Эффективные методы идентификации 61 сорта масляного чая (Camellia oleifera abel) с использованием стратегии MCID и ДНК-маркеров

Краткое содержание

В этом исследовании использовалась ручная диаграмма идентификации сортов (MCID), основанная на случайно амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD), для эффективной и воспроизводимой идентификации 61 сорта Camellia oleifera Abel для использования генетического материала и идентификации сортов масляного чая.

Аннотация

Крайне важно выявлять материалы и сорта зародышевой плазмы Camellia oleifera Abel [масляный чай (Ot)] для оценки ресурсов генетического материала и механизмов защиты сортов Ot. В этом исследовании использовалась оптимизированная методика RAPD с увеличением длины праймера RAPD и скринингом температуры отжига ПЦР, что позволило выявить 61 сорт отжига из различных регионов. Кроме того, был разработан MCID для разработки эффективных RAPD-маркеров для идентификации сортов. Из 80 произвольных праймеров RAPD 11-nt были выбраны 10 праймеров, образующих прозрачные полиморфные полосы (PB), для ПЦР-анализа 61 сорта. Кроме того, стратегия MCID была применена для ручного различения 61 сорта на основе PB, обнаруженных в отпечатках ДНК, от 10 праймеров, которые сформировали диаграмму идентификации сортов Ot (Ot-CID). Этот Ot-CID обозначал каждый сорт отдельно, используя PB для идентификации сортов, с соответствующими праймерами, точно расположенными на Ot-CID. Стратегия MCID предлагает простой и практичный подход к идентификации растений с использованием ДНК-маркеров. Кроме того, этот подход предоставляет практичный и эффективный метод идентификации сортов. Полученный Ot-CID из 61 сорта Ot эффективно различал варианты Ot с помощью маркеров RAPD, что облегчило дифференциацию сортов для защиты права на сорт и ранней идентификации саженцев в питомниковой отрасли.

Введение

Camellia oleifera Абель [масляный чай (Ot)] — один из самых важных видов съедобных масличных деревьев древесины^{в мире.} Китай считается центром происхождения и разнообразия Ot, обладая обильными ресурсами генетического^{материала 2}. Древняя традиция Ot, растительное размножение и разнообразные глобальные программы селекции привели к появлению множества^{сортов 3}. Широкое глобальное выращивание культуры Ot привело к появлению сортов с омонимами (отдельные сорта с одним названием) и синонимами (сорта с более чем одним названием)⁴. Поэтому крайне важно разработать методы управления широким спектром генетического материала Ot и точного различия различных^{сортов 3,5}.

Несмотря на применение молекулярных маркеров на основе ДНК в характеристике сортов, генетических исследованиях и идентификации Ot, которые могут прояснить генетическое разнообразие и дифференцировать отдельных особей растений, ни одно исследование не смогло успешно выявить значительное количество сортов Ot или предоставить надёжную основу для дифференцировки^сортов 6,7,8,9 . Отсутствие надёжных методов является основным ограничением для применения ДНК-маркеров при идентификации растительных культур. Возможно, это связано с тем, что аналитические методы для отпечатков ДНК не могут дать соответствующую информацию, чётко определяющую праймеры и полиморфные маркеры для дифференцировки сортов, требующих идентификации. Аналитические методы определения узоров полосчеств ДНК (называемые кластерными анализами) неподходят для эффективного различия сортов или видов.

Хотя молекулярные идентификационные карты ДНК (ID) были разработаны для более чем 200 сортов Ot с использованием маркеров^SNP 2,3,10,11, всё ещё существуют несколько проблем: (1) Геном Ot сложен, большинство культивируемых камелий являются гексаплоидными, а референсный геном, используемый для построения молекулярных идентификаторов ДНК, является триплоидным, что может привести к определённым ^{неточностям 3}. (2) Секвенирование целого генома дорогостоящее, особенно для лабораторий с ограниченными возможностями, что препятствует его широкому применению для масштабного анализа разнообразия. Кроме того, продукты амплификации ПЦР требуют секвенирования или флуоресцентного обнаружения, что дополнительно усложняет процесс¹². (3) При отсутствии отличительных маркеров для новых сортов необходимо разрабатывать новые праймеры, что также потребует перекодирования кодов ID-карт для существующих типов. Это приводит к подавляющему большому числу позиций в коде, снижая эффективность дифференциации многообразия. Поэтому крайне важно применять методы, обеспечивающие простую, надёжную, релевантную и практичную верификацию сортов Ot для сектора питомников, сельскохозяйственного бизнеса, защиты патентов на растения, а также для сохранения и оценки генетических^{ресурсов 5}.

Традиционные стратегии идентификации сортов опирались на морфологические, физиологические и агрономические характеристики, но эти характеристики имеют ограничения, так как они подвержены воздействию окружающей среды и требуют всесторонней оценки полностью развитых^{растений 13,14}. Кроме того, молекулярные маркеры имеют явное преимущество — не подвержены влиянию факторов окружающей среды, что служит эффективным инструментом для точной характеристики сортов^14,15. В последнее время были установлены различные индексы на основе ДНК для оценки отпечатков пальцев, генетического разнообразия, сортов и^{чистоты} 16,17,18,19,20,21,22. Маркер RAPD полезен для анализа сортов благодаря своей простоте, эффективности и отсутствию необходимости предыдущих последовательностей^{данных 23,24}. Подход RAPD можно усовершенствовать путём выбора 11-нуклеотидных (nt) праймеров с их заданной температурой отжига ПЦР для применения в отпечатке растений, что делает RAPD предпочтительной методом идентификации сортов растений и оценки генетического^{разнообразия 25,26}. Эти маркеры широко применяются в дифференциации культур и генетической корреляции различных видов растений, включая^{абрикос 27},^{декоративный персик 28}, гранат²⁹,^{лендрасы 20} и грецкий^{орех 30} (Çilesiz и др., 2025). Несмотря на широкое применение, многие подходы на основе ДНК-маркеров остаются недостаточно практичными или упрощёнными для рутинной идентификации сортов растений.

Поэтому в этом исследовании использовался новый аналитический метод для воспроизводимой идентификации различных сортов Ot. MCID, полученный на основе RAPD, дифференцировал 61 сорт Ot для использования генетического материала и идентификации сортов.

Стратегия RAPD-MCID, описанная здесь (рисунок 1), наиболее подходяща для характеристики зародышевой плазмы малого и среднего масштаба в лабораториях со стандартной инфраструктурой ПЦР и гелевого электрофореза, но ограниченным доступом к секвенирующим лабораториям. Он также хорошо подходит для быстрого и экономичного предварительного скрининга перед более детальным генетическим анализом. Основные операционные ограничения метода включают его зависимость от доминирующих маркеров и необходимость тщательной стандартизации условий ПЦР для обеспечения межлабораторной воспроизводимости. Для крупномасштабных банков генетического материала или легальной регистрации сортов рекомендуется дополнительное использование кодоминантных маркеров, таких как SSR или SNP.

Протокол

1. Растительный материал

1. Собирайте молодые листья со здоровых, активно растущих побегов каждого сорта масляного чая из Национального хранилища гермоплазмы камелий, уезд Шучэн, провинция Аньхой.
2. См. таблицу 1 для названия и происхождения этих сортов.

2. Экстракция геномной ДНК

1. Извлечете полную геномную ДНК с помощью набора для экстракции растительной ДНК согласно инструкциям производителя.
2. ДНК была элюирована с помощью 1× TE буфера. После элаживания убедитесь, что извлеченный раствор ДНК выглядит прозрачным и бесцветным. Измерьте концентрацию ДНК с помощью микрообъёмного спектрофотометра.
3. Отрегулируйте концентрацию ДНК до 30 нг·^μL-1 с буфером 1× TE и храните скорректированный раствор ДНК при -20 °C.

3. Выбор грунтовки RAPD

1. Разработайте 80 случайных праймеров для анализа RAPD и проанализируйте их с помощью нескольких генотипов. Выберите 11-nt праймеры RAPD, которые создают чёткие и однозначные полосчатые паттерны для всех исследуемых генотипов.
2. Используйте выбранные праймеры для генотипирования, чтобы повысить достоверность амплифицированных фрагментов. Выберите 10 хорошо разрешённых праймеров с воспроизводимыми полосами для дальнейшего анализа, как указано в таблице 2.

4. ПЦР случайно амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD)

1. Подготовьте реакции усиления, немного изменяя вышеописанный метод²³. Подготовьте реакционные растворы в соответствии с составом, указанным в таблице S1.
2. Проведите ПЦР с использованием теплового циклера при следующих условиях: предденатурация при 94 °C в течение 5 минут; 42 цикла денатурации при 94 °C в течение 30 секунд, отжиг в течение 1 минуты при оптимальной температуре, указанной в таблице 2, и продолжение при 72 °C в течение 2 минут; и финальное удлинение при 72 °C на 10 минут.

5. Обнаружение и анализ продуктов ПЦР

1. Отделить амплифицированные фрагменты ДНК с помощью гелевого электрофореза при 100 В в 1,3% агарозе (w/v), приготовленной в буфере 1× TAE с содержанием 0,001 M EDTA и 0,04 M трис-ацетата при pH 8,0. Окрашивайте гели этидийбромидом при концентрации 0,5 мкг·^μL-1.
   ВНИМАНИЕ: Этидий бромид — мощный мутаген. При работе с растворами бромида этидия или пятнами используйте соответствующие средства индивидуальной защиты.
2. Пропустите гель при постоянном напряжении 100 В в течение 45–60 минут или пока фронт бромофенолового синего красителя не переместится примерно на две трети длины геля. После окрашивания и удаления пятен наблюдайте за гелем под ультрафиолетовым освещением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите, что отдельные полосы ДНК хорошо видны при ультрафиолетовом трансосвещении. Убедитесь, что на лестнице ДНК есть чёткие, хорошо отдельные полоски в диапазоне от 100 bp до 2 000 bp.
3. Фиксируйте полиморфные полосы (PB) сортов на основе их присутствия или отсутствия под ультрафиолетовым светом.
4. Каждую ПЦР-амплификацию проводите в три экземпляра для обеспечения воспроизводимости. Оценивайте только диапазоны, которые стабильно присутствуют или отсутствуют во всех трёх независимых реплицах для дальнейшего анализа. Подтвердите, что коэффициент согласованности диапазонов между репликами превышает 95%.

6. Анализ данных

1. Оценивайте полосы для идентификации сортов на основе их наличия или отсутствия, присваивая «+ o» чётко видимым полосам, а «−» — отсутствующим полосам на соответствующей молекулярной позиции во всех сортах. Включайте только полосы, которые стабильно наблюдаются в трёх независимых репликах.
2. Классифицировать сорта с отличительными полосами в отпечатке пальца, полученных одним грунтом, независимо от этого. Классифицировать сорта с одинаковой полосой в одну подгруппу. Дифференцируйте все сорта масляного чая постепенно и полностью на основе этих параметров.

7. Применение и эффективность диаграммы в идентификации сортов

1. Случайным образом выберите две группы сортов масляного чая из внутри- и межгрупп, чтобы проверить применимость и функциональность диаграммы, иллюстрирующей 61 сорт масляного чая. Выполняйте выбор вручную, обращаясь к разным ветвям диаграммы Ot-CID, без использования программного обеспечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Были случайным образом выбраны 2 группы сортов Ot для проверки применимости и функциональности диаграммы, иллюстрирующей 61 сорт Ot.
2. Обозначить две выбранные группы как «A» и «B». Проверьте соответствующие буквары для каждой группы из Ot-CID.

8. Руководство по утилизации опасных отходов

1. Подготовьте и обработайте все растворы с бромидом этидия в специально отведённой зоне. Собирайте все твёрдые и жидкие отходы, загрязнённые бромидом этидием, отдельно для утилизации в соответствии с институциональными рекомендациями по опасным отходам.
2. Утилизировать все материалы, загрязнённые бромидом этидий, в специально отведённые контейнеры для опасных отходов. Если вы не уверены, свяжитесь с офисом по охране окружающей среды и безопасности учреждения для получения одобренных процедур утилизации.

Результаты

Представленные здесь репрезентативные результаты иллюстрируют полный рабочий процесс стратегии RAPD-MCID — от начального отбора праймеров через иерархическую дискриминацию сортов и окончательной валидации. Процесс поэтапной дискриминации задокументирован на рисунках 2, 3, 4, 5,

Обсуждение

ДНК-маркеры — мощные инструменты, используемые для идентификации сортов растений и^{видов 24}. Эти маркеры были разработаны и использованы в тысячах исследований генетического анализа, идентификации сортов и т.д.; однако они не просты и не широко используются при^{генотипировании 24,31}. Это связано с отсутствием эффективных и простых методов с использованием ДНК-маркеров для идентификации сортов, филог...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Центрифуга	Eppendorf, Германия	5427R	Используется для извлечения геномной ДНК из листьев масличного чая
Hi-DNAsecure Plant Kit	Tiangen, Китай	DP350	Используется для извлечения геномной ДНК из листьев масличного чая
Прибор для амплификации гена ПЦР	Monad, Китай	MP60901	Используется для амплификации ПЦР
SolarRed Agarose LE	Solarbio, Китай	A8202	Используется для электрофореза фрагментов ПЦР
TAE	Tsingke, Китай	TSG001	Используется для электрофореза фрагментов ПЦР
TaKaRa Ex Taq	Takara, Япония	RR001A	Используется для амплификации ПЦР
Спектрофотометр Thermo Scientific NanoDrop 2000C	ABI, США		Используется для определения концентрации РНК