Двухфотонная визуализация метаболизма эндотелиального мозга NAD+ у мышей в реальном времени

Краткое содержание

Этот протокол позволяет в реальном времени отслеживать метаболизм эндотелиального никотинамида адениндинклеотида в мозге у живых мышей с помощью экспрессии эндотелиального биосенсора, подготовки окна к черепу и двухфотонной визуализации.

Аннотация

Мы представляем воспроизводимый рабочий процесс для визуализации в реальном времени биосенсорных ответов никотинамида адениндинуклеотида (NAD⁺) в микроваскулярных эндотелиальных клетках мозга у живых мышей с использованием двухфотонной микроскопии с краниальным окном и эндотелиально-ориентированного флуоресцентного сенсора ^NAD+. Протокол включает (1) селективную экспрессию ^{сенсора} NAD+, опосредованную аденоассоциированным вирусом (AAV), в цереброваскулярном эндотелии с использованием AAV-X1.1 под промотором Cdh5 (сосудистый эндотелиальный кадгерин), (2) хирургическую подготовку стабильного окна коры коры диаметром 3 мм × 3 мм, а также (3) двухфотонную визуализацию с двойной длиной волны для одновременного захвата зелёного сигнала сенсорного канала с частотой 920 нм и внутрисосудистого тетраметилродамина (TMR)–декстран с частотой 1040 нм Референсный канал. Канал TMR–декстран обеспечивает опорный просвет сосудов и поддерживает отбор сосудов, оценку движения и оценку целостности сосудов. В качестве примера применения мы описываем изменения в эндотелиальной флуоресценции сенсорного канала, связанные с никотинамидом мононуклеотидом после подачи воды в питьевую воду, в рот или внутривенно. Этот протокол акцентирует внимание на критических шагах, рекомендуемом дозировке вируса и титрах, устранении неполадок, а также количественных стратегиях, что позволяет лабораториям реализовывать in vivo мониторинг динамики биосенсорного канала цереброваскулярного NAD⁺ для изучения нейрометаболизма в здоровье и заболеваниях. 

Введение

Никотинамид-адениндинуклеотид (NAD⁺) является центральным кофактором для редокс-баланса, активности митохондрий, восстановления ДНК и сигнализации, чувствительной к стрессу. В церебральной сосудистой системе гомеостаз эндотелиального NAD⁺ всё чаще признаётся активным регулятором целостности барьера, сосудистого тонуса и нейроваскулярной связи, а не пассивным метаболическим^{показателем 1}. Нарушение эндотелиального метаболизма NAD⁺ связано с утечкой гематоэнцефалического барьера (BBB), связанной с возрастом, и нарушением нейроваскулярного гомеостаза, что подчёркивает необходимость методов, способных напрямую разрешать эндотелиальную метаболическую динамику в живой ткани^{мозга 2}.

Большинство современных методов для количественной оценки ^NAD+ основаны на биохимических измерениях конечных точек, окрашивании фиксированных тканей или экс-виво показаниях датчиков. Хотя эти подходы информативны, они не сохраняют целостную микроваскулярную архитектуру, не позволяют легко различать быстрые изменения внутри животных со временем и обеспечивают ограниченную специфичность клеточного типа при применении к гетерогенной ткани мозга. В отличие от этого, хроническая двухфотонная визуализация с краниальными окнами позволяет многократно визуализировать корковые микрососуды у живых мышей с высоким пространственным и временным разрешением, что делает его отличным для мониторинга метаболически отзывчивых эндотелиальных сигналов при определённых физиологических или фармакологических^{вмешательствах 3,4,5}.

Общая цель этого протокола — обеспечить сквозный рабочий процесс для мониторинга динамики эндотелиального NAD⁺ в организме в реальном времени. Метод сочетает в себе системную доставку сенсора NAD+, ориентированного на эндотелииал, усиленного зелёного флуоресцентного белка (eGFP), упакованного в адено-ассоциированный вирус (AAV)-X1.1 и управляемый промотором Cdh5, стабильным окном черепа диаметром 3 мм × 3 мм для оптического^{доступа 6,7,8}, а также двухволновое двухфотонное изображение с помощью внутрисосудистого тетраметилродамина (TMR)–декстранного эталонного^{канала 1}. Механизм сенсора был уточнён следующим образом: Cambronne и др. Цитоплазматический биосенсор LigA-cpVenus NAD⁺ — это сенсор с обратной реакцией на основе cpVenus. Связывание NAD⁺ снижает флуоресценцию, подобную cpVenus/eGFP, в стандартном показании возбуждения 488 нм, тогда как канал возбуждения 405 нм служит эталоном для рациометрической нормализации. Поэтому чистая зелёная флуоресценция не должна интерпретироваться как прямая положительная мера концентрации NAD⁺. В этой двухфотонной реализации для получения сигнала зелёного сенсорного канала используется возбуждение 920 нм, тогда как 1040 нм — для сосудистого эталонного канала TMR–декстран; Таким образом, нынешнее измерение 920/1040 нм не эквивалентно калиброванному измерению в 488/405 нм. Биосенсор Cambronne и соавторов был выбран потому, что он прошёл тщательную проверку для мониторинга внутриклеточной динамики NAD⁺ и совместим с текущей конфигурацией изображения с двойной длиной волны. Хотя более новые индикаторы, такие как FiNad, предлагают альтернативные подходы для мониторинга динамики NAD⁺, их реализация потребует модификации красного флуоресцентного канала, который сейчас используется для маркировки сосудов TMR–декстран. Датчик Cambronne сообщает о относительных изменениях доступности NAD⁺ в конечном динамическом диапазоне и был валидирован в клеточных и субклеточных приложениях; однако интерпретация сигнала может зависеть от уровня экспрессии, pH, фотоотбеливания и вариабельности оптического пути, а для абсолютной квантовой оценки NAD⁺ требуется калибровка или ортогональная биохимическая валидация. AAV-X1.1 был выбран потому, что эндотелиально-тропические варианты AAV эффективно трансдуцируют сосудистую систему^{центральной нервной системы 6,7}. В нашем предварительном сравнении нескольких серотипов AAV, включая AAV9, AAV-BR1, AAV-ENT и AAV-X1.1, используя улучшенную экспрессию зелёного флуоресцентного белка, управляемого CAG или Cdh5 в качестве репортёра, AAV-X1.1 показал наиболее благоприятный сосудистый образец экспрессии среди протестированных серотипов. Промотор Cdh5 впоследствии использовался для дальнейшего ограничения экспрессии трансгена в сосудистых эндотелиальных клетках, что соответствует предыдущим отчетам, показывающим эндотелиально-селективную экспрессию трансгена in vivo⁶.

По сравнению с экс-виво NAD⁺ анализами, этот подход сохраняет целостную сосудистую сеть, позволяет проводить продольные измерения у того же животного и позволяет одновременно оценивать эндотелиальные метаболические сигналы и использовать сосудистый просвет. Этот рабочий процесс особенно полезен для изучения старения, воспалительного стресса, дисфункции BBB и быстрой реакции на метаболические вмешательства, такие как введение никотинамида мононуклеотида (^NMN) 9,10,11,12,13. Этот метод наиболее уместен, когда экспериментальный вопрос требует повторной визуализации корковых микрососудов у живых мышей и относительных изменений сигнала эндотелиального сенсорного канала. Он менее подходит для абсолютного количественного определения NAD⁺ без дополнительной рациометрической калибровки или биохимической валидации. Практические ограничения включают оптическую доступность коры, ограничения по глубине изображения, зависимость от успешной эндотелиальной трансдукции AAV, возможное воспаление, связанное с краниальными окнами, и необходимость двухфотонного микроскопа с двойной длиной волны. Хроническая имплантация в краниальное окно может вызывать локальное воспаление, сосудистую реактивность, глиоз, непрозрачность или ремоделирование тканей, что может влиять на физиологию эндотелия и измерения сенсорного^{канала 1,3,4}. Для минимизации этих факторов протокол требует асептической хирургии, прерывистого сверления с частым охлаждением, аккуратного гемостаза, избегания контакта адгезивом с твердой орудостью, послеоперационной анальгезии, ежедневного мониторинга и исключения животных с устойчивой непрозрачностью, воспалительными остатками, инфекцией, нестабильной сосудистой морфологией или плохой базовой стабильностью сигнала.

Протокол

Все процедуры были одобрены Комитетом по этике животных Университета наук о здоровье и реабилитации в рамках проекта «Механистическое исследование метаболического зондового наблюдения целостности гематоэнцефалического барьера» (номер одобрения KFDX: NO. 2023-1023). Выполнять все операции в асептических условиях и обеспечивать периоперационную анальгезию и поддерживающий уход согласно утверждённому протоколу для животных. В репрезентативном процессе вводите бупренорфингидрохлорид (0,05–0,1 мг/кг, подкожно) до или сразу после операции, а затем каждые 8–12 часов в течение 24–48 часов по необходимости. Восстанавливайте мышей в подогретой клетке и наблюдайте за ними до восстановления нормальной осанки, спонтанных движений и стабильного дыхания.

1. Обзор экспериментов

1. Для репрезентативных экспериментов используйте взрослых мышей C57BL/6J возрастом 10–12 недель и весом 23–25 г.
2. Содержать мышей в условиях, свободных от патогенов, с 12-часовым циклом свет/тьма, температурой окружающей среды 22°C до 24°C, относительной влажностью 40%–60% и импровизованным доступом к пище и воде.
3. Акклиматизируйте животных не менее 7 дней перед процедурами.
4. Используйте любой пол в соответствии с экспериментальным дизайном. Указывайте пол, количество животных и распределение групп для каждого эксперимента. Репрезентативный набор данных для визуализации, приведённый здесь, использовал мышей N = 3.
5. Сначала введите системный AAV и дайте экспрессию в течение 3–4 недель перед проведением визуализации.
6. Проведите операцию на краниальном окне за 3–5 дней до проведения визуализации.
7. Анестезируйте мышей в день обследования, внутривенно вводите TMR–декстран и проводите визуализацию после достаточного кровообращения трассеров.
8. Проводите NMN в соответствии с выбранным графиком вмешательств. Назначьте добавки питьевой воды в течение 5 дней до проведения визуализации, выполняйте оральную гаважу в заранее определённый интервал перед визуализацией или вводите внутривенное NMN во время сеанса визуализации после базового снятия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приостановите протокол после введения AAV в течение 3–4 недель экспрессии и поддерживайте животных в режиме регулярного мониторинга здоровья и стандартных условий содержания. Приостановите протокол после операции с окном на черепе в течение 3–5 дней восстановления. Перед проведением визуализации убедите стабильный вес тела, нормальный уход и активность, отсутствие инфекций или сильного воспаления, а также чистое окно черепа.

2. Операция с окном мозга для продольной кортикальной визуализации

1. Предоперационная подготовка
   1. Стерилизуйте все хирургические инструменты и создайте стерильное поле перед введением анестезии.
   2. Настройте гомеотермическую систему нагрева так, чтобы температура тела поддерживалась на уровне 36,5–37,5°C, желательно с помощью контроллера обратной связи ректального зонда.
   3. Подготовьте оборудование для мониторинга дыхательных аппаратов и подтвердите стабильную операцию перед операцией.
   4. Перед началом процедуры подготовьте стерильный физиологический раствор, впитывающие мазки, гемостатические материалы, стерильный стеклянный слой No1.5, металлическую наголовную пластину и зубной цемент.
   5. Используйте стерильный стеклянный накладной слой No1.5, размером с полностью закрытие окна диаметром 3 мм × 3 мм и прилегающий к краниальному ободу черепа.
   6. Подготовьте высокоскоростную микродрель с заусенником диаметром 0,5–1,0 мм.
   7. Работайте с буром примерно на половине максимальной скорости и убедитесь, что стерильное физиологическое орошение можно немедленно применить во время истончения черепа.
   8. Во время сверления наносите стерильный физиологический раствор комнатной температуры ватной палочкой или пипеткой, чтобы охладить череп и удалить костную пыль.
2. Анестезия, подготовка кожи головы и экспозиция черепа
   1. Анестезиируйте мышей свежеприготовленным рабочим раствором Авертина (1,25%, 12,5 мг/мл) путём инъекции внутрибрюшинного препарата в дозе 200–250 мг/кг.
      1. Подготовьте рабочий раствор Avertin из 2,2,2-триброметанола и 2-метил-2-бутанола в соответствии с институциональными стандартными процедурами, защитите раствор от света и убрать препараты с осадками или изменением цвета.
   2. Подтвердите стабильную хирургическую плоскость потерей рефлекса отъёма педалей и стабильного дыхания.
   3. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза сразу после введения анестезии.
   4. Если используется ингаляционная анестезия, индуцировать анестезию с помощью 3%–4% изофлурана.
   5. Поддерживайте анестезию с 1%–2% изофлурана в кислороде при 0,5–1,0 л/мин и корректируйте в зависимости от дыхания и рефлексов.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с анестетиками в соответствии с институциональными процедурами безопасности и используйте соответствующие системы удаления при введении ингаляционной анестезии.
   6. Закрепите мышь в стереотаксичной рамке или индивидуальном держателе для головы, который обеспечивает стабильный доступ к спинному черепу.
   7. Поддерживайте температуру тела на уровне 36,5–37,5°C с помощью грелки с обратной связью и ректального зонда, когда она доступна.
   8. Побрейте кожу головы и удалите выпавшие волосы с хирургического поля.
   9. Дезинфицируйте кожу головы с помощью чередующего раствора повидона-йода или йодофора и 70% этанола в течение трёх циклов.
   10. Избегайте попадания дезинфицирующего средства в глаза или в отверстие черепа.
   11. Сделайте разрез по средней линии кожи головы и аккуратно отступите кожу.
   12. Достаточно обнажить череп, чтобы можно было создать как окно черепа, так и фиксировать наголовье.
   13. Удалите надкосность и остатки соединительной ткани с помощью тонких щипцов или лезвия скальпеля.
   14. Аккуратно высушите череп стерильными ватными палочками примерно 10–20 секунд, пока поверхность не станет матовой, а не влажной.
   15. Избегайте чрезмерного обезвоживания открытых тканей.
3. Маркировка краниотомии 3 мм × 3 мм
   1. Определите брегму и лямбду под хирургическим микроскопом.
   2. Используйте эти анатомические ориентиры для ориентации средней линии и целевого коркового участка.
   3. Отметьте квадрат 3 мм × 3 мм над одним полушарием дорсальной соматосенсорной коры.
   4. Расположите передний край примерно на 0,5 мм позади bregma и медиальный край примерно на 1,0 мм латерально от средней линии.
   5. Избегайте крупных швов на черепе и крупных поверхностных сосудов, когда это возможно.
4. Сверление и удаление костяного лоскута
   1. Протяните череп вдоль отмеченного периметра, используя прерывистый контакт сверлом вместо постоянного давления.
   2. Во время сверления многократно наносите стерильный физиологический раствор, чтобы предотвратить термические повреждения.
   3. Вводите примерно 20–50 мкл стерильного физиологического раствора за одно нанесение или достаточно, чтобы поверхность черепа оставалась влажной и прохладной.
   4. Повторяйте орошение каждые 10–20 секунд или при накоплении костной пыли или подозрении на нагрев.
   5. Продолжайте истончать, пока кость не станет равномерно прозрачной и слегка гибкой.
   6. Подтвердите достаточное истончение, наблюдая видимые дуральные сосуды, сохранение пульсации и отсутствие корковой компрессии или термического обесцвечивания.
   7. Немедленно прекратите сверление, если происходит чрезмерное нагревание, кровотечение или уменьшение пульсации дуральной обработки.
   8. Орошите территорию и переоцените перед продолжением.
   9. Аккуратно поднимите костный лоскут с одного угла, используя тонкие щипцы или наконечник иглы.
   10. Если сопротивление останется, урежьте периметр.
   11. Сохраняйте твердую орудость целой во время удаления костного лоскута.
   12. Смывайте костную пыль стерильным физиологическим раствором.
   13. Контролируйте небольшое кровотечение с помощью мягкого солевого промывания и впитывающих мазков.
   14. Считайте, что кровотечение допустимо, если оно проходит в течение 1–2 минут после промывания и контакта впитывающим мазком.
   15. Исключите животное или прекратите процедуру, если кровотечение длится более примерно 5 минут.
   16. Исключить животное или прекратить процедуру, если твердость порвана, происходит сжатие коры или кровотечение закрывает область визуализации.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура может быть временно приостановлена после полного гемостаза и перед установкой покрывающего слива. Поддерживайте обнажённую твердую мозговую опухлину во влажном состоянии с помощью стерильного физиологического раствора и возобновляйте только после подтверждения отсутствия активного кровотечения.
5. Герметизация окон и крепление наголовной пластины
   1. Убедитесь, что обнажённая твердая мозговая орудость чистая, влажная и свободна от активного кровотечения.
   2. Наденьте стерильный наклад на краниотомию.
   3. Разместите покрывку на краниотомии черепа, не сжимая твердую оболочку.
   4. Проверьте правильное позиционирование, подтвердив заподлинную поверхность скольжения, отсутствие захваченных пузырьков воздуха, сохранение дуральной пульсации и чистый оптический путь.
   5. Подготовьте стоматологический цемент или клей типа Super-Bond C&B согласно инструкциям производителя.
      1. Для репрезентативной Super-Bond C&B смешайте 1 ложку порошка с 1 каплей катализатора и 4 капли мономера в предварительно охлаждённой керамической чаше с температурой примерно −20°C непосредственно перед нанесением.
   6. Наносите клей только вокруг внешнего края черепа, окружающего покрытие.
   7. Избегайте контакта с твердой мозговой мозговой мембраной и капиллярного отступления под стеклом.
   8. Дайте клею затвердеть примерно 5–10 минут при комнатной температуре.
      ВНИМАНИЕ: Стоматологический цемент и клейкие компоненты могут содержать летучие или раздражающие химикаты. Обращайтесь с ними в соответствии с институциональными процедурами безопасности и используйте соответствующую вентиляцию.
   9. Разместите индивидуальную титановую наголовную пластину вокруг окна черепа.
   10. Используйте наголовную пластину с центральным отверстием примерно 10 мм, совместимую с держателем для изображения.
   11. Центрируйте окно черепа внутри отверстия наголовья.
   12. Наносите зубной цемент только на участки, контактирующие с черепом вне оптического окна.
   13. Дайте цементу полностью затвердеть примерно 5–10 минут перед перемещением животного.
6. Послеоперационное восстановление и контроль качества окон
   1. Назначайте послеоперационную анальгезию в соответствии с утверждённым протоколом для животных.
   2. В репрезентативном процессе вводите бупренорфингидрохлорид в дозе 0,05–0,1 мг/кг подкожно каждые 8–12 часов в течение 24–48 часов.
   3. Восстанавливайте мышей в тёплой клетке.
   4. Ежедневно следите за дыханием, осанкой, движениями, уходом за собой и весом тела.
   5. Выбирайте окна с прозрачной стеклянной поверхностью, видимой корковой сосудистостью, целостной твердой оболочкой, минимальным остатком крови, отсутствием клея под покрытием, отсутствием инфекции и стабильной фиксацией головного щита.
   6. Исключайте животных с выраженной непрозрачностью, постоянным кровотечением, воспалительной осадкой, инфекцией, смещением окон, серьёзной потерей веса (>15%) или плохим уходом и активностью.
   7. После 3–5 дней восстановления проводите обследование.
   8. Подтвердите нормальную активность, нормальное поведение при груминге, стабильный вес тела, отсутствие боли или инфекций, а также прозрачное окно черепа с хорошо видными сосудами перед проведением визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен в период послеоперационного восстановления. Содержать мышей в стандартных условиях содержания, ежедневно контролировать вес тела и прозрачность окон и возобновлять снимки только после выполнения всех критериев восстановления.

3. Экспрессия эндотелиального сенсора NAD+, опосредованная AAV

1. Вирусная конструкция и подготовка
   1. Используйте генетически кодируемый ^{биосенсор} NAD+ на основе eGFP/cpVenus, управляемый эндотелиальным промотором Cdh5.
   2. Используйте Cambronne и другие. Биосенсорная последовательность цитоплазматической NAD+ LigA-cpVenus (например, плазмида Addgene #186787 или эквивалентная вставка с подтверждением последовательности).
   3. Клонируйте промотор Cdh5 выше последовательности ^{кодирования} биосенсора NAD+ с помощью векторного магистрали CV232.
   4. Упаковайте экспрессионную кассету в капсид AAV-X1.1 в виде индивидуального вирусного препарата.
      1. Зафиксируйте поставщика вирусного производства, метод очистки, метод количественной оценки вирусного генома, номер производственной партии и сертификат анализа для каждой препарата AAV.
   5. Записывайте карту плазмид, результаты верификации последовательностей, информацию о вирусном производстве, информацию о очистке, титр вирусного генома и сертификат анализа для каждого вирусного препарата.
      1. Записывайте карту конструкции, отчёт по верификации последовательностей, номер партии вирусного производства, отчёт о титре количественной полимеразной цепной реакции (qPCR), документацию по очистке и сертификат анализа для каждого вирусного препарата, используемого в исследовании.
   6. Обратитесь к Таблице материалов для всех деталей конструкции.
   7. Используйте препараты AAV с высоким титрами и специфическими для лотов титрами qPCR, обычно выше 2 ×^{10 13} vg/mL.
   8. Храните одноразовые аликвоты при −80°C.
   9. Избегайте повторяющихся циклов заморозки и оттаивания.
   10. Запишите производственную партию, qPCR-титр, продолжительность хранения и допустимые вариации от партии к партии перед использованием.
2. Системное администрирование AAV
   1. Разморозить вирусный аликот на льду.
   2. Разведите вирус в стерильном фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) до конечного объёма инъекции 100–200 мкл на мышь.
   3. Поддерживайте конечную дозу 2 × 10¹² vg на мышь у животных.
      1. Рассчитайте объём инъекции по титру вирусного генома для лота. Для репрезентативного препарата с титром qPCR 1,39 × 10¹³ vg/mL введите примерно 144 мкл для получения дозы 2 ×^{10 12} vg на мышь.
   4. Доставьте вирус ретро-орбитальной инъекцией венозных синуса с помощью стерильного инсулинового шприца на 29 G.
   5. Вводите вирусную суспензию медленно в течение примерно 10–20 секунд.
   6. Подтвердите успешные роды, проверив отсутствие протечек, чрезмерного кровотечения и повреждения глаз.
   7. Проверьте и сообщайте о любых альтернативных методах управления отдельно.
   8. Наблюдайте за мышью, пока не восстановятся нормальная осанка и спонтанные движения.
   9. Подтвердите стабильное дыхание и отсутствие кровотечений или страданий.
   10. Возвращайте животное в клетку только после полного выздоровления.
   11. Дайте 21–28 дней для экспрессии сенсоров перед проведением визуализации.
   12. Поддерживайте единый интервал экспрессии внутри каждого набора сравнения.
   13. Валидируйте интервалы экспрессии вне диапазона 21–28 дней отдельно.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен в период экспрессии AAV. Регулярно следите за уходом и контролем здоровья, а также переходите к операции с краниальными окнами только после истечения запланированного интервала экспрессии и здоровья животного.
3. Валидация эндотелиальной рестрикции
   1. Проводите скрининг животных перед официальным сбором данных.
   2. Принимайте животных, когда сигнал зелёного сенсорного канала обнаруживаем и следует сосудистой сети.
   3. Подтвердите, что сигнал обогащён вдоль стенок сосудов, прилегающих к просвету TMR–декстран–положительный.
   4. Подтвердить отсутствие доминантной диффузной паренхимальной флуоресценции.
   5. Применять одинаковые критерии приема во всех экспериментальных группах.
   6. Перфузируйте мышей с PBS, а затем 4% параформальдегида, когда требуется пост-хок валидация.
   7. Соберите мозг и подготовьте корональные или сагиттальные сечения размером 30–40 мкм.
   8. Окрашиваются срезами с эндотелиальными маркерами, такими как лектин томат, CD31 или сосудистый эндотелиальный кадгерин (VE-кадгерин).
      1. Запишите источник антител, каталожный номер, номер партии, вид хозяина, разбавление, условия инкубации и метод обнаружения для каждого валидационного эксперимента.
   9. Оценивать экспрессию никотинамида фосфорибозилтрансферазы (NAMPT) и поли(ADP-рибоза) полимеразы 1 (PARP1) при необходимости.
   10. Используйте первичные антитела разбавления, оптимизированные для подготовки тканей.
   11. Получайте флуоресцентные или конфокальные изображения с одинаковыми настройками сбора в разных группах.
   12. Количественно определить колокализацию как долю сенсорно-положительного сигнала, перекрывающегося с или непосредственно рядом с сосудистыми маркерами-положительными областями.
   13. Исключайте животных, если наиболее заметный сигнал находится вне сосудистых структур.
   14. Исключайте животных, если отсутствует обогащение стенок сосудов.
   15. Исключайте животных, если паренхимальная флуоресценция вне цели мешает надёжному отбору интересующих регионов.
   16. Исключайте животных, если флуоресценция сенсорного канала насыщена или нестабильна во время базового приобретения.

4. Двухфотонная визуализация и количественный анализ

1. Подготовка к дню визуализации и внутрисосудистая эталонная маркировка
   1. Анестезируйте мышей свежеприготовленным рабочим раствором Авертина (1,25%, 12,5 мг/мл) путём внутрибрюшнической инъекции в дозе 200–250 мг/кг или используйте режим анестезии, одобренный институциональным протоколом для животных.
   2. Подтвердите стабильную хирургическую плоскость потерей отмены педали и стабильного дыхания.
   3. Нанесите офтальмологическую мазь сразу после стимуляции родов.
   4. Если используется ингаляционная анестезия, индуцировать анестезию с помощью 3%–4% изофлурана.
   5. Поддерживайте анестезию с 1%–2% изофлурана в кислороде при 0,5–1,0 л/мин и корректируйте в зависимости от дыхания и рефлексов.
   6. Приготовьте TMR–декстран 70 кДа в стерильной PBS при 10–25 мг/мл.
   7. Защитить раствор TMR–декстран от света и фильтровать раствор, если это требует институциональная практика.
   8. Вводите TMR–декстран внутривенно в дозе 20 мг/кг.
   9. Регулируйте объём впрыска в зависимости от стандартной концентрации. Для мыши весом 25 г введите примерно 0,5 мг общего красителя.
   10. Подготовьте трассер свежим или храните аликвоты защищёнными от света согласно рекомендациям производителя.
   11. Дайте TMR–декстрану циркулировать в течение 5–10 минут до получения изображения.
2. Конфигурация микроскопа
   1. Используйте двухфотонный микроскоп с двойной длиной волны, настроенный на 920-нм возбуждение сенсорного канала на основе eGFP.
   2. Используйте путь возбуждения 1040 нм для опорного канала TMR–декстран.
   3. Репрезентативная визуализация проводилась на мультифотонном микроскопе Nikon A1 MP/A1R MP+, управляемом программным обеспечением NIS-Elements AR/AR Analysis (версия 5.42.06).
   4. Записывайте источники лазера, параметры импульсов, конфигурацию комбинации лучей, тип детектора и программную версию для каждой системы визуализации.
   5. Настройте каналы обнаружения так, чтобы отделить сигнал канала датчика от сигнала TMR–декстран.
   6. Используйте детекторы с нерасканированными фотоумножителями (PMT) или фосфида арсенида галлия (GaAsP).
   7. Собирайте излучение зелёного датчика-канала примерно от 500 до 550 нм.
   8. Собирайте излучение TMR–декстран примерно от 570 до 650 нм.
      1. В репрезентативном наборе данных собирайте излучение зелёного сенсорного канала с использованием фильтра излучения 525/50 нм и TMR–декстран с помощью фильтра излучения 575/25 нм или 610/75 нм.
   9. Минимизировать спектральное просачивание между каналами.
   10. Поддерживайте постоянные настройки усиления и смещения детектора в каждом наборе сравнения.
   11. Проверяйте разделение каналов с помощью одноканальных органов управления, когда это возможно.
   12. Используйте Nikon CFI75 Apochromat 25XC W 1300 с погружением в воду или эквивалент (25×, числовая диафрагма 1,10, рабочее расстояние 2,0 мм).
   13. Подтверждайте совместную регистрацию каналов с помощью фиксированных сосудистых ориентиров, таких как бифуркации и края просвета.
   14. Повторная проверка совместной регистрации после любой корректировки оптического пути.
   15. Измерьте мощность лазера в плоскости образца перед снимком.
   16. Поддерживайте постоянную мощность лазера 920 нм в каждом наборе сравнения.
   17. Поддерживайте постоянную мощность лазера 1040 нм в каждом наборе сравнения.
   18. Используйте примерно 10–20 мВт на 920 нм и 8–18 мВт на 1040 нм как представительные рабочие диапазоны.
   19. Регулируйте мощность лазера в зависимости от глубины изображения и качества окна черепа.
   20. Исключать поля, показывающие потерю сигнала более 20% в течение базового периода 120 с.
   21. Исключить поля, показывающие видимые фототоксичные изменения.
3. Настройки приобретения
   1. Выбирайте поля зрения с прозрачным оптическим окном, чётко сфокусированными микрососудами и минимальным движением.
   2. Принимайте окна с прозрачным покрытием, видимой корковой сосудистой системой, целостной твердой опухлиной, минимальным остаточным содержанием крови, отсутствием клея под покрытием, отсутствием инфекции и стабильной фиксацией головного щита.
   3. Исключайте животных с выраженной непрозрачностью, постоянным кровотечением, воспалительными остатками, инфекциями, смещением окон, выраженной потерей веса (>15%) или плохой уходом/активностью.
   4. Получайте таймлапс-изображения с частотой 512 × 512 пикселей.
   5. Получайте репрезентативные статичные изображения на 1024 × 1024 пикселей, когда требуется более высокая пространственная детализация.
   6. Сохраняйте размер пикселей, зум, скорость сканирования и поле зрения постоянными в каждом наборе сравнения.
   7. Получите z-стеки с помощью шага размером 1–3 мкм.
   8. Снимите кортикальные микрососуды на глубинах примерно 200–250 мкм ниже поверхности пиала.
   9. Увеличьте глубину изображения примерно до 400 мкм, когда позволяет качество окна.
   10. Поддерживайте глубину изображения постоянной для парных сравнений.
   11. Получите базовый уровень в 120 секунд с интервалом в 1 с до острых вмешательств.
   12. Продолжайте приобретение в заранее определённый период после вмешательства.
   13. Записывайте внутривенные ответы NMN примерно в течение 10–30 минут после инъекции.
   14. Получите наборы данных по питьевой воде и оральной вентиляции на заранее определённых экспериментальных конечных точках.
   15. Поддерживайте одинаковые настройки приобретения во всех группах сравнения.
4. Вмешательство NMN (пример применения)
   1. Растворить NMN в стерильной питьевой воде.
   2. Отрегулируйте концентрацию NMN так, чтобы довести примерно 100 мг/кг в день.
   3. Защитите бутылку от света.
   4. Заменяйте питьевую воду с NMN каждые 24–48 часов.
   5. Отслеживайте потребление воды с помощью измерения веса бутылки.
   6. Рассчитайте предполагаемое потребление NMN, используя потребление воды и массу тела.
   7. Продолжайте приём добавок в течение 5 дней перед визуализацией.
   8. Подготовьте NMN при дозе 1 мг/мл для орального гаважа.
   9. Вводите 200 мкл на мышь с помощью 20G и 38 мм с округлым наконечником.
   10. Проводите визуализацию через 30–60 минут после гава.
   11. Подготовьте NMN при 1 мг/мл для внутривенного введения.
   12. Введите 100 мкл на мышь через ретроорбитальный венозный синус или хвостовую вену.
   13. Вводите инъекцию медленно в течение 10–20 секунд.
   14. Начинайте визуализацию сразу или в течение 5 минут после инъекции.
   15. Получите наборы данных о питьевой воде после 5 дней приема добавок.
   16. Получайте наборы данных с использованием устного гаважа в фиксированную точку времени после подачи данных.
   17. Получите базовый уровень непосредственно перед внутривенной инъекцией.
   18. Зафиксируйте острые реакции примерно в течение 10–30 минут после внутривенного введения.
5. Обработка изображений и извлечение сигналов
   1. Выполняйте коррекцию движения, когда есть артефакты движения.
   2. Используйте Fiji/ImageJ (версии 1.8.0 или новее) вместе со StackReg, TurboReg или аналогичным алгоритмом регистрации с жёстким телом.
   3. Используйте сосудистые ориентиры в канале TMR–декстран для навигации регистрации.
   4. Принимайте наборы данных только при остаточном смещении менее примерно 1–2 пикселей после коррекции.
   5. Подтвердить, что границы сосудистых областей интереса (ROI) остаются стабильными на протяжении всего процесса приобретения.
   6. Используйте канал TMR–декстран для сегментирования люменов сосудов.
   7. Определите эндотелиальные ROI непосредственно рядом с просветом.
   8. Выберите микрососуды с стабильной маркировкой просвета, минимальным движением и видимым сигналом сенсор-канал.
   9. Проанализировать диаметры сосудов примерно 5–80 мкм.
   10. Определите эндотелиальные ROI как области, связанные со стенками сосудов, шириной примерно 2–5 мкм.
   11. Проанализируйте 3–5 сосудов на поле зрения, если доступно.
   12. Анализируйте 1–3 поля зрения на мышь, когда это возможно.
   13. Определите фоновые ROI в области тканей, где отсутствует сигнал трассеров и сенсоров.
   14. Размещайте фоновые ROI на расстоянии не менее 20 мкм от анализируемых сосудов и артефактов изображения.
   15. Вычитаем среднюю интенсивность фона из каждого канала перед нормализацией.
   16. Примените одну и ту же стратегию фонового вычитания ко всем образцам.
   17. Извлечь значения средней интенсивности по временным рядам для F_sensor(t).
   18. Извлечь значения средней интенсивности по временным рядам для F_ref(t).
   19. Проводите измерения с помощью анализа NIS-элементов AR/AR или Fiji/ImageJ.
   20. Экспортировать RAW-файлы изображений в формате ND2.
   21. Экспортный анализ копирует в виде 16-битных TIFF-стеков, когда это возможно.
   22. Экспортировать данные временных рядов ROI в виде CSV-файлов.
   23. Вычислите фоновые значения флуоресценции до нормализации.
   24. Вычислите ΔF/_{F 0} , используя ΔF/_{F 0} = (F(t) − F₀)/F₀.
   25. Определите F₀ как средний сигнал за базовый период 120 с.
   26. Вычислите нормализацию сосудистого отсчёта как F_sensor(t)/F_ref(t).
   27. Сообщайте о изменении пика, времени до пика, площади под кривой и кинетике восстановления, когда позволяет длительность приобретения.
   28. Не интерпретируйте сигнал датчика-канала 920 нм как откалиброванную концентрацию NAD⁺ .
   29. Проводите дополнительную рациометрическую калибровку или биохимическую валидацию, когда требуются количественные измерения NAD⁺ .
6. Статистика и репортажи
   1. Определите мышь как биологическую экспериментальную единицу.
   2. Средние измерения на уровне сосудов внутри каждой мыши до анализа на уровне группы или применения вложенной статистической модели.
   3. Используйте парные двуххвостые t-тесты для нормально распределённых сравнений внутри мыши.
   4. Используйте тесты Уилкоксона с парами со знакомым рангом, когда предположения нормальности не выполняются.
   5. Используйте модели с повторяющимися измерениями (ANOVA) или смешанные эффекты для анализа, включающих более двух связанных состояний.
   6. Применяйте соответствующие корректировки с множеством сравнений.
   7. Проводите статистический анализ с помощью GraphPad Prism или аналогичного программного обеспечения.
   8. Определите статистическую значимость как p < 0,05.
   9. Указывайте точный статистический тест в каждой легенде рисунка.
   10. Кодировать файлы изображений до выбора ROI и количественной оценки, когда это возможно.
   11. Поддерживайте анализ аналитиков до тех пор, пока не будут завершены измерения ROI и решения по контролю качества.
   12. Используйте N = 3 мыши в качестве биологической экспериментальной единицы в репрезентативном наборе данных.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Не приостанавливайте получение изображений во время активного таймлапс-съёмки. Обработка изображений и количественный анализ могут быть приостановлены после экспорта исходных данных. Храните файлы ND2, файлы анализа TIFF, файлы ROI, метаданные и таблицы измерений CSV в резервном архиве. Записывайте мощность лазера, настройки детектора, глубину изображения, идентификацию животных, назначение лечения и решения об исключении для каждой сессии визуализации.

Результаты

Успешная подготовка даёт прозрачное и механически устойчивое окно черепа, подходящее для продольной визуализации. Рисунок 1A обобщает процедурный процесс: от анестезии и воздействия черепа до краниотомии, размещения ковлз, фиксации головной пластины и послеоперационного восстановления. На рисунке 1B представлены представительные серийные фотографии основных хирургических этапов. Окна, подходящие для съёмки, демонстрируют чистый ...

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает сквозной рабочий процесс для мониторинга эндотелиального метаболизма ^NAD+ в мозге in vivo. Ключевые факторы успеха включают: (i) прозрачность и устойчивость окна, включая минимизацию тепловых повреждений и контроль прокачки во время бурения; (ii) специфичность эндотелиума и адекватная экспрессия сенсоров, достигаемые путём правильного выбора капсида, промотора, дозы и интервала экспрессии AAV; и (iii) согласованные настройки визуализации и а...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2,2,2-Трибромэтанол (Авертин)	Sigma-Aldrich	T48402	ОСТОРОЖНО: токсичное/вредное химическое вещество. Используется для приготовления раствора анестезии Авертин для хирургии с окном в черепе. Типичный рабочий раствор: 1,25% (12,5 мг/мл), вводится внутрибрюшинно в дозе 200–250 мг/кг.
2-Метил-2-бутанол	Sigma-Aldrich	152463	ОСТОРОЖНО: токсичное/вредное химическое вещество. Растворитель, используемый для приготовления концентрированного запасного раствора Авертина. Защитить от света и уничтожить препараты с осадком или потемнением.
Абсорбентные тампаны	Winner Medical	Стерильные медицинские ватные тампаны	Используются для остановки кровотечения, сушки черепа, орошения и поддержания хирургического поля.
AAV-X1.1-Cdh5-цитоплазматический NAD+ биосенсор-SV40 pA	Shanghai GeneChem Co., Ltd.; Addgene источники для плазмид	Конструкция GeneChem GCPV5052075; Addgene #186787; Addgene #196836	Эндотелиальный NAD+ биосенсор, упаковленный в AAV-X1.1. Кассета экспрессии: промотор Cdh5–цитоплазматический NAD+ биосенсор–поли(А) SV40. Представительная доза инъекции: 2 × 1012 vg/мышь. Хранить аликоты при –80 °C и избегать многократного замораживания и оттаивания. Записывать qPCR титру, номер партии, карту плазмиды, верификацию последовательности и сертификат анализа для каждого лота.
Аналгетик (гидрохлорид бупренорфина)	MCE	HY-B0071	Периоперационная и послеоперационная анальгезия. Представительная доза: 0,05–0,1 мг/кг подкожно каждые 8–12 ч в течение 24–48 ч.
Система подачи анестетика	RWD Life Science	R500 с парообразователем R580	Используется для подачи изофлурана во время визуализации. Типичный расход кислорода: 0,5–1,0 л/мин.
Анестезирующее средство (изофлуран)	RWD Life Science	R510-22 серия	Используется для анестезии при визуализации. Типичные настройки: 3–4% для индуцирования и 1–2% для поддержания.
Покрывало	Специальное изготовление	Нет номера каталога	Стерильное стеклянное покрывало № 1,5 размером, чтобы полностью покрыть 3 × 3 мм окно в черепе и плотно прилегало к краю черепа.
Стоматологический цемент/клей	Sun Medical	Super-Bond C&B; VZB/JAP8147	Используется для уплотнения окна в черепе и фиксации титановой головной пластины. Представительная подготовка: 1 щепотка порошка, 1 капля катализатора и 4 капли мономера. Затвердевает примерно 5–10 мин при комнатной температуре.
Стоматологический дрель	RWD Life Science	78001 микродрель	Высокоскоростной дрель, используемый для тонирования черепа и краниотомии. Используйте примерно половину максимальной скорости с частым охлаждением солевым раствором.
Дезинфицирующий раствор	Winner Medical	Повидон-йод/йодофор и 70% этанол	Используется для подготовки кожи головы перед операцией. Наносите чередующиеся дезинфицирующие средства в течение трех циклов.
Тонкие форцепсы	JZ Brand	JD1050/JD1070	Используются для удаления окостеневшей ткани, манипуляции с тканями и поднятия костной лоскути.
Игла для зонда	RWD Life Science	20G, 38 мм, шаровая насадка	Используется для перорального введения NMN.
Головная пластина	Специальное изготовление	Нет номера каталога	Титановая головная пластина с примерно 10 мм центрального отверстия, совместимая с держателем для визуализации.
Нагревательный коврик/гомеотермический контроллер	RWD Life Science	69020 с подушкой 69023	Используется для поддержания температуры тела примерно 36,5–37,5 °C во время операции и визуализации.
Программное обеспечение для получения изображений	Nikon	NIS-Elements AR/AR Analysis v5.42.06	Используется для управления микроскопом и получения изображений. Представительные настройки включают 512 × 512 или 1024 × 1024 пикселя, z-шаг 1–3 мкм и интервал временной лапсы 1 с.
Программное обеспечение для анализа изображений	NIH	Fiji/ImageJ v1.8.0 или более поздняя версия	Используется для коррекции движения, выбора области интереса, вычитания фона, извлечения интенсивности и экспорта в CSV.
Принадлежности для внутривенного введения	BD	329461	Стерильная 1 мл инсулиновая шприц-игла с иглой 29G для инъекций AAV, TMR-декстрина и NMN.
NMN (никотинамид мононуклеотид)	Selleck Chemicals	S5259	Предшественник NAD+, используемый для экспериментов с водой для пит