Методическая статья

Выделение и валидация подпопуляций мезенхимальных стволовых клеток с положительными подопланинами с использованием стратегии косвенного магнитного шарика

DOI:

10.3791/71365

⸱

23 июня 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Joint Surgery and Sports Medicine, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, 2Biomedical Innovation Center, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод сортировки на основе магнитных бусинок с использованием антител к проточной цитометрии, маркированных фикоэритрином (PE), и анти-ПЭ-микрочастиц для выделения специфических субпопуляций мезенхимальных стволовых клеток с высокой положительной результативностью постсортировки и сохраненной пролиферационной/метаболической активностью на основе CCK-8 в исследуемых условиях, без необходимости дорогих сортировщиков клеток или специализированных бусин.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение функциональной гетерогенности в мезенхимальных стволовых клетках основано на эффективной изоляции специфических субпопуляций (например, подопланин-положительных клеток). Однако для большинства мембранных белковых мишень напрямую доступные коммерческие магнитные шарики для сортировки ограничены. Для решения этой проблемы наша лаборатория разработала и протестировала стандартизированный протокол сортировки магнитных шариков, основанный на принципе косвенного соединения «антител к проточной цитометрии/анти-ПЭ-магнитных шариков, маркированных фикоэритрином (PE)». Используя PDPN-положительные клетки в качестве модельной целевой популяции, этот протокол обогащает долю целевых клеток без использования дорогих потоковых цитометрических сортировщиков клеток.

Исследователи могут использовать совместимые антитела к проточной цитометрии, маркированные PE, направленные на доступные белки поверхности клеток, и комбинировать их с коммерчески доступными анти-ПЭ-микрошариками для создания процесса сортировки выбранных мишень после оптимизации, специфичной для цели. Такой подход позволяет избежать длительных сроков выполнения и высоких затрат, связанных с настройкой или заказом специфических магнитных шариков для каждой новой цели, что делает его особенно подходящим для доступных поверхностных маркеров, которые редки или недостаточно изучены. В системе PDPN, протестированной здесь, протокол позволил обогатить целевую субпопуляцию высокой положительной PDPN после сортировки и сохранить пролиферацию/метаболическую активность на основе CCK-8 по сравнению с неотсортированными MSC.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В ортопедии травмы, такие как повреждение хряща и поражения в аваскулярной зоне (белой зоне) мениска часто приводят к необратимому разрушению суставов и потере функции, что в конечном итоге приводит к остеоартриту. Это в значительной степени связано с низкой регенеративной способностью этих тканей, что связано с отсутствием прямого кровоснабжения и лимфатического снабжения, а также наличием высокодифференцированных клеток с ограниченной способностью к пролиферации и миграции 1,2,3,4. Для решения этой проблемы были изучены различные клинические стратегии, включая использование экзосом, 5,6, аутологичную или аллогенную трансплантациюхондроцитов 7,8 и методы тканевойинженерии 9,10,11,12. В последние годы мезенхимальные стволовые клетки (МСК) стали перспективным источником регенеративного восстановления клеток благодаря своему многолинейному дифференциационному потенциалу и иммуномодуляционным свойствам, что даёт новую надежду на регенерациюхряща 13,14,15,16.

Несмотря на терапевтический потенциал, MSC демонстрируют значительную гетерогенность. Даже внутри одного источника ткани, такого как костный мозг или пуповина, отдельные субпопуляции МСК могут демонстрировать значительную вариабельность в способности пролиферации, потенциале многолинейной дифференцировки (особенно хондрогенной дифференцировки) и регенеративной функции invivo 17,18,19. Поэтому точная идентификация и выделение функционально определённых субпопуляций MSC — например, с повышенной хондрогенной способностью — крайне важно для дальнейшего понимания их биологических свойств и повышения эффективности восстановления хряща. Это является важным шагом в нашем исследовании.

По мере развития исследований всё больше новых мембранных белков выявляется в качестве маркеров функционально различных субпопуляций MSC. Однако преобразование этих открытий в эффективные стратегии сортировки клеток остаётся технически сложным. Традиционная флуоресцентно-активируемая сортировка клеток (FACS), хотя и мощная, требует специализированных приборов и технической экспертизы, что ограничивает его доступность во многих лабораториях. С другой стороны, сортировка иммуномагнитных клеток — хотя и более широко используемая — ограничена ограниченным доступом коммерческих реагентов, которые в первую очередь предназначены для нескольких хорошо зарекомендовавшихся мембранных мишеней. В результате для многих недавно обнаруженных маркеров с потенциальной биологической значимостью отсутствуют коммерчески доступные магнитные шарики, что затрудняет обогащение этих ценных субпопуляций MSC.

Чтобы преодолеть это ограничение, настоящее исследование направлено на создание и стандартизацию гибкого, экономически эффективного и эффективного протокола положительного отбора клеток. Этот подход основан на косвенной конъюгации коммерчески доступных антител, конъюгированных с фикоритрином (ПЭ), с анти-ПЭ-иммуномагнитными шариками. Предыдущие отчёты показали, что подопланин-положительные (PDPN+) МСК обладают превосходной способностью к поддержанию ствола и дифференцировки по сравнению с их аналогами с PDPN20. Кроме того, участие PDPN+ MSC в регенерации хряща и прогрессировании остеоартрита (ОА) задокументировано влитературе 21,22. Используя подопланин (PDPN) — недавно выявленный кандидат-маркер функциональных субпопуляций MSC — в качестве модельной цели, мы отсортировали PDPN-положительные клетки из MSC, полученных из костного мозга. Мы предлагаем подробный пошаговый протокол, охватывающий подготовку суспензии в одной клеточке, маркировку антител и магнитных шариков, а также магнитное разделение. Кроме того, мы оцениваем урожайность, положительную PDPN после сортировки и пролиферацию/метаболическую активность отсортированных клеток на основе CCK-8. Стандартизируя этот протокол, мы стремимся предоставить исследователям универсальный и доступный метод изоляции целевых субпопуляций с использованием совместимых антител против доступных маркеров поверхности клеток, тем самым облегчая фундаментальные исследования стволовых клеток и будущие трансляционные применения в регенеративной медицине.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSC, полученные из человеческого костного мозга, были коммерчески получены (см. Таблицу материалов). Поставщик подтвердил идентичность MSC положительной экспрессией CD73, CD90 и CD105; отрицательная экспрессия CD34, CD45 и HLA-DR; и потенциал дифференциации трилиней. Клетки расширялись в культуре и использовались в отрывках 3–5. Вся работа с клетками, полученными от человека, проводилась в биологическом шкафу класса II в стерильных условиях. Поскольку клетки были коммерчески приобретены и по этому протоколу напрямую не набирались или отбирались люди, прямое одобрение IRB не требовалось.

1. Подготовка суспензии с одной ячейкой

ПРИМЕЧАНИЕ: Качество подвески с одной ячейкой напрямую влияет на эффективность сортировки. Убедитесь, что клетки хорошо рассредоточены, высокожизнеспособны и свободны от сгустков. Видимые комки следует рассеивать повторяющим мягким пипетированием, пока комки не исчезнут.

  1. Выберите MSC (отрывки 3–5), достигшие слияния 80–90%. Отбросьте культурный медиум.
  2. Промой клетки 2 × 10 мл предварительно подогреного PBS. Аккуратно раскачивайте сосуд и отбросьте PBS.
  3. Добавьте 2 мл трипсина-ЭДТА 0,25% и инкубировать при 37 °C в течение 3–5 минут. Наблюдайте за клетками под микроскопом, пока они не свернутся и не начнут отсоединяться.
  4. Добавьте 4 мл культурной среды с 16,5% FBS (см. таблицу материалов) для нейтрализации трипсина. Аккуратно пипетируйте клетки, чтобы обеспечить полное отселение. Перенесите подвеску ячейки в центрифугную трубку объёмом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что все клетки собраны.
  5. Центрифугите при 300 × г в течение 3 минут и уберите супернатант.
  6. Суспензируйте ячеточную гранулу в 1 мл буфера (см. Таблицу материалов). Переходите к подсчёту ячеек.

2. Подсчёт клеток и корректировка концентрации

ПРИМЕЧАНИЕ: Если общее количество клеток меньше 1 × 107, всё равно добавьте антитела и магнитные реагенты на основе стандартного объёма для 1 × 107 клеток для обеспечения эффективности маркировки.

  1. Снова центрифугуйте суспензию ячейки при 300 × г в течение 3 минут и выбросьте супернатант.
  2. Повторно суспензировать ячейки в буфере для достижения плотности 1 × 108 клеток/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, чтобы обработать 1 × 107 ячеек, пеллету снова суспензировать в 100 мкл буфера.
  3. Перенесите подвеску ячейки в 5-мл полистироловую трубку с круглым дном.

3. Маркировка антител

  1. Добавьте 10 мкл блокатора Fc гамма-RII (см. Таблицу материалов) на 1 × 107 элементов. Аккуратно перемешайте и инкубуйте при комнатной температуре 10 минут.
  2. Добавьте 5 мкл антитела PDPN, конъюгированных с ПЭ (см. Таблицу материалов) на 1 × 107 клеток, следуя рекомендованной производителем концентрации. Аккуратно перемешайте и инкубуйте при комнатной температуре 15–20 минут, защищая от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объём антител следует корректировать согласно техническим характеристикам специфического цитометрического антитела, так как концентрации могут варьироваться между продуктами.

4. Маркировка магнитных шариков

ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все реагенты на льду перед использованием и возвращайте их в лёд сразу после каждого добавления для поддержания активности и стабильности.

  1. Добавьте 10 мкл коктейля для выбора на 1 × 107 ячеек (см. Таблицу материалов). Аккуратно перемешайте и инкубуйте при комнатной температуре 15 минут.
  2. Добавьте 5 мкл магнитных шариков на 1 × 107 ячеек (см. Таблицу материалов). Аккуратно перемешайте и инкубуйте при комнатной температуре 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Магнитные шарики активно вихрят флакон в течение 30 секунд перед использованием, чтобы обеспечить равномерное распределение.

5. Магнитное разделение

  1. Поместите 5 мл полистироловую трубку с круглым дном, содержащую промеченный образец ячейки, в магнитную сепарационную стойку (см. Таблицу материалов).
  2. Добавьте буфер в трубку, чтобы увеличить общий объём до 2,5–3 мл. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
  3. Проведите разделение: удерживая магнит и трубку вместе как единое целое, переверните их, чтобы налить супернатант в новую трубку для сбора трубки. Эта собранная фракция содержит PDPN-отрицательные клетки; Держи эту трубку на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не снимайте трубку с магнитной подставки на этом этапе, так как это нарушит разделение и приведёт к сбою процедуры.
  4. Повторяйте шаги 5.1–5.3 три раза. Каждый раз добавляйте буфер к оригинальной трубке в магните, ждите 5 минут и заливайте супернатант в ту же трубку с отрицательной фракцией, что и на шаге 5.4.
  5. После финальной промывки снимите трубку с магнитно связанными элементами из стойки. В этой трубке содержится фракция клеток PDPN.
  6. Добавьте 3 мл буфера для повторной суспензии положительных ячеек. Перенесите эту суспензию в свежую, маркированную трубку (трубку положительной фракции).

6. Сбор, культивирование и валидация целевых клеток

  1. Посчитайте клетки как из положительных, так и из отрицательных фракционных трубок. Запишите выход ячеек для каждой дроби.
  2. Центрифугуйте суспензию положительной фракции при 300 × г в течение 3 минут. Отбросьте супернатант.
  3. Суспензировать клеточную гранулу в среде MEM Alpha с содержанием 16,5% FBS. Регулируйте плотность клеток по мере необходимости и засевайте клетки в культиваторные пластины или колбы.
  4. Инкубировать клетки при 37 °C в инкубаторе с концентрацией CO₂ 5%.

7. Подготовка образца для чистоты и функциональной валидации

  1. Посчитайте клетки и засейте их в 100-мм культурную чашу с плотностью 3 ×10 6 клеток на одну тарелку в 12 мл культурной среды. Через двадцать четыре часа после посева наблюдайте прикрепление клеток. Замените культурную среду на свежую, чтобы удалить остатки магнитных шариков и неприлипающие клетки.
  2. Собирайте клетки с помощью трипсинизации. Аккуратно поднимайтесь и опускайте 10–15 раз, чтобы вытеснить и удалить магнитные шарики и остаточные антитела.
  3. Оценить процент PDPN-PE-положительных клеток с помощью проточной цитометрии (см. дополнительный файл 1 для подробного протокола).
  4. Собирайте клетки во время логарифмической фазы роста. Посейте их в тарелку на 96 колодц. В разные временные моменты (0 ч, 24 ч, 48 ч, 72 час) добавьте реагент CCK-8 (см. Таблицу материалов) и измеряйте поглощение согласно инструкциям производителя. Постройте кривую пролиферации на основе данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общий принцип и рабочий процесс эксперимента иллюстрированы на рисунке 1. Все последующие экспериментальные данные основаны на ячейках 5-го прохода. После магнитного разделения полученные PDPN+ клетки культивировались в течение 24–48 часов. После замены культурной среды для удаления неприлипающих клеток и потенциальных остаточных магнитных шариков (рисунок 2A) мы оценили эффективность сортировки и выход клеток. Начина...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы разработали протокол на основе магнитных шариков для выделения клеток PDPN+ из MSC, полученных из костного мозга. Этот подход позволяет эффективно обогащать PDPN-положительную субпопуляцию при сохранении пролиферации/метаболической активности на основе CCK-8 в исследуемых условиях.

По сравнению с традиционными методами прямой иммуномагнитной сортировки, главное преимущество этой стратегии заключается в её универсальности. Традиционные по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы выразить благодарность профессорам Бянь Лимину и профессору Чжан Куньюй из Школы биомедицинских наук и инженерии Международного кампуса Южно-Китайского технологического университета за предоставленную экспериментальную платформу и руководство. Эта работа была профинансирована Китайским фондом постдокторских наук (2023M734022), Фондом фундаментальных и прикладных исследований Гуандуна (2023A151511162) и Национальным фондом естественных наук Китая (82502983).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
7-AAD Cell Viability Assay KitKeyGENKGD1202-50
Anti-human CD32 Blocker (Fc gamma RII Blocker)STEMCELL Technologies18520
BufferSTEMCELL Technologies20104Буфер
CCK-8MeilunbioMA0218-5
Dextran Magnetic ParticlesSTEMCELL Technologies50100Магнитные частицы
Fetal Bovine SerumGibco16050-122
MagnetSTEMCELL Technologies18000магнитный сепаратор
MEM Alpha MediumGibcoC12571500BTMEM Alpha Medium (82.5%) + FBS (16.5%) + Пенициллин-стрептомицин (1.0%)
MSCsKeyGENKGG5575-1Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозга человека
PE-conjugated Anti-Human PDPN AntibodyABclonalA26770PDPN-PE
PE Selection CocktailSTEMCELL Technologies18151Селекционный коктейль
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Trypsin-EDTAGibco25200-072

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PE

Похожие статьи