и 2,16% (SD 0,015% и 0,59%); и EQA5 — 0,027% и 1,9% (SD 0,008% и 0,45%).

Для стандартизации стратегии MRD в разных центрах влажный EQA дополнялся сухим EQA с использованием общих файлов FCS для диагностики, наблюдения MRD и референсного костного мозга. Более 90% локально проанализированных данных были включены в централизованный интервал на основе серийного среднего ± 2 SD: 95,6% и 91,3% для DryEQA2017, 22 из 23 участвовавших лабораторий, и 100% для DryEQA2024, с 24 из 25 участвовавших лабораторий (рисунок 8). Два курса сухого EQA были проведены для %MRD LAIP у WBC CD45⁺ и %MRD LSC CD34⁺CD38⁻ при WBC CD45⁺. DryEQA2017 показал среднее значение LAIP 11,9% (SD 1,35%) и среднее значение LSC 0,16% (SD 0,05%). DryEQA2024 показал среднее значение MRD LAIP 0,35% (SD 0,26%) и среднее значение MRD LSC CD34⁺CD38⁻ 0,18% (SD 0,06%).

Пример мультимодального измерения потока AML MRD с использованием стратегий LAIP/DfN и LSC

Для количественной оценки MRD систематически использовались три подхода. Первый подход установил LAIP-картографию лейкемических бластов при диагностике с использованием булевого гейтинга, и эта картография применялась для последующих образцов костного мозга (рисунок 9A). Второй подход использовал анализ DfN для выявления аномальных клеток с атипичными паттернами экспрессии, не наблюдаемыми в областях «пустых коробок», определяемых при нормальной дифференцировки миелоидов (рисунок 9B). Третий подход количественно оценивал клетки, обогащённые LSC, в фракции CD34⁺CD38⁻ с использованием дихотомических LSC-маркеров и булевого гейтинга (рисунок 10).

Эталонные образцы костного мозга

Всего было изучено 135 образцов эталонных костного мозга, включая 25 здоровых образцов донорского костного мозга, 34 образца воспалительного костного мозга и 76 образцов регенерирующих костного мозга. Здоровый донорский костный мозг был получен от здоровых доноров с медианным возрастом 31 год и диапазоном от 21 до 49 лет. Воспалительный костный мозг был получен у пациентов, направленных на цитопения, включая анемию, нейтропения или тромбопению, при этом аспирации костного мозга не показывали гематологической злокачественности; Медианный возраст составлял 52 года, диапазон — 25–82 года. Регенерация костного мозга была получена во время контроля за ОМЛ в разные периоды химиотерапии, включая индукцию или консолидации, с отрицательной оценкой молекулярного MRD для транскриптов NPM1 или CBF; Медианный возраст составлял 54 года, диапазон — от 18 до 65 лет.

Качество этих образцов было подтверждено микроскопическим исследованием. Ожидаемый теоретический процент CD34⁺ клеток в неразбавленных образцах костного мозга также был рассчитан с использованием формулы Бруйманса, и результаты были >90% для всех образцов. Эти образцы использовались для установления порогов для анализа LAIP/DfN и LSC, а также для расчёта формулы гемодиллюции и чистоты. Вариация MFI экспрессии маркера в зависимости от состояния костного мозга изучалась для здоровых донорских, воспалительных и регенерирующих образцов костного мозга (Дополнительный файл — рисунок S6). Были определены эталонные значения для наиболее значимых параметров, включая %MNC CD34⁺ по лейкоцитам, %P6 CD34⁺CD38⁻ в MNC CD34⁺, %P7 CD34^{+CD38 dim} у MNC CD34⁺ и %P8 CD34⁺CD38^{высокого} в MNC CD34⁺ (дополнительный файл — рисунок S6).

Оценка чувствительности и линейности

Чувствительность для специфических для LAIP/DfN и LSC-специфических ворот оценивалась путём измерения количества аномальных событий в наборе эталонных образцов костного мозга, включая регенерирующий, воспалительные и здоровые донорские костный мозг. Для проверки предела количественной оценки и линейности измерения МРД использовалось серийное разбавление известного числа бластов в здоровом костном мозге (см. рисунок 11 и рисунок 12).

Рисунок 1: Стратегия гейтинга для анализа MRD LAIP в ОМЛ с использованием примитивных маркеров (CD34⁺/CD117⁺) в трубке 1. Первая строка: последовательная ограничение времени, живые клетки на основе FSC и SSC, отдельные клетки на основе FSC-W против FSC-H, КЛЕТКИ WBC CD45⁺ на CD45 против SSC, бласты на^{CD45 dim}/SSC, мононуклеарные клетки (MNC) на FSC-A/SSC-A, MNC CD34⁺ на графике CD45 против CD34 и примитивный маркер на графике CD34 против CD117. Вторая и третья строки: фиксированные бипараметрические точечные графики, используемые для определения наиболее релевантных LAIP-элементов (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP был определен с использованием следующей булевой стратегии: время И живые клетки, И отдельные клетки И (бласты ИЛИ MNC CD34⁺) И примитивные маркеры (CD34^+/−CD117^+/−), И LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7, LAIP8. В иллюстрированном случае MRD составлял 6,8% от WBC CD45⁺, по сравнению с 0,04% ± 0,03% в здоровом костном мозге. Справа: бэкгейтинг финального MRD-портала для количественной оценки, позволяющий очищать неспецифические события, эритробласты и мусор. Сокращения: ОМЛ = острый миелоидный лейкоз; MRD = измеримое остаточное заболевание; LAIP = иммунофенотип, ассоциированный лейкемией; FSC = прямое рассеяние; SSC = боковое рассеяние; лейкоциты = лейкоциты; MNC = мононуклеарные клетки; hBM = здоровый костный мозг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Стратегия гейтинга для анализа MRD LAIP в ОМЛ с использованием зрелых бластов (CD34⁻CD117⁻) в трубке 3. Первый ряд: последовательное ограничение времени, живые клетки на основе FSC против SSC, отдельные клетки по FSC-W против FSC-H, WBBC CD45⁺ клетки на CD45 против SSC, бласты на CD45^dim/SSC, мононуклеарные клетки (MNC) на FSC-A/SSC-A, MNC CD34⁺ на графике CD45 против CD34 и зрелый бласт-гейт на графике CD34 против CD117.
Вторая и третья строки: фиксированные бипараметрические точечные графики, используемые для определения наиболее релевантных LAIP-элементов (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP был определен с использованием следующей булевой стратегии: время И живые клетки, И отдельные клетки, И бласты И CD34⁻CD117⁻ бласты, И LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7, LAIP8. В иллюстрированном случае MRD составлял 15% от WBC CD45⁺, по сравнению с 0,09% ± 0,02 в здоровом костном мозге.
Справа: бэкгейтинг финального MRD-гейта для количественной оценки, позволяющий очищать неспецифические события. Сокращения: ОМЛ = острый миелоидный лейкоз; MRD = измеримое остаточное заболевание; LAIP = иммунофенотип, ассоциированный лейкемией; FSC = прямое рассеяние; SSC = боковое рассеяние; лейкоциты = лейкоциты; MNC = мононуклеарные клетки; hBM = здоровый костный мозг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Стратегия гейтинга для нормальных гемопоэтических стволовых клеток (nHSC) и клеток, обогащённых лейкемическими стволовыми клетками (LSC), в фракции CD34⁺CD38⁻ (пробирка 2). (A) нормальные гемопоэтические стволовые клетки (nHSC) и (B) клетки, обогащённые лейкемическими стволовыми клетками (LSC), в фракции CD34⁺CD38⁻ (пробирка 2). Первый ряд: последовательная ограничение времени, живые клетки на основе FSC против SSC, отдельные клетки на основе FSC-W против FSC-H, WBBC CD45⁺ клетки на CD45 против SSC, бласты на CD45dim/SSC, мононуклеарные клетки (MNC) на FSC-A/SSC-A и клетки MNC CD34⁺ на графике CD45 против CD34.
Со второй по четвертую строки: фиксированные бипараметрические точечные графики, используемые для определения P6 (CD34⁺CD38⁻), P7 (CD34⁺CD38^{минимум}) и P8 (CD34⁺CD38^{высокий}), а также наиболее релевантные дихотомические маркеры LSC, включая MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123 и CD45RA. MRD LSC определялся с использованием следующей булевой стратегии: время И живые клетки И отдельные клетки И бласты И MNC И MNC CD34+ И P6 И (P6 LSC ^MIX+ ИЛИ P6 LSC CD123⁺ ИЛИ P6 LSC CD45RA⁺).
Справа: обратный гейтинг финального ворота MRD LSC, используемый для количественной оценки, что позволяет очищать неспецифические события.
(A) nHSC в здоровом образце костного мозга: nHSC (фиолетовые события) были: CD34⁺CD38⁻, ^MIX− (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁻, CD123⁻, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ и CD90⁺. Доля nHSC CD34⁺CD38⁻ составляла 0,02% от WBC CD45⁺, а клетки LSC CD34⁺CD38⁻ были отрицательными. Зарегистрированные пороги анализа: LOQ 0,0001% и LOD 0,001%.
(B) Клетки, обогащённые LSC, в образце AML: обогащённые LSC клетки (оранжевые события) были CD34⁺CD38⁻, ^MIX+ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁺, CD123⁺, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ и CD90⁺. Доля LSC CD34⁺CD38⁻ составляла 3,7% от CD45⁺ лейкотов. Сокращения: nHSCs = нормальные гемопоэтические стволовые клетки; LSC = лейкемические стволовые клетки; MNC = мононуклеарные клетки; лейкоциты = лейкоциты; SSC = боковое рассеяние; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = антиген лейкоцитарного человека — DR; LOQ = предел количественной оценки; LOD = предел обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Определение порога CD38⁻ в популяции CD34⁺ с использованием канала CD38 флуоресценции минус один (FMO ). Первый ряд: гейтинг эталонных популяций, включая бласты на CD45/SSC, клетках MNC CD19⁺ и клетках MNC CD34⁺ .
Второй ряд: уровень сигнала в FMO канале CD38. Первая строка показывает бласт-клетки, вторая — клетки MNC CD19⁺ , а третья — клетки MNC CD34⁺ . Оранжевая линия указывает порог, определяющий элемент P6 CD34⁺CD38⁻ .
Третий ряд: уровень сигнала CD38 PE-Cy7. Первая строка показывает бласт-клетки, во второй строке — клетки MNC CD19⁺ с уровнем гематогона CD38, используемым для определения P8 CD34⁺CD38^{высокого}, а третья строка — MNC CD34⁺ клетки, при этом P6 CD34⁺CD38⁻ оранжевый, P7 CD34⁺CD38^— зелёные, P8 CD34⁺CD38^{— высокий} Ячейки в синих цветах. Сокращения: FMO = флуоресценция минус один; MNC = мононуклеарные клетки; SSC = боковое рассеяние; PE-Cy7 = фикоэритрин-цианин 7; P6 = CD34+CD38− доля; P7 = CD34+CD38 низкая фракция; P8 = CD34+CD38 высокая фракция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Оценка репрезентативности образца костного мозга на основе клеток MNC CD34⁺ . (A) Стратегия гейтинга для клеток MNC CD34⁺ и параметры, используемые для расчёта формулы: n, количество клеток MNC CD34⁺ ; L, количество клеток лейкоцитов CD45⁺ ; s, доля клеток MNC CD34⁺ в нормальной периферической крови; и m., доля клеток MNC CD34⁺ в референтном нормальном костном мозге. (B) Схематическое представление влияния разбавления костного мозга (BM) периферической кровью (PB) на происхождение CD34⁺ клеток в образцах BM. (C) Критерии, используемые для интерпретации чистоты BM. Сокращения: BM = костный мозг; PB = периферическая кровь; MNC = мононуклеарные клетки; Лейкоциты = лейкоциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Сравнение паттернов экспрессии на четырёх платформах потоковых цитометров.
Образец нормального костного мозга (BM) был одновременно протестирован на четырёх цитометрических платформах с использованием определённых настроек для каждой платформы и регулировки масштаба. В первой строке показаны ячейки MNC на точечном графике CD45/CD33; вторая строка показывает ячейки MNC на точечном графике примитивного маркера CD34/CD117; в третьей строке показаны ячейки взрыва на точечном графике CD34/CD38; а четвёртая строка показывает ячейки P6 CD34⁺CD38⁻ на точечном графике CD45RA/CD90. Сокращения: BM = костный мозг; MNC = мононуклеарные клетки; P6 = CD34⁺CD38⁻ доля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Воспроизводимость EQA в мокрой лаборатории в участвующих лабораториях потока. (A) Диаграмма скрипки, показывающая распределение клеток %P6 CD34⁺CD38⁻ в клетках WBC CD45⁺ по пяти раундам влажной лаборатории EQA и участвующих лабораториях потока. (B) Скрипичный график, показывающий распределение клеток %MNC CD34⁺ в клетках WBC CD45⁺ по пяти раундам влажной лаборатории EQA и участвующих лабораториях потока. Сокращения: EQA = внешняя оценка качества; P6 = CD34+CD38− доля; лейкоциты = лейкоциты; MNC = мононуклеарные ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8: Сухая оценка EQA измерения LAIP/DfN и LSC MRD. (A) Сухие EQA2017 упражнения для измерения LAIP/DfN и LSC MRD с использованием шести общих файлов FCS из 8-цветной панельной группы, включая диагностику AML, AML MRD и референсные файлы нормального костного мозга для анализа LSC по трубкам 1 и LSC по трубкам 1. Учение было проведено совместно с 23 участвующими лабораториями. (B) Сухие EQA2024 для измерения MRD LAIP/DfN и LSC с использованием шести общих файлов FCS из 12-цветной панельной группы, включая диагностику ОМЛ, ОМЛ МРД и эталонные файлы нормального костного мозга для анализа LAIP по трубам 1 и LSC по трубам 2. Упражнения были проведены совместно с 24 участвующими лабораториями. (C) Межплатформенное сравнение клеток %MNC CD34⁺ и %nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ клеток в клетках WBC CD45⁺ , измеренное во время влажного EQA2025, совместно с 25 участвующими лабораториями. Ожидаемые значения составили 1,6% для клеток MNC CD34⁺ и 0,02% для клеток nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ . Сокращения: EQA = внешняя оценка качества; LAIP = иммунофенотип, ассоциированный лейкемией; DfN = отличается от нормы; LSC = лейкемические стволовые клетки; MRD = измеримое остаточное заболевание; FCS = стандарт проточной цитометрии; ОМЛ = острый миелоидный лейкоз; MNC = мононуклеарные клетки; nHSC = нормальная гемопоэтическая стволовая клетка; Лейкоциты = лейкоциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 9: Репрезентативное измерение MRD с использованием подходов LAIP/DfN. (A) Пример измерения MRD с использованием метода LAIP/DfN. Слева показывает LAIP-картографию лейкемических клеток в диагностической образце, а справа — применение той же картографии LAIP к последующему образцу, при этом популяция MRD показана чёрным цветом. (B) Пример измерения MRD с использованием метода DfN. Каждая пара точечных диаграмм сравнивает здоровый костный мозг (hBM; нормальный, левый график) с последующим образцом костного мозга MRD (DfN, правый график). Область «пустой коробки» определяется на нормальном костном мозге, а наличие лейкемических клеток в этой пустой коробке оценивается в последующей выборке, при этом аномальная популяция показана чёрным цветом. Сокращения: MRD = измеримое остаточное заболевание; LAIP = иммунофенотип, ассоциированный лейкемией; DfN = отличается от нормы; hBM = здоровый костный мозг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 10: Репрезентативное измерение клеток, обогащённых CD34⁺CD38⁻ LSC, при диагностике и последующем наблюдении. (A) Пример измерения клеток, обогащённых LSC, в выборке диагностического ОМЛ. Слева страна показывает профиль, обогащённый LSC, при этом оранжевая популяция экспрессирует MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123, CD45RA, CD117, HLA-DR и CD36 внутри фракции CD34⁺CD38⁻ .
(B) Последующая проба от того же пациента, демонстрирующая персистентность клеток, обогащённых MRD LSC, с тем же иммунофенотипическим профилем (оранжевая популяция). Сокращения: LSC = лейкемическая стволовая клетка; ОМЛ = острый миелоидный лейкоз; MRD = измеримое остаточное заболевание; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = антиген лейкоцитов человека-DR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 11: Аналитическая чувствительность обнаружения LSC. (A) Оценка предела пустых (LOB) для обнаружения LSC. Слева сторона показывает количественную оценку событий CD34⁺CD38⁻ в слиянии пяти файлов FCS из пяти здоровых образцов костного мозга (получено 5 148 000 WBC). Справа показывает количество событий, принадлежащих булевым вратам LSC, захваченных на точечном графике CD45/SSC (14 событий), что соответствует LOB <0,0005% (5 × ^10-6). (B) Оценка линейности для количественной оценки LSC. Левая сторона демонстрирует серийное разбавление за спайк клеток, обогащённых LSC, в здоровом образце костного мозга. Справа показывает корреляцию между измеренными значениями MRD и теоретическими значениями, соответствующую пределу количественной оценки (LOQ) 2 × ^10-5 (0,002%). Сокращения: LSC = лейкемическая стволовая клетка; LOB = предел пустоты; FCS = стандарт проточной цитометрии; лейкоциты = лейкоциты; MRD = измеримое остаточное заболевание; LOQ = предел количественной оценки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 12: Линейность и количественный диапазон измерения MRD LAIP. (A) Оценка линейности для количественной оценки MRD LAIP путём последовательного разведения бластов с разными LAIP в здоровом костном мозге, показывающая корреляцию между измеренными значениями MRD и теоретическими значениями, с переменным LOQ в зависимости от различных LAIP и LOQ <0,1%. (B) Диапазон количественной оценки по различным LAIP. Красная линия указывает на клинический порог 0,1%. LOQ достиг клинического порога для всех протестированных LAIP. Сокращения: MRD = измеримое остаточное заболевание; LAIP = иммунофенотип, ассоциированный лейкемией; LOQ = предел количественной оценки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Флюоро Chrome	Пик	LYRIC12c	Пик	DxFlex13c	Пик	NAVIOS10c	Пик	CANTO8c
FITC	P8	44618	P6	89916	P7	104	P8	56316
Физкультура	P8	84008	P6	110652	P7	136	P8	88803
ECD	x	x	P6	153011	P7	150	x	x
PerCPcy5,5 /PEcy5,5	P7	63610	P6	101791	P7	85	P7	75717
PC7/PEcy7	P8	32412	P6	21381	P8	88	P8	32003
APC	P7	111628	P6	192708	P6	181	P7	143946
AA700/AP CR700	P7	25958	P6	237374	P7	182	x	x
A7A750/ APCH7	P8	77444	P6	158729	P7	150	P8	98311
BV421	P6	62031	P6	239208	P6	268	P6	68315
KO/V500	P7	159941	P6	293917	P6	179	P7	124919
BV605	P7	31688	P6	65337	x	x	x	x
BV711/ V660	P8	21816	P6	12107	x	x	x	x
BV786	P8	17560	P6	3795	x	x	x	x

Таблица 1: Целевые значения для каждой платформы с использованием 8-пиковых радужных бусин. Для каждой платформы цитометра показаны конкретные значения целей (Canto, Lyric, Navios, DxFlex). Удерживаемые пики были выбраны так, чтобы они находились близко к МФО, наблюдаемому для бластных ячеек. Это особенно важно для цитометров на базе PMT, где интенсивность сигнала не увеличивается линейно с ростом напряжения PMT. В отличие от этого, на цитометрах на базе APD интенсивность сигнала увеличивается линейно с усилением, что позволяет использовать один и тот же пик для всех детекторов, тогда как для каждого канала на PMT-основе требуется разные пики. Сокращения: MFI = медианная интенсивность флуоресценции; PMT = фотомультипликаторная трубка; APD = лавинный фотодиод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

КАНТО 8C /NAVIOS 8c

FITC

Физкультура

ECD

PerCPC y5,5

PECy7

APC

APC-R700 /AA700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Трубка 1 LAIP 8c

CD7 5μL /CD56 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

Трубка 2 LSC 8c

CD90 5μL

MIX3(2 0,5 мкл/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Supple mentaire Gran 8c

CD15 5μL

CD56 5μL

HLADR 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD11b 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Supplem entaire - Monos 8c

CD36 5μL

CD64 5μL

CD14 10μL

HLADR 5μL

CD34 5μL

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97 +TIM3+ CLL1

ЛИРИКА 10-12c

FITC

Физкультура

ECD

PerCPCy5,5

PECy7

APC

APC-R700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Трубка 1LAIP 12c

CD7 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5 мкл)

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD56 5μL

CD10 2μL

CD36 2μL

Трубка 2 LSC 12c

CD90 5μL

MIX3(2. 5 мкл/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5 мкл)

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD200 5μL

CD19 5μL

CD36 2μL

T3 Supple mentaire 12c-Монос

CD15 5μL

CD64 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5 мкл)

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD14 5μL

CD11b 5μL

CD36 2μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

NAVIOS 10c

FITC

Физкультура

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV711

BV786

T1 Navios 10c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T2 Navios 10c

CD90 5μL

MIX3(2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Supple mentaire 10c монос

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD11b 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

DxFLEX 10 -12/13c

FITC

Физкультура

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV650

BV786

T1 DxFLEX 12-13c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD36 5μL

CD10 2μL

/

T2 DxFLEX 12-13c

CD90 5μL

MIX3(2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

/

CD200 5μL

HLADR snv786 (3μL)

T3 Supple mentaire 12c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD64 5μL

CD11b 5μL

/

Таблица 2: Конфигурации панелей антител для анализа AML MRD LAIP/DfN и LSC. Таблица суммирует конфигурации панелей с 8, 10, 12 и 13 цветами в зависимости от платформы цитометра. Трубка 1 используется для анализа LAIP/DfN, трубка 2 — для анализа клеток, обогащённых CD34⁺CD38⁻ LSC, а трубка 3 — для маркеров моноцитарной/гранулоцитарной дифференцировки. Для каждой платформы показаны объёмы антител и назначение флюорохромов. MIX3 соответствует CD97, TIM3 и CLL1. Сокращения: ОМЛ = острый миелоидный лейкоз; MRD = измеримое остаточное заболевание; LAIP = иммунофенотип, ассоциированный лейкемией; DfN = отличается от нормы; LSC = лейкемические стволовые клетки; MIX3 = CD97/TIM3/CLL1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Полная потеря нормально выраженных маркеров на миелоидных предшественниках

CD13++CD33-/CD34+ или CD117+

CD13-CD33++/CD34+ или CD117+

CD13+HLADR-/CD34+

CD13+CD117+CD34-

Экспрессия лимфоидных маркеров по перекрестной линии на миелоидных предшественниках

CD7+CD13+/CD34+ или CD117+

CD7+CD33+/ CD34+ или CD117+

CD56+CD13+/ CD34+ или CD117+

CD56+CD33+/ CD34+ или CD117+

CD19+CD117+/ или CD13+ или CD33+

Гиперэкспрессия на миелоидных предшественниках

CD34++/CD117+

CD117++/CD13+CD33+

Снижение экспрессии миелоидных предшественников

CD38loCD34+CD33+CD117+

Таблица 3: Определения «пустого ящика» DfN на основе LAIP. В таблице перечислены заранее определённые «пустые ячейки» с разными от нормы (DfN) паттерны, используемые для идентификации аномальных популяций предшественников миелоидных предшественников. Категории включают полную потерю нормально экспрессируемых маркеров, экспрессию лимфоидных маркеров на перекрестной линии, гиперэкспрессию маркеров и снижение экспрессии маркеров на миелоидных предшественниках. Сокращения: LAIP = иммунофенотип, ассоциированный лейкемией; DfN = отличается от нормы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Holdrinet и др.17
Broolmans и др.15
Чистота костного мозга = (1 − (GRMO/GR SG) x (GBSG/GB MO)) x 100	>80%
Björlund et al.19	GPA > 15%
	CD3 < 20%
Локен и др.18	Максимум CD16< 30%
Theunissen и др.20; Дворзак и др.21
Цитологический поток или Ctr DIL: PNN < 40%, Ebl > 5%, Ly < 20%	CD16++ CD11b++ < 40%
	GPA > 5%
	CD3 < 20%
Процент чистоты BM: MNC 34+/WBC45+	Чистота BM 100-10%

Таблица 4: Методы контроля разбавления костного мозга для отчётности по потоку МРД по ОМЛ. Таблица обобщает опубликованные методы разведения костного мозга и контроля репрезентативности, которые могут использоваться для клинических отчётов по потоку ОМЛ MRD. Для поддержки интерпретации результатов MRD следует применять как минимум один метод разбавления-контроля. Метод чистоты костного мозга CD34/WBC45⁺ включен в качестве дополнительной оценки качества. Сокращения: ОМЛ = острый миелоидный лейкоз; MRD = измеримое остаточное заболевание; BM = костный мозг; лейкоциты = лейкоциты; CD34/WBC45⁺ = CD34⁺ клетки среди лейкоцитов CD45⁺ . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Дополнительная информация, гармонизация платформы, эталонный костный мозг и прогностические материалы. Этот дополнительный файл содержит подтверждающие данные и таблицы, связанные с идентификацией LSC, фенотипической гетерогенностью ОМЛ, межплатформенным зеркалированием, платформенно-специфической оптимизацией, профилями экспрессии маркеров костного мозга, эволюцией продольных панелей и прогностическим порогом, используемым для количественной оценки LSC при диагностике. Эти материалы предоставляют дополнительный контекст для многоцентрового процесса проточной цитометрии MRD, включая обоснование оценки клеток, обогащённых CD34⁺CD38⁻ LSC, техническую основу гармонизации платформы и поддерживающие данные, используемые для интерпретации эталонного происхождения костного мозга, миграции панелей и клинического выбора порога. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Критические шаги в протоколе

Качество выборок имеет решающее значение для точной количественной оценки MRD и LSC. Свежие образцы костного мозга должны транспортироваться при комнатной температуре и обрабатываться в течение 24–48 часов, а при необходимости — в течение 72 часов после сбора²³ часа. Гемодилюция должна оцениваться в каждый момент времени и включаться в отчёт о клиническом потоке. Врач должен указать время лечения, например, после индукции, консолидации, таргетной иммунотерапии, менее интенсивного лечения, такого как азацитидин/венетоклакс, или аллотранспланта. Ландшафт дифференциации тесно связан с лечением и временной точкой и важно интегрировать в интерпретацию МРД. Во время продольного наблюдения необходимо поддерживать ту же чувствительность прибора и надёжность анализа путём регулярных проверок целевых значений с помощью радужных контрольных шариков, регулярного EQA и коллегиального обзора файлов FCS на протяжении всего исследования.

Высокий уровень стандартизации и межцентровой надёжности количественной оценки потока MRD поддерживается благодаря регулярному веб-обучению в группе потоков. Проводилась как минимум одна веб-сессия в месяц, и более 100 случаев MRD LAIP/DfN, MRD LSC или диагностической количественной оценки LSC были рассмотрены и рассмотрены за эти годы. Это непрерывное обучение важно, поскольку для интерпретации данных о потоках требуется высококвалифицированный биолог, особенно для низкоуровневого МРД, физиологических фоновых популяций, регенерирующих костного мозга и фенотипических переключатель, находящихся в лечении.

Количественная оценка популяций, обогащённых CD34⁺CD38⁻ LSC, — ещё один важный этап. Универсального маркера для захвата нормальных гемопоэтических стволовых клеток или LSC не существует. Группа HOVON ввела мониторинг LSC в диагностике и последующем нагляде по ОМЛ с использованием 8-цветной панели, включающей набор соответствующих «дихотомических» маркеров^{LSC 3}. Дихотомические маркеры определяются как проявляющие отсутствие экспрессии в нормальных гемопоэтических стволовых клетках, но положительные в популяциях, обогащённых LSC, с тусклостью, промежуточной, высокой, гетерогенной или бимодальной формой. Существует интерес к включению смеси специфических дихотомических маркеров LSC, таких как CLL1, TIM3 и CD97, в одном канале, поскольку при положительном результате только один клетки всё равно можно обнаружить. Другие маркеры следует использовать отдельно в отдельных каналах, поскольку их экспрессия может пересекаться с экспрессией нормальных гемопоэтических стволовых клеток, в зависимости от состояния костного мозга, включая регенерирующий или напряжённый^{костный мозг 24}. Полное определение клеток, обогащённых LSC, основано на булевых операторах, включая аномальную экспрессию маркеров в фракции CD34⁺CD38⁻ . Поскольку это остаётся фенотипическим определением, популяцию следует интерпретировать как клетки, обогащённые CD34⁺CD38⁻ LSC, а не как функционально доказанные LSC в каждом образце. Этот панель LSC также применим к пациентам с МДС с избытком бластов и ОМЛ МРК по тому же протоколу.

Модификации и устранение неисправностей метода

В процессе эволюции платформы и панелей подход к стандартизации/гармонизации должен сохраняться внутри лабораторной сети, особенно при переходе от 8-10-цветных панелей к панелям с 12-13 цветами. С развитием машин необходимо сохранять общий хребет антител и одинаковую чувствительность к выявлению фенотипических аномалий на протяжении всего клинического исследования. В процессе эволюции платформы флуорохромы антител в магистрали остаются стабильными и общими для всех аппаратов (CD34/CD38/CD45/CD117). Однако для некоторых каналов необходима замена фторхромов из-за машинно-специфического оптического банка, что требует гармонизационного подхода. При переходе с PMT-детекторного цитометра на APD-детекторный цитометр необходимо учитывать высокую чувствительность APD-детекторов на высоких длинах волн. Поэтому в некоторых случаях выбор фторхромов для определённых антител необходимо корректировать для сохранения одного и того же индекса окрашивания и предотвращения чрезмерного распространения между каналами, тем самым применяя оптимизационный подход. Современные клинические цитометры поддерживают панели с 12–13 цветами, что повышает специфичность обнаружения LAIP и улучшает интерпретацию за счёт добавления маркеров, которые устраняют загрязняющие клетки в MRD. Однако это также усложняет анализ²³.

Переход с 8-цветных до 12-цветных панелей повысил чувствительность и специфичность оценки MRD в некоторых случаях (Дополнительный файл 1). В трубке 1 были добавлены HLA-DR, CD36, CD10 и CD56, отделённые от CD7. В трубке 2 были добавлены HLA-DR, CD36, CD200 и CD19. В трубке 3 были добавлены CD4, CD64, CD38, CD36 и CD14. HLA-DR, теперь систематически комбинированный с CD38 в каждой пробирке, даёт более чёткое определение LAIP и изменённых паттернов дифференцировки. CD36, теперь систематически включённый в каждую трубку, является ключевым маркером для идентификации эритробластов, эритроцитов, тромбоцитов и обломков, а также для уточнения конечного ворота MRD. CD19 в трубке LSC также помогает идентифицировать гематогены. Комбинирование маркеров дифференцировки моноцитов и гранулоцитов в одной трубке позволяет лучше различать паттерны дифференцировки моноцитарных и гранулоцитарных и помогает различать аберранции для выявления LAIP. При переходе от 8-цветных к 10-цветным панелям основное улучшение произошло при обнаружении LAIP, особенно с добавлением HLA-DR и CD56, отделённых от CD7 в трубке 1 и HLA-DR и CD19 в трубке 2. При переходе от 10-цветных к 12-цветных панелей улучшение произошло за счёт лучшей очистки вентилей blast и LSC с добавлением CD36 в каждую трубку, что завершилось CD10 в трубке 1 и CD200 в трубке 2. Это было особенно полезно для пациентов с низким уровнем MRD выше предела обнаружения, но ниже предела количественной оценки. В совокупности большинство пациентов с положительной МРД на клиническом пороге ≥ 0,1% уже были идентифицированы с 8-цветной панелью; однако использование большего количества маркеров в пробирках улучшило специфичность и интерпретацию оценки MRD, особенно для низкоуровневых MRD, как указано в рекомендациях ELN 2025.

Ограничения метода

Выбор многоцентрового подхода может быть сложным. Реализуемость этой концепции требует обязательных шагов перед внедрением потока MRD в клинических испытаниях ОМЛ: гармонизации чувствительности приборов и подготовки образцов, а также обучения и систематического образования аналитических^{операторов 25}. По мере развития платформ многоцентровая многоплатформенная стратегия должна быть адаптирована для сохранения надёжности и воспроизводимости результатов. Это включает стандартизацию, использование одной панели и настроек для одного и того же типа платформы; гармонизация — использование одной панели на нескольких платформах с гармонизированными настройками; и оптимизацию с использованием панели и специфических настроек, адаптированных к каждой платформе.

Гемодилюция — один из самых сложных и критически важных моментов для количественной оценки потока MRD. Формула репрезентативности CD34/WBC, описанная в данном протоколе, должна использоваться как комплементарная мера контроля качества образца костного мозга и не должна применяться для нормализации результатов МРД. Его интерпретация может зависеть от регенерации костного мозга, эффектов лечения, остаточных заболеваний и менее интенсивных режимов. Аналогично, маркеры, такие как CD56, CD123 и CD45RA, не следует интерпретировать как самостоятельные маркеры DfN или LSC. Их следует интерпретировать в рамках полной стратегии гейтинга, ворот очистки, справочного фона костного мозга и клинического контекста.

Значение метода по отношению к существующим или альтернативным методам

Согласно рекомендациям ELN 2025, MRD является основным прогностическим маркером для пациентов с ОМЛ, независимо от техники или времени обследования. Использование различных методов и маркеров потока MRD значительно дополняет друг друга. Мультимодальный MRD, включая анализ LAIP/DfN и LSC, полезен при условии, что анализ проводится в стандартизированной сети с гармонизированной отчетностью результатов. Оценка МРД позволяет лучше определить терапевтический ответ и рецидив. Многоцентровый и мультимодальный поток MRD вместе с молекулярным MRD сыграет стратегическую роль в будущих клинических испытаниях в всё более сложном терапевтическом ландшафте, включающем новые таргетные терапии, методы первого и второго этапа, аллогенную трансплантацию и терапии низкой интенсивности.

Значение и потенциальные применения метода в конкретных областях исследований

Группы HOVON и ALFA сообщили, что количественная оценка популяций, обогащённых CD34⁺CD38⁻ LSC, при диагностике ОМЛ оказывает клиническое влияние (Дополнительный файл 1). Крайне важно определить клинически значимые пороги для LSC на основе метода количественной оценки. Как ранее сообщалось с использованием описанного здесь метода, порог LSC ≥1% был связан с неблагоприятным исходом (Дополнительный файл 1)²⁶. В лечении ОМЛ дифференцированная интеграция MRD, мониторинг LSC и клональный гемопоэз могут помочь усовершенствовать терапевтическую интерпретацию. Основная сложность заключается в отличии MRD, который может потребовать дополнительного лечения, от стабильных прелейкемических клонов, которые могут не^{быть 27}. Интегрированная система отчетности для расчёта процента взрывов недавно была рекомендована для последующего наблюдения по ОМЛ в рекомендациях^{EHA/ELN 28} 2025 года. Он интегрирует результаты MRD с морфологическим сравнением для гармонизированной оценки бластов и должен способствовать согласованному отчёту в клинических исследованиях для определения категорий ответов у пациентов с ОМЛ.

И исследование HOVON, и ALFA/FILO BIG1 показывают, что балл, сочетающий подходы LAIP/DfN и LSC, позволил классифицировать пациентов на четыре группы: ^LAIP−/LSC⁻, ^LAIP+/LSC⁻, ^LAIP−/^LSC+ и ^LAIP+/^LSC+, с разными трехлетними общими показателями^{выживаемости 3,26,29}. В целом, эти результаты иллюстрируют прогностический клинический эффект комбинированного статуса MRD LAIP/DfN и LSC. В контексте аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток наличие клеток, обогащённых CD34⁺CD38⁻ LSC, также считается предиктором послетрансплантационной неудачи, даже если общее количество бластов составляет менее 5%³⁰. Эти клинические данные подтверждают актуальность комбинированных стратегий потока MRD, но текущий протокол сосредоточен на стандартизации технического рабочего процесса и отчетности между центрами.

В качестве перспективы технология спектрального потока может расширить панель маркеров, тестируемых одновременно в многомерном подходе проточной цитометрии, тем самым повышая специфичность контролируемых LAIP и снижая биологический фоновой шум при гемопоэтической регенерации. Оценка воспроизводимости спектральных потоков на разных платформах, панелях и центрах, как предложено здесь, будет сложной для клинической реализации. Новые алгоритмы неконтролируемого анализа, включая FlowSOM, t-SNE и UMAP, могут облегчать различение нормального гемопоэза от лейкемического компартмента — от фракции, обогащённой CD34⁺CD38⁻ LSC, до объёма бластной нагрузки. Более глубокое изучение фракций LSC может помочь улучшить мониторинг пришивки в моделях ксенотрансплантата, полученных от^{пациентов, 31,32}. Были созданы рабочие группы ELN для проверки и гармонизации этих новых^{подходов 33,34}.

Материалы

```html

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Antibodies (CANTO 8C-LYRIC12C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7	FITC	BD Bioscience	332773
CD13	PE	BD Bioscience	347406
CD33	PerCPCy5,5	BD Bioscience	333146
CD117	BV421	BD Bioscience	563856
CD38	PeCy7	BD Bioscience	335825
CD34	APC	BD Bioscience	345804
CD45RA	APCH7	BD Pharmingen	560674
CD19	APCH7	BD Bioscience	641395
CD45	V500	BD Bioscience	560777
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PerCPcy5.5	BD Pharmingen	558714
CD15	FITC	BD Bioscience	332778
CD64	PE	BD Pharmingen	558592
CD11b	BV711	BD Bioscience	740771
CD4	APCH7	BD Bioscience	641398
HLADR	APC-R700	BD Horizon	565127
CD56	BV605	BD Horizon	562780
CD14	BV605	BD Horizon	564054
CD200	BV605	BD Biosciences	562853
CD10	BV711	BD Biosciences	740770
CD36	BV786	BD Biosciences	745554
CD19	BV711	BD Biosciences	563036
Antibodies (NAVIOS 10C/DxFlex 12C/13C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7 FITC	FITC	BC iotest	A07755
CD13	PE	BC iotest	A07762
CD33	PC5.5	BC iotest	B36289
CD117	SNV428	BC iotest	C76813
CD38	PEcy7	BDBioscience	335825
CD34	APC	BC iotest	IM2472
CD45RA	APCH7	BDBioscience	560674
CD19	AA750	BC iotest	A94681
CD45	KromeOrange	BC iotest	B36294
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PC5.5	BC iotest	B20022
HLADR	ECD	BC iotest	B92438
CD36	AA700	BC iotest	B46022
CD19	ECD	BC iotest	A07770
CD4	PE	BC iotest	A07751
CD11b	BV650	Bdhorizon	569704
CD14	AA750	BC iotest	B92421
HLADR	SNV786	BC iotest	C78087
CD56	AA700	BC iotest	B92446
CD64	BV605	Bdoptibuild	569172
CD36	BV605	BD Horizon	563518
CD10	BV650	Bdoptibuild	745390
CD15	FITC	BD	332778
CD200	BV650	Bdoptibuild	743085
BD FACSCanto II  (8-color, blue/red/violet)		BD Bioscience	338962
BD FACSLyric 3-Laser 12-Color Instrument		BD Bioscience	662383
BC NAVIOSNavios 10 Colors, 3 Lasers, B5-R3-V2 Configuration		Beckman Coulter	B47905
BC DxFLEX  13-Colors, 13 Detectors, 3 Laser,  B5-R3-V5		Beckman Coulter	C78505
BC Kaluza Software v 3.1		Bekman Coulter	A82959
BD FACSuite Software v1.6		BD  Bioscience	651360
BD FACSDiva software v 8.0.3 (Win 7 32 bit OS)		BD  Bioscience	659523
BD CST Beads		BD  Bioscience	656505
Multicolor COMPBEADS		BD  Bioscience	552843
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks), 3.0 - 3.4 µm		BD  Bioscience	559123
ClearL Lab Compensation Beads		Beckman Coulter	B99883
PharmLyse NH4Cl 100ml10x conc		BD  Bioscience	555899
DPBS, 1X		CORNING	21-031-CV
Brillant Stain Buffer Plus		BD  Bioscience	566385
MGG (May-Grünwald-Giemsa)		Sigma Aldrich	1014242500

```