Количественная оценка цитотоксичности NK-клеток, усиленной химерными антигенными рецепторами и терапевтическими антителами с помощью живых клеток визуализации и потоковой цитометрии

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает стандартизированный in vitro рабочий процесс для последовательного измерения естественной, химерной антиген-рецепторной и антителозависимой цитотоксичности человеческих природных киллерных клеток с помощью живой клеточной визуализации и проточной цитометрии.

Аннотация

Естественные киллеры (NK) — это врождённые лимфоциты, играющие критическую роль в защитном иммунитете против различных внутриклеточных патогенов и рака. Их основная функция — уничтожение целевых клеток, которые инфицированы, злокачественно трансформированы или покрыты антителами посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). NK-клетки также могут быть генетически модифицированы для экспрессии химерных антигенных рецепторов (CAR), которые позволяют целенаправленно распознавать специфические антигены. Количественное измерение цитотоксичности NK-клеток необходимо для оценки исходной функциональности и доклинической оценки моноклональных антител и стратегий CAR-инженерии. Однако функциональные анализы in vitro остаются очень разнообразными в разных лабораториях из-за различий в клеточной подготовке, целевых клетках, соотношении эффекторов к целеви, времени совместной инкубации и методах считывания, что ограничивает воспроизводимость и сравнения между исследованиями. В этой статье представлен стандартизированный протокол количественной оценки цитотоксичности NK-клеток с использованием потоковой цитометрии и изображения живых клеток в реальном времени. Первичные человеческие NK-клетки и CAR-экспрессирующие NK-92 клетки были оценены на их способность убивать раковые клетки и целевые клетки, покрытые антителами, в формате пластин с 96 лунками для измерения естественной цитотоксичности, CAR-опосредованного убийства и ADCC. Выживаемость целевых клеток измерялась либо непрерывно с помощью живых клеток, либо в определённый момент времени с помощью потоковой цитометрии, что также позволило фенотипически охарактеризовать NK-клетки и целевые клетки. Эти протоколы обеспечивают надёжную основу с использованием рутинных методов культуры тканей, визуализации и потоковой цитометрии, позволяя воспроизводить возможность количественной оценки функций эффектора NK-клеток для изучения врождённого иммунитета и иммунотерапии на основе NK-клеток.

Введение

Натуральные киллеры (NK) — это врождённые лимфоциты, которые играют центральную роль в иммунном надзоре против вирусно инфицированных и злокачественных клеток, проявляя быструю и мощную^{цитотоксичность 1}. В отличие от B и T-клеток, NK-клетки не экспрессируют антиген-специфические рецепторы, а полагаются на массив активирующих и ингибирующих рецепторов для выявления потери экспрессии основных гистосовместимостных комплексов класса I или клеточного стресса. Это позволяет им опосредовать прямую цитотоксичность, высвобождая цитотоксические гранулы, содержащие перфорин и гранзимы, или, в некоторых случаях, активируя рецепторы^смерти 1,2,3,4. Помимо естественной цитотоксичности, NK-клетки экспрессируют FcγRIII (CD16) — рецептор, который распознаёт Fc-часть иммуноглобулина G (IgG) и опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) против IgG-покрытых^{целевых клеток 5,6}.

Благодаря своим внутренним цитотоксичным механизмам и благоприятному профилю безопасности NK-клетки стали перспективными кандидатами для клеточной иммунотерапии. С возможностью аллогенных применений NK-клетки могут функционировать как «готовая» терапия с минимальным риском заболевания трансплантат против хозяина, что обеспечивает более широкое клиническое применение и снижает^{затраты 7}. Недавние достижения ещё больше расширили терапевтический потенциал NK-клеток благодаря стратегиям генной инженерии, включая внедрение химерных антигенных рецепторов (CAR), которые перенаправляют NK-клетки на распознавание специфических опухолевых антигенов. Клетки CAR-NK продемонстрировали противоопухолевую эффективность в in vivo ксенотрансплантатных моделях и клинических испытаниях, с меньшей токсичностью по сравнению с клетками^{CAR-T 8,9,10}. Поэтому растет интерес к разработке инженерных платформ NK-клеток и терапевтических стратегий на основе антител. В этом контексте точное и количественное измерение способности к уничтожению NK-клеток крайне важно для понимания биологии NK-клеток, оценки эффективности CAR или других инженерных NK-клеточных терапий, а также оценки моноклональных антител, основанных на ADCC.

Разнообразные in vitro анализы широко используются в лабораториях для оценки цитотоксичности NK-клеток. Распространённые методы включают анализы на высвобождение радиоактивного хрома-51, анализы на высвобождение лактатдегидрогеназы и анализы на высвобождение кальцеина–ацетоксиметил^11,12. Хотя эти традиционные методы широко применяются для измерения цитотоксичности, они основаны на косвенных показаниях гибели клеток, предоставляют конечные измерения вместо кинетических данных и обеспечивают ограниченную чувствительность и динамический диапазон. Они также не предоставляют информации о фенотипе или состоянии активации эффекторных клеток. В последнее время всё чаще применяются платформы для визуализации живых клеток и потоковая цитометрия, поскольку они позволяют напрямую количественно оценивать выживаемость целевых клеток, отслеживать гибель с течением времени и одновременно анализировать эффекторные и целевые клетки^13,14. Тем не менее, даже среди этих новых подходов существует значительная вариабельность между лабораториями и опубликованными исследованиями, включая различия в приготовлении целевых клеток, соотношении эффектора к целевой (E:T) и времени коинкубации, что ограничивает воспроизводимость и сравнения между исследованиями, особенно в доклинических оценках иммунотерапии на основе NK-клеток.

В этой статье представлен стандартизированный рабочий процесс для количественной оценки цитотоксичности NK-клеток с использованием двух независимых, взаимодополняющих платформ: в реальном времени с живыми клетками (IncuCyte SX5) и конечных анализов на основе проточной цитометрии. Визуализация живых клеток позволяет непрерывно отслеживать выживаемость целевых клеток во время совместной культуры с эффекторными клетками, что позволяет кинетически оценивать цитотоксичность при различных соотношениях E:T и экспериментальных условиях с минимальными анализами¹⁵. В отличие от этого, проточная цитометрия обеспечивает высокочувствительное измерение конечной точки гибели целевой клетки, а также одновременное фенотипическое охарактеризацию NK-клеток и целевых клеток с помощью мультимаркерной панели окрашивания.

Кроме того, этот протокол включает стандартизированные экспериментальные параметры, включая соотношения E:T, условия инкубации, формат пластин и аналитические рабочие процессы, чтобы повысить воспроизводимость и облегчить сравнение измерений цитотоксичности между лабораториями и исследованиями. Рабочий процесс позволяет количественно оценивать несколько функций эффектора NK, включая природную цитотоксичность, убийство, опосредованное CAR, и ADCC, и совместим с первичными человеческими NK-клетками и линиями NK-клеток. Этот протокол предоставляет практическую основу для изучения биологии NK-клеток и доклинической оценки разработки иммунотерапии на основе NK-клеток.

Протокол

Использование образцов доноров для исследований было одобрено Институциональным обзорным советом и проведено в соответствии с институциональными рекомендациями (Approval #2022P000699).

1. Анализ убийства с живыми клетками в реальном времени

1. Пластины для покрытия
   1. Добавьте 50 мкл/скважина поли-D-лизина (0,1 мг/мл в фосфатно-буферном физиологическом растворе [PBS]) в сетку 6 × 10 в пластине с плоским дном на 96 лунок. Аккуратно потрясите пластину, чтобы убедиться, что дно каждой ямы полностью покрыто.
   2. Инкубировать тарелку в течение 2 часов при комнатной температуре (RT; 18°C–26°C) с закрытой крышкой.
   3. Промыйте колодцы на 3× с PBS 200 мкл/скважина и уберите супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытые пластины могут быть запечатаны парапленкой и хранятся при 4°C до 1 недели с добавлением 200 мкл PBS в каждую скважину. Убедитесь, что пластины остаются стерильными, отбросьте PBS и дайте им уравновеситься до RT перед использованием.
2. Подготовьте целевые клетки
   1. Приготовьте 10 мл 2× SYTOX Orange (200 нМ), разбавляя раствор SYTOX Orange (250 мкм в DMSO) в культурную среду NK-92 (добавьте 8 мкл к 10 мл общего объёма) в 15-мл конической центрифугной трубке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда для выращивания клеток NK-92 состоит из продвинутой среды RPMI-1640, 10% плодовой бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-аланил-L-глутамина, 100 мкг/мл примоцина и 500 Ед/мл человеческого IL-2.
      ВНИМАНИЕ: SYTOX Orange — это флуоресцентный краситель, который может представлять риск при контакте кожи или глаз. Обращайтесь с соответствующими средствами индивидуальной защиты и в соответствии с институциональными нормами безопасности.
   2. Подсчёт целевых клеток используется методом подсчёта клеток на основе исключения красителей (например, трипан-синий) или аналогичным валидированным методом (например, автоматический счётчик клеток).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе целевыми клетками были клетки Рамоса — линейка B-клеток лимфомы с экспрессирующим антиген (BCMA⁺), которую мы спроектировали для экспрессии флуоресцентного белка в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR) emiRFP670.
   3. Переложите необходимое количество в коническую трубку с коническим дном объёмом 15 мл.
   4. Центрифуга (5 мин, 300 × г, RT, ускорение = максимум; тормоз = максимум).
   5. Отбросьте супернатант.
   6. Ресуспензировать целевые клетки до конечной концентрации 2,5 × 10⁵ клеток/мл (2,5 × 10⁴ клеток/100 мкл) в 2× SYTOX Orange среде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановленные целевые клетки могут поддерживаться при 37°C с 5% CO₂ в трубке до 30 минут при подготовке разбавления эффекторных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для одной полной пластины 60 скважин × 2,5 × 10⁴ ячейки/скважину = 1,5 × 10⁶ целевых ячеек. Подготовьте 2.0 × 10⁶ ячеек, чтобы учесть потери. Корректируйте количество ячеек в зависимости от размера анализа и желаемой плотности посева.
3. Подготовьте эффекторные элементы
   1. Оценить концентрацию и жизнеспособность клеток NK-92 с помощью метода подсчёта клеток на основе исключения красителей (например, трипан-синий) или аналогичного валидированного метода. Продолжайте только при жизнеспособности ≥80%, так как низкая жизнеспособность может повлиять на результаты анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве эффекторных клеток использовались клетки NK-92, созданные для стабильной экспрессии флуоресцентного белка ZsGreen, как самостоятельно (контрольно) так и с использованием CAR-конструкций, нацеленных на BCMA.
   2. Подсчитать и перенести необходимое количество ячеек в отдельные 15-мл-центрифугные трубки с коническим дном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вычислите общее количество эффекторных ячеек, суммируя количество ячеек, необходимых для всех соотношений E:T для одной реплики, умножение на количество репликатов и добавление 50% избыточности для учёта потери клеток. Круглые номера по мере необходимости для облегчения подготовки. Например, для соотношений E:T от 2:1 до 0,25:1 используйте 1,5 × 10⁵ NK-ячеек на каждую реплику. Для тройных экземпляров подготовьте 4,5 × 10⁵ ячеек на каждое условие, исходя из расположения пластин, описанной на дополнительном рисунке 1A.
   3. Центрифугные ячейки (5 мин, 300 × г, RT, ускорение = максимум; замедление [тормоз] = максимум).
   4. Отбросьте супернатант.
   5. Ресуспензировать клетки до конечной концентрации 5,0 × 10⁵ клеток/мл (5,0 × 10⁴ клеток/100 мкл).
4. Подготовьте разбавление эффекторных клеток
   1. Подготовьте разбавление эффекторных ячеек, включая управляющий только целевой системой, в пластине с круглым дном на 96 лунок (см. дополнительный рисунок 1A для представительной схемы пластины с четырьмя условиями в тройных экземплярах). Каждое состояние готовится в тройном экземпляре.
   2. Добавьте 240 мкл/скважину эффекторных ячеек (5,0 × 10⁵ клеток/мл) в колодцы, соответствующие соотношению E:T 2:1.
   3. Добавьте 120 мкл/скважину среды во все оставшиеся скважины.
   4. Выполните двухкратное последовательное разбавление от колодец E:T = 2:1 до E:T = 0,25:1. Тщательно перемешивайте, пипетируя ≥5 раз, и меняйте наконечники между пересадками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если запуски визуализации не были запланированы в системе визуализации, запланируйте их перед установкой совместной культуры. Подготовленные разбавления эффекторных клеток могут поддерживаться при 37°C с 5% CO₂ в круглодонной пластине на 96 лунок до 30 минут при настройке системы изображения живых клеток.
5. Создание совместной культуры
   1. Получите пластину с поли-D-лизиновым покрытием и плоским дном на 96 лунок.
   2. Добавьте 100 мкл/скважину суспензии целевой ячейки во все скважины. Тщательно повторно подвесьте целевые ячейки непосредственно перед дозированием, пипетируя вверх и вниз ≥5 раз с использованием соответствующей пипетки (например, 200 мкл) и избегайте образования пузырьков во время переноса.
   3. Добавьте 100 мкл/скважину суспензии эффекторной ячейки в соответствующие ямы. Тщательно ресуспензируйте эффекторные элементы непосредственно перед отпуском, прокручивая пипеткой вверх и вниз ≥5 раз с использованием соответствующей пипетки (например, 200 мкл) и избегайте образования пузырьков во время переноса.
   4. Добавьте 200 мкл/скважина PBS к окружающим неиспользуемым скважинам.
   5. Центрифуга пластины (2 мин, 100 × г, RT, ускорение = низкое [например, 2]; замедление [тормоз] = низкое [например, 2]).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это мягкое вращение критически важно для быстрого и равномерного осаждения клеток на дне скважины для точной визуализации на IncuCyte SX5. Мы используем настольную центрифугу Eppendorf 5810R, совместимую с ротором с качающимися роторами, с настройками ускорения и торможения, установленными на 2 (из 9).
   6. Поместите пластину в систему живой ячейки и делайте снимки каждые 1 час в течение 24 часов (при необходимости можно удлинить до 72 часов). Обеспечить проведение визуализации в стандартных условиях инкубации (37°C/5% CO₂).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы визуализация при t = 0 h точно отражала исходное количество целевых клеток, начните получение изображений в течение 10–15 минут после установки совместной культуры и центрифуга. Для полной пластины с тремя каналами изображения (зелёный, оранжевый и NIR) время сканирования составляет примерно 10 минут в час для 3 изображений/скважины при увеличении 20×.
   7. Проверьте качество изображения после первого сканирования и при необходимости настройте настройки.
6. Настройки инструментов
   1. Настройте спектральное размешивание для коррекции флуоресцентного перелива SYTOX Orange в зелёный канал. Скорректируйте значение размешивания в программном обеспечении, сравнив зелёный и оранжевый каналы и убедившись, что мёртвые ячейки Orange⁺ не ошибочно обнаруживаются как Green⁺. Для репрезентативного эксперимента (рисунок 1) вклад оранжевого канала в зелёный канал был установлен на уровне 8,5%. Эти значения специфичны для конкретного набора данных и должны оптимизироваться для каждого эксперимента.
   2. Настройте неадгезентный анализ Cell-by Cell для обеспечения точной сегментации и маскировки всех ячеек в каждом поле зрения (см. дополнительный рисунок 1B для репрезентативной настройки). Следующие параметры рекомендуются для системы живой ячейки с использованием моделей суспензионного эффектора и целевых клеток:
      1. Установите ожидаемый диаметр объекта на 15 мкм (приблизительный диаметр ячеек).
      2. Установите пороговую чувствительность и чувствительность текстуры на 5.
      3. Установите чувствительность краёв на уровне 10 для облегчения разделения клеточных кластеров.
      4. Установите допустимый диапазон фильтра площади объекта на 50–2000 мкм² , чтобы исключить мусор и крупные объекты.
      5. Установите максимальный эксцентриситет 0,95, чтобы исключить неклеточные объекты.
   3. Настройка порогов классификации (см. дополнительный рисунок 1C для репрезентативного гейтинга). Используйте контрольные скважины, предназначенные только для целевых целей, чтобы определить исходную популяцию живых целевых клеток NIR⁺/Orange⁻ . Затем используйте колодцы совместной культуры в более поздних временных точках (например, t = 4 часа), чтобы подтвердить чёткое разделение с минимальным перекрытием между популяциями ^NIR+/⁻ и Orange⁺/⁻ . Примеры порогов классификации и параметров анализа показаны на дополнительном рисунке 1C.
      1. Установите порог интенсивности Orange примерно на 15.
      2. Установите порог интенсивности NIR примерно на 0,1.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Значения параметров и порогов могут варьироваться в зависимости от прибора, программного обеспечения, модели ячеточной линии и интенсивности флуоресцентного сигнала.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть адаптирован для первичной цитотоксичности человеческих NK-клеток или для анализа на ADCC, если целевые клетки стабильно экспрессируют NIR-флуоресценцию (например, emiRFP670). Также его можно адаптировать для анализов на основе проточной цитометрии, исключая поли-D-лизиновое покрытие и используя плоскодонные или круглодонные пластины с 96 колодцами.

Рисунок 1. Количественная оценка кинетики и потенции цитотоксичности, опосредованной клетками NK-92, с помощью изображения живых клеток в реальном времени. (A) Схематический обзор анализа живых клеток IncuCyte для мониторинга цитотоксичности, опосредованной NK-клетками. Целевые клетки ^BCMA+ Ramos, экспрессирующие emiRFP670 (ближний инфракрасный [NIR] канал), кокультурируются с эффекторными клетками NK-92, экспрессирующими ZsGreen (зелёный канал), а гибель клеток обнаруживается с помощью SYTOX Orange (оранжевый канал). (B) Репрезентативное флуоресцентное изображение кокультурной ямы при соотношении эффектора к целевой (E:T) 1:1 через 12 часов. Живые целевые клетки (emiRFP670⁺) показаны синим цветом, эффекторные клетки NK-92 (ZsGreen⁺) — зелёным, а мёртвые клетки (SYTOX Orange⁺) — красным. Изображения были получены с помощью неадгезентного модуля анализа Cell-by-Cell при увеличении 20×. Шкала = 100 мкм. (C) Количественная оценка роста и выживаемости целевых клеток со временем при различных соотношениях E:T для контроля и CAR-экспрессирующих NK-92 клеток. (D) Количественная оценка выживаемости целевой клетки в зависимости от соотношения E:T в нескольких временных точках (4, 8, 16 и 24 часа). Количество целевых клеток нормализовалось до целевых колодцев (E:T = 0:1) в каждую временную точку. (E) Схематическое представление количественных метрик, используемых для оценки цитотоксичности:_{KR 50}, соотношение убийцы к цели, необходимое для достижения 50% смерти за 12 часов; _{KT 50} — время, необходимое для достижения 50% убийства при соотношении E:T 1:1; и_{IKI 50} — интегрированный индекс убийцы, определяемый как площадь тепловой карты ниже 50% изоклина выживаемости. (F) Тепловые карты, показывающие рост и выживаемость целевой клетки в зависимости от отношения E:T и времени для каждого эффекторного состояния. Для каждого состояния указаны количественные значения для_{KR 50},_{KT 50} и IKI₅₀. Сырые живые подсчёты целевых клеток были получены из популяции Orange ^NIR+/SYTOX с помощью анализа классификации по клеткам в программном обеспечении IncuCyte 2021C. Все условия выполнялись в тройном экземпляре (n = 3). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Для моделирования тенденций цитотоксичности в панелях D и F использовался нелинейный регрессионный анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

2. Количественная оценка клеточной цитотоксичности, зависящей от антител, с помощью потоковой цитометрии

1. Подготовьте первичные человеческие NK-клетки
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные человеческие NK-клетки были выделены из периферической крови, обогащённой лейкоцитами, полученной от здоровых взрослых доноров, с помощью метода обогащения NK-клеток с последующим центрифугированием градиента плотности, как описано^{выше 3}. Очищенные NK-клетки криоконсервировались в концентрации 5 ×^{10 6} клеток/мл в растворе замораживания (90% FBS и 10% диметилсульфоксида [DMSO]) в виде аликвот по 0,5 мл в криовиалах и хранили при температуре менее −150°C до^{применения 3}.
   1. Разморозить один флакон с 5 × 10⁶ первичными человеческими NK-клетками, аккуратно перемешивая криовиал в водяной бане при температуре 37°C примерно в течение 1 минуты, пока не останется лишь небольшой ледяной кристалл.
      ВНИМАНИЕ: Обрабатывайте все образцы, полученные человеком, с использованием соответствующих процедур биобезопасности и средств индивидуальной защиты в соответствии с институциональными рекомендациями.
      ВНИМАНИЕ: ДМСО способствует впитыванию химикатов кожей. Носите соответствующее защитное снаряжение и избегайте прямого контакта.
   2. Переместите размораживаемые клетки в 15-мл коническую центрифугную трубку с 10 мл предварительно нагретой (37°C) NK-клеточной культурной среды и смешайте путём аккуратного поворота.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда культуры NK-клеток состоит из Advanced RPMI-1640, дополненного 10% FBS, 10% сыворотки AB в человеке, 2 мМ L-аланил-L-глутамин, 100 мкг/мл примоцина и 50 Ед/мл человеческого IL-2.
   3. Центрифугные ячейки (5 мин, 300 × г, RT, ускорение = максимум; замедление [тормоз] = максимум).
   4. Отбросьте супернатант.
   5. Суспензировать гранулу в 5 мл предварительно нагретой (37°C) NK-клеточной культурной среды.
   6. Центрифугные ячейки (5 мин, 300 × г, RT, ускорение = максимум; тормоз = максимум).
   7. Отбросьте супернатант.
   8. Суспензируйте гранулу в 1 мл предварительно нагретой среды NK-клеточной культуры.
   9. Перенесите суспензию в одну из 24-лунок пластины для культуры тканей.
   10. Добавьте 1 мл стерильного PBS в окружающие скважины, чтобы минимизировать испарение.
   11. Инкубировать пластину с 24 лунками под углом 45° (используя стойку или опору для поддержки для поддержания угла) при 37°C с 5% CO₂ в течение 16–24 часов для восстановления NK-ячейки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные человеческие NK-клетки нуждаются в тесном контакте между клетками для максимальной выживаемости и восстановления, что можно достичь, наклоняя пластину с 24 лунками и позволяя накопление на краю скважин. Поддерживайте стабильное время инкубации во всех экспериментах.
       ПРИМЕЧАНИЕ: После периода восстановления сразу переходите к подготовке целевой клетки и установке совместной культуры.
2. Окрашивайте клетки карбоксифлуоресцеиновым сукцинимидилэфиром (CFSE).
   1. Получите 5 × 10 целевых^{ячеек и} перенесите в 15-мл коническую центрифугную трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве целевых клеток¹⁶ использовалась линейка лимфомы CD38⁺, полученная пациентом.
   2. Промывайте клетки один раз с 10 мл PBS.
   3. Центрифугные ячейки (5 мин, 300 × г, RT, ускорение = максимум; тормоз = максимум).
   4. Приготовьте рабочий раствор CFSE с объемом 0,5 мкм в PBS, используя стандартный раствор объемом 5 мм, разбавляя 1 мкл 5 мМ запаса CFSE в 10 мл PBS в 15-мл конической центрифугной трубке.
      ВНИМАНИЕ: CFSE — это реактивный амин-связывающий флуоресцентный краситель, который может представлять риск при контакте с кожей или глазами. Обращайтесь с соответствующими средствами индивидуальной защиты и утилизируйте неиспользованный реагент в соответствии с местными рекомендациями по биобезопасности.
   5. Отбросьте супернатант.
   6. Повторно суспензировать гранулу примерно в 1 × 10⁶ клеток/мл в растворе CFSE.
   7. Инкубировать 15 минут при 37°C, обёрнув трубку в алюминиевую фольгу или поместить в непрозрачный контейнер для защиты от света.
   8. Затушите реакцию, добавив 5–10 томов культурной среды.
   9. Инкубировать 5 минут при 37°C.
   10. Центрифугные ячейки (5 мин, 300 × г, RT, ускорение = максимум; замедление [тормоз] = максимум).
   11. Отбросьте супернатант.
   12. Суспендировать клетки при 2,5 × 10⁵ клеток/мл так, чтобы 100 мкл содержали 2,5 × 10⁴ клеток.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Переходите непосредственно к бронированию, чтобы поддерживать стабильную интенсивность сигнала CFSE и жизнеспособность целевой клетки.
3. Пластинчатые мишени
   1. Получите пластину с круглым дном и 96 колодцами.
   2. Добавьте 100 мкл/л/скважину целевых ячеек (2,5 × 10⁵ ячеек/мл) в назначенные скважины с помощью многоканальной пипетки (см. дополнительный рисунок 2). Каждое состояние оформляется в тройном экземпляре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что суспензия ячейки однородна перед нанесением пластины.
4. Подготовьте и добавьте антитела
   1. Подготовьте 200 мкл раствора антител с концентрацией 4× (100 мкг/мл) в среде культуры NK-клеток для каждого тестового антитела и сопоставленного контроля изотипов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап модульный и может быть адаптирован к любому антителу, опосредующему ADCC против выбранной целевой линии. Концентрации и составы антител могут различаться; Соответственно регулируйте разбавления. Консерванты, такие как азид, могут влиять на выживаемость целевых клеток и их функциональность. Хотя можно проверять различные концентрации антител, здесь используется итоговая концентрация 25 мкг/мл.
   2. Перенесите растворы антител на пластину глубокой скважины.
   3. Добавьте 50 мкл/скважину раствора антител для целевых клеток и тщательно перемешайте пипеткой ≥5 раз.
   4. Добавьте 50 мкл/скважину среды NK-клеточной культуры в контрольные колодцы без антител и тщательно перемешайте пипеткой ≥5 раз.
   5. Инкубировать 25–30 минут при 37°C с 5% CO₂.
5. Подготовьте и добавьте NK-ячейки
   1. Подсчитайте и получите 2 × 10⁵ NK-клеток с использованием метода подсчёта клеток на основе красителей (например, трипан-синий) или аналогичного валидированного метода. Этого числа достаточно для трёх состояний, содержащих NK-ячейки, покрытых в тройной части, а избыток — для учёта потерь при пипетировании (см. дополнительный рисунок 2). Продолжайте, если жизнеспособность составляет ≥75%, так как низкая жизнеспособность может повлиять на результаты анализа.
   2. Ресуспензировать клетки до 2,5 × 10⁵ клеток/мл в 800 мкл первичной среды человеческой NK-клеточной культуры (конечная концентрация = 1,25 × 10⁴ клеток/50 мкл).
   3. Добавьте 50 мкл/скважину NK-ячеек в соответствующие скважины и тщательно перемешайте с помощью пипетирования ≥5 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что суспензия ячейки однородна перед нанесением пластины.
   4. Добавьте 50 мкл/скважину посевной среды для контроля скважин и тщательно перемешайте пипеткой ≥5 раз.
6. Установите окончательную совместную культуру
   1. Тщательно осмотрите круглодонную пластину на 96 лунок и убедитесь, что во всех скважинах 200 мкл с равномерным уровнем мениска и отсутствием пузырьков.
   2. Центрифуга пластины (2 мин, 100 × г, ускорение = низкое [например, 2]; замедление [тормоз] = низкое [например, 2]).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот мягкий спин важен для быстрого оселения клеток и увеличения контакта между клетками. Мы используем настольную центрифугу Eppendorf 5810R, совместимую с ротором с качающимися роторами, с настройками ускорения и торможения, установленными на 2 (из 9).
   3. Инкубировать 16–18 часов (ночью) при 37°C с 5% CO₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта длительность инкубации оптимизирована для показания цитотоксичности, а не для дегрануляции, которую лучше всего оценивать путём измерения экспрессии CD107a в более ранние временные моменты (2–6 ч). Поэтому пиковые реакции на дегрануляцию могут недооцениваться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не продлевайте инкубацию дальше 18 часов, так как длительное совместное выращивание может привести к чрезмерной гибели целевых клеток в контрольных скважинах и сокращению динамического диапазона между экспериментальными условиями.
7. Проведите проточную цитометрию
   1. Центрифуга (5 мин, 300 × г, ускорение = максимум; тормоз = максимум).
   2. Отбросьте супернатант.
   3. Промывайте все скважины 200 мкл/скважина буфера FACS (2% FBS, 2 мМ EDTA в PBS).
   4. Подготовьте мастер-микс поверхностных антител в буфере FACS, добавив CD56-BV421 при разбавлении 1:50, CD16-BV785 при разбавлении 1:50 и CD107a-PE-Cy7 при разбавлении 1:25.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте общий объём мастер-смеси на основе экспериментальной конструкции пластины (количество скважин × 50 мкл/скважина + 20% избыточно). Клоны антител могут различаться по интенсивности окрашивания и доступности эпитопов. Клоны, используемые в репрезентативных данных, перечислены в Таблице материалов, и альтернативные клоны могут потребовать титрирования. Дополнительные антитела могут быть включены для фенотипирования подмножества NK-клеток (например, KIRs, NKG2A/C/D и CD57) и маркеров активации (например, CD69 и HLA-DR).
   5. Суспензировать клетки в 50 мкл/скважину мастер-микса антител и тщательно перемешать пипетировкой ≥5 раз.
   6. Инкубировать 15 минут при 4°C, обёрнув пластину в алюминиевую фольгу или поместить в непрозрачный контейнер для защиты от света.
   7. Добавьте 150 мкл/скважину буфера FACS.
   8. Центрифуга (5 мин, 300 × г, ускорение = максимум; тормоз = максимум).
   9. Отбросьте супернатант.
   10. Ресуспензировать клетки в 100 мкл/скважину 5 мкм 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в буфере FACS и немедленно приступить к взятию потоковой цитометрии. Предварительная инкубация не требуется.
   11. Собирайте данные с помощью потоковой цитометрии и фиксируйте флуоресцентные каналы для CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI и любых дополнительных флуорофоров.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки захвата (например, напряжения детектора, компенсация и гейтинг) могут потребовать оптимизации. Используйте неокрашенные и однократные контроли для компенсации и настройки гейтинга, с компенсационными шариками или представительными ячейками по мере необходимости. Контроли флуоресценции минус один следует рассматривать для маркеров с непрерывной или тусклой экспрессией (например, CD107a). Поддерживайте единые настройки и стратегию гейтинга, включая гейтинг живых/мертвых, а также идентификацию целевых и эффекторных популяций, во всех экспериментах.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Оба шага 1 и 2 могут быть адаптированы для адгерентных целевых клеток. Семена нацелены на клетки (с соответствующими культурными средами) в плоскодонной пластине на 96 лунок за день до совместного выращивания при плотности, которая достигает примерно 70% совпадения в день анализа. После подтверждения присоединения отбросьте среду целевой клетки и замените её 100 мкл свежей NK-клеточной среды, затем добавьте эффекторные клетки для начала совместной культуры. Из-за различий в размерах и морфологии ячейки параметры анализа IncuCyte Cell-by-Cell должны быть оптимизированы для каждой клеточной линии.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализов на основе проточной цитометрии с адгерентными клетками, после совместной культуры, центрифугуйте пластину (300 × г, 5 мин) и отбрасывайте супернатант. Добавьте 100 мкл/скважину TrypLE и инкубировать при 37°C с 5%_CO2 примерно 5–15 минут (в зависимости от клеточной линии) для отделения клеток. Добавьте 100 мкл/скважину буфера FACS, перемешайте с помощью пипета вверх и вниз по кругу и перемените все ячейки на круглодонную пластину на 96 ярок. Микроскопически осмотрите колодцы для подтверждения полного отслоения перед окрашиванием (Шаг 2, Подшаг 7). Оптимизировать время инкубации TrypLE по мере необходимости для достижения подвешивания с одной ячейкой.

Результаты

Для количественной оценки цитотоксичности NK-клеток в реальном времени эффекторные клетки NK-92, спроектированные для экспрессии анти-BCMA CAR, были ко-культивированы с целевые клетки ^BCMA+ Ramos в чёрной, прозрачной пластине с плоским дном на 96 лунок и проследлены с помощью живых клеток (рисунок 1A и дополнительный рисунок 1A). Эффекторные ячейки были добавлены с коэффициентами E:T 0:1 (только целевая цель), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 и 2:1, при этом каждое состояние выполнялось в тройном экземпляре. Были оценены три различных конструкции CAR NK-92: CAR1 без костимулирующего домена, CAR2 с костимулирующим доменом 4-1BB (CD137) и CAR3 с костимулирующим доменом DAP10, а также контрольные клетки NK-92, экспрессирующие вектор только ZsGreen. Все эффекторные клетки были получены с помощью лентивирусной трансдукции, как описано^{ранее 4} с использованием трансгенных кассет ZsGreen-P2A-CAR. Мишени Рамоса аналогично трансдуцировали с помощью лентивирусного вектора, кодирующего emiRFP670. Рост и выживаемость целевых клеток отслеживались каждый час в течение 24 часов с помощью прибора живой клетки, измеряя зелёную флуоресценцию для клеток ZsGreen⁺ NK-92, оранжевую флуоресценцию для мёртвых клеток SYTOX Orange⁺ и NIR-флуоресценцию для целевых клеток emiRFP670⁺ (рисунок 1A и дополнительные рисунки 1B и 1C).

Микроскопические изображения были получены в определённые временные интервалы для визуализации эффекторных клеток, живых целевых клеток и мертвых клеток во время совместного культивирования (рисунок 1B). Количественная оценка роста и выживаемости целевых клеток показала, что клетки CAR2 и CAR3 NK-92 демонстрируют более быструю кинетику уничтожения, чем клетки CAR1 NK-92, особенно в более ранние временные моменты при соотношении E:T 1:1. Уничтожение целевых клеток увеличивалось при повышении соотношения E:T, включая контрольные клетки NK-92, которые демонстрировали естественную цитотоксичность (рисунок 1C). Эти измерения подчёркивают способность живых клеток фиксировать динамические изменения цитотоксической активности. Выживаемость целевых клеток также анализировалась как функция соотношения E:T в определённые временные моменты для сравнения мощности CAR NK-92. Клетки CAR2 и CAR3 NK-92 показали большую эффективность при более низких соотношениях E:T в более поздние временные моменты (например, E:T = 0,25:1 через 24 часа) и при промежуточных соотношениях E:T в более ранние временные точки (например, E:T = 1:1 через 4 часа) (Рисунок 1D). Значимых различий в убийстве между эффекторными клетками CAR2 и CAR3 NK-92 в анализах не наблюдалось.

Тепловая карта, интегрирующая соотношение E:T, время ко-инкубации и выживаемость целевых клеток, обеспечивает комплексную визуализацию естественной и CAR-опосредоспособной цитотоксичности во всех популяциях эффекторов и позволяет количественно оценивать. Для количественной оценки эффективности и кинетики были определены три параметра:_{KR 50} — соотношение убийцы к цели, обеспечивающее 50% уничтожения (за 12 часов); _{KT 50} — время совместной инкубации, необходимое для достижения 50% уничтожения (при соотношении E:T 1:1); и_{IKI 50} — интегрированный индекс убийцы, представляющий площадь тепловой карты выживаемости ниже 50%, определяемый 50% изоклином выживаемости (рисунок 1E). Эти метрики позволяют сравнивать мощность клеток CAR NK-92 (_{KR 50}), убийственную кинетику (_{KT 50}) и интегрированную цитотоксическую эффективность (IKI₅₀) (рисунок 1F). Этот анализ демонстрирует, как анализ может количественно сравнивать инженерные платформы NK-ячейок по множеству параметров в рамках одного эксперимента.

Проточная цитометрия с подсчётом клеток использовалась для измерения ADCC путём совместной культуры флуоресцентно маркированных целевых клеток с первичными человеческими NK-клетками при наличии или отсутствии терапевтических антител и количественной оценки остатка живых целевых клеток после 16–18 часов инкубации (рисунок 2A). Можно использовать потоковые цитометры, такие как Cytek Aurora, BD Symphony или BD Fortessa, с высокопроизводительным сэмплером. В репрезентативной системе (дополнительный рисунок 2) CD38⁺ пациент-таргетные клетки лимфомы были покрыты в круглодонной пластине с 96 лунками, а даратумумаб (или изотипный антитела) добавлялся в соответствующие колодцы. Затем NK-клетки были совместно культивированы при соотношении E:T 0,5:1 — соотношение, оптимизированном для этих целевых клеток, чтобы минимизировать естественное уничтожение при одновременном обнаружении ADCC. После инкубации была проведена проточная цитометрия для выделения популяций клеток с помощью прямого и бокового рассеяния, исключения нежизнеспособных событий с помощью DAPI и отделения целевых клеток ^CFSE+ от NK-клеток CD56⁺CD16⁺ для параллельного анализа (рисунок 2B). Такая конструкция позволяет одновременно измерять цитотоксичность и определять фенотипическую характеристику.

Рисунок 2. Анализ клеточной цитотоксичности на основе антителозависимых клеток (ADCC) позволяет одновременно количественно оценивать выживаемость целевых клеток и активацию NK-клеток. (A) Схематический обзор анализа ADCC. Мишевые клетки CD38⁺ лимфомы с меткой CFSE были покрыты 2,5 ×^{10 4} клеток на скважину и культивированы при пяти условиях: только целевые клетки; целевые клетки с даратумумабом (25 мкг/мл); целевые клетки с NK-клетками (E:T = 0,5:1); целевые клетки с NK-клетками и даратумумабом; а также целевые клетки с антителами контроля NK-клеток и изотипа (25 мкг/мл). (B) Стратегия репрезентативного потокового цитометрического гейтинга. События сначала ограничивались прямым и боковым рассеянием, затем исключались нежизнеспособные ячейки с помощью DAPI. Целевые клетки были идентифицированы как события ^CFSE+, а NK-клетки — как события CD56⁺ и CD16⁺. Дегрануляция NK-клеток оценивалась по экспрессии CD107a. (C) Количественная оценка выживаемости целевых клеток, выраженная в процентах относительно контролируемого условия только мишени (установленная в 100%). (D) Количественная оценка дегрануляции NK-клеток, представленная как процент CD107a⁺ клеток внутри популяции NK-клеток. Бары представляют среднее ± стандартное отклонение, а наложенные точки — отдельные реплицируемые скважины (n = 3). Статистический анализ проводился с использованием одностороннего анализа дисперсии с использованием пост-хок многократного сравнения теста Тьюки. Статистическая значимость указывается следующим образом: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Основная конечная точка — выживаемость целевой клетки, рассчитанная внутри живого вентиля ^CFSE+ и нормализованная до состояния только целевой клетки, которая установлена на 100% выживаемости. Эта нормализация контролирует спонтанную потерю целевой клетки и позволяет проводить прямое сравнение между условиями. В репрезентативных данных (рисунок 2C) добавление даратумумаба само по себе не снижало выживаемость целевых клеток, что подтверждает, что антитело не оказывает прямого влияния на жизнеспособность мишени при отсутствии эффекторных клеток. Совместная культура с NK-клетками только снижала выживаемость целевых клеток примерно до 70%, что указывает на исходную естественную цитотоксичность. Добавление даратумумаба дополнительно снизило выживаемость примерно до 37%, что соответствует усиленному антитело-опосредованному убийству, тогда как изотипное контрольное состояние показало выживаемость примерно 62%, сопоставимое с состоянием только NK. Успешные эксперименты показывают чёткое разделение между состояниями, обработанными антителами, и контролем с высокой воспроизводимостью между репликами.

Вторичное фенотипирование NK-клеток обеспечивает дополнительное подтверждение связи между уничтожением целевой клетки и активацией эффектора. Дегрануляция NK-клеток, измеряемая в проценте CD107a⁺ NK-клеток, была наименьшей в кокультуре NK-целевых клеток без антител и наивысшей в состоянии, обработанном даратумабом (примерно 31%), при этом контроль изотипа показал промежуточную дегрануляцию (примерно 19%), поддерживающую активацию, опосредованную антителами (рисунок 2D)). Эти результаты показывают, что анализ может отличить уничтожение целевых клеток от активации эффектора. Хотя тенденции дегрануляции и выживаемости в целом совпадают, они не полностью пересекаются, что указывает на то, что представляют собой связанные, но отдельные биологические процессы.

Субоптимальные эксперименты обычно показывают снижение разделения между условиями, вариабельность количества клеток в разных скважинах, высокую гибель целевых клеток в контрольных скважинах, слабое окрашивание CFSE или повышенную фоновую дегрануляцию. Эти результаты могут быть вызваны низкой жизнеспособностью целевых клеток, непоследовательным восстановлением NK-клеток, недостаточной смешиваемостью или изменчивостью окрашивания и приобретения. Поскольку анализ независимо определяет мишенные и эффекторные компартменты, его можно расширить, включив дополнительную фенотипизацию целевых клеток (например, плотность антигена или экспрессию лиганда) и более широкую характеристику NK-клеток. Включение состояния «только NK» может дополнительно количественно оценить исходную дегрануляцию и жизнеспособность NK-клеток. Такой многопараметрический дизайн является ключевым преимуществом, позволяющим интерпретировать функциональную цитотоксичность наряду с механистическими иммунными фенотипами.

Дополнительный рисунок 1. Рабочий процесс репрезентативного планирования и анализа пластины для цитотоксического анализа живых клеток. (A) Репрезентативная схема пластин с 96 скважинами для теста CAR NK-ячейки. Четыре условия эффекторных клеток расположены по квадрантам, каждое из которых тестируется с коэффициентами E:T: 0:1 (контрольный только цель), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 и 2:1, при этом каждое состояние выполняется в тройном экземпляре (всего 60 анализных ямак). (B) Репрезентативная конфигурация неадгезентного анализа Cell-by-Cell в программном обеспечении IncuCyte 2021C, иллюстрирующее спектральные параметры смешивания, сегментации и маскировки, используемые для идентификации отдельных эффекторных и целевых ячеек с исключением обломков и агрегатов. (C) Репрезентативная стратегия классификации клеточных клеток с использованием флуоресценции NIR и SYTOX Orange для определения живой популяции целевых клеток. Для подтверждения разделения живых и мёртвых клеток используются скважины только с целевой и совместной культивацией в примерной точке времени (t = 4 часа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2. Репрезентативная схема пластин для анализа ADCC на основе цитометрии потока. Репрезентативная схема пластин с 96 лунами, иллюстрирующая пять экспериментальных условий, покрытых в тройных вариантах по строкам B–D и столбцам 2–6 (общее количество анализных колодц = 15): (1) контрольная только цель, (2) целевые клетки с даратумумабом, (3) целевые клетки с NK-клетками, (4) целевые клетки с NK-клетками и даратумумабом, и (5) целевые клетки с NK-клетками и антителами контроля изотипов. Целевые клетки были покрыты с 2,5 × 10⁴ ячейки на скважину, а NK-клетки добавлялись при 1,25 × 10⁴ ячейки на скважину для достижения соотношения E:T 0,5:1. Антитела применялись при конечной концентрации 25 мкг/мл. Окружающие скважины были заполнены PBS для минимизации испарения. Условие только мишени использовалось для нормализации выживаемости целевых клеток, а контроль изотипа учитывал эффекты формулировки антител независимо от специфичности антигена. Оптимизация соотношения E:T может потребоваться в зависимости от восприимчивости целевой клеточной линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Эти протоколы предлагают два взаимодополняющих подхода для количественной оценки цитотоксичности NK-клеток в стандартизированном формате пластин с 96 лунами. Шаг 1 использует изображение живых клеток в реальном времени для непрерывного мониторинга потери целевой клетки и хорошо подходит для оценки кинетики естественного и CAR-опосредованного уничтожения при различных соотношениях E:T. Шаг 2 использует проточную цитометрию для количественной оценки АДЦЦ после определённого периода коинкубации, одновременно разделяя целевые и эффекторные компартменты для фенотипического^{анализа 17}. Эти методы, представленные как дополнительные платформы для моделирования различных биологических процессов, также легко взаимозаменяемы. Первичные человеческие NK-клетки могут использоваться для тестов ADCC на основе живых клеток, а также могут быть спроектированы для CAR-опосредованного уничтожения в проточной цитометрии. Кроме того, хотя клетки дикого типа NK-92 не имеют экспрессии^{CD16 18}, введение CD16 (например, через лентивирусную трансдукцию) легко позволяет клеткам NK-92 опосредовать мощный ADCC. Таким образом, оба анализа могут быть адаптированы под индивидуальные научные и трансляционные потребности.

Существует несколько этапов, особенно важных для воспроизводимости в обоих анализах. Небольшие изменения количества эффекторных клеток и фенотипа могут существенно изменить выживаемость целевых клеток. Точный подсчёт клеток и тщательная ресуспензия при нанесении пластины необходимы для минимизации отклонений в подсчёте клеток и неполного смешивания. Аналогично, подготовка клеток должна быть согласована между экспериментами, включая жизнеспособность, время восстановления и предыдущее воздействие цитокинов, чтобы обеспечить равномерную работу эффектора. Геометрия пластин — ещё один ключевой фактор, определяющий результаты анализа. В процессе изображения живых клеток пластины с плоским дном обеспечивают стабильное получение изображений и последовательный анализ поля, тогда как в процессе потоковой цитометрии пластины с круглым дном способствуют контакту между клетками и способствуют восстановлению неадгезентных кокультур в конечной точке. Кроме того, качество флуоресцентной маркировки должно быть подтверждено до проведения анализа, так как плохое различение целевых клеток с помощью визуализации или слабое разделение CFSE с помощью проточной цитометрии нарушают количественную оценку и интерпретацию.

Эти два рабочих процесса представляют собой разные технические особенности. В анализе живых клеток распространёнными причинами низкого качества данных являются неравномерное покрытие клеток, плотное скопление или скопление клеток, а также неоптимальные пороги анализа изображений, все из которых легко корректироваться. Эти проблемы могут искажать количество клеток и приводить к непоследовательному отслеживанию со временем. В анализе на основе проточной цитометрии субоптимальные результаты чаще вызваны высокой фоновой гибелью целевых клеток, слабым разделением целевых и эффекторных популяций, плохой окрашиванием антител или непоследовательным пипетированием между размножающимися колодцами. Поскольку эти анализы предназначены для сравнительного анализа, включение соответствующих внутренних контролей крайне важно для интерпретации, включая целенаправленные контроли для нормализации и сопоставленные отрицательные контроли для специфических для антител или CAR-специфичных состояний.

При использовании этих методов необходимо учитывать несколько общих и специфичных для анализа ограничений. Анализ живых клеток обеспечивает временное разрешение, но зависит от точной флуоресцентной маркировки и параметров анализа изображений, оба из которых могут зависеть от кластеризации клеток, спектрального перекрытия или изменений морфологии во время совместной^{культуры 15}. В некоторых случаях, особенно при анализах с участием первичных эффекторных клеток, достижение достаточной флуоресцентной маркировки без изменения динамики убийства сложно или невозможно. Анализ на основе проточной цитометрии обеспечивает более высокое фенотипическое разрешение на определённой конечной точке, но не различает независимо раннее и позднее уничтожение, если не собрано несколько согласованных временных точек, что может быть дорогостоящим и^{трудоёмким 17}. Кроме того, измерения конечных точек могут отражать не только гибель целевых клеток, но и различия в пролиферации целевых клеток, истощении эффекторов или восстановлении при обработке образцов. Механистические показатели, такие как CD107a, поэтому лучше интерпретировать как комплементарные индикаторы активации эффекторных клеток, а не как прямые заменители элиминации целевой^{клетки 19}. В более широком смысле, ни одна из платформ не воспроизводит полностью пространственную архитектуру, стромальные взаимодействия, градиенты цитокинов или ограничения трафика, формирующие функции NK-клеток in vivo.

При интерпретации тестов уничтожения NK-клеток также необходимо учитывать несколько биологических факторов. Вариабельность между донорами является неотъемлемой частью экспериментов с первичными человеческими NK-клетками, которые различаются по цитотоксическому потенциалу и составу подмножества из-за возраста донора, пола, истории инфекционных заболеваний и полиморфизма^{рецепторов 20}. Использование клеток NK-92 значительно снижает вариабельность, но эти клетки всё равно могут проявлять изменения, связанные с источником и^{проходом 18}. Наш протокол смягчает технические или экспериментальные различия с помощью стандартизированных параметров и сравнения одинаковых пластин для более точной оценки этих биологических факторов. Где это возможно, мы рекомендуем использовать определённые диапазоны проходов NK-92 с фиксированными порогами жизнеспособности. Для первичных NK-клеток анализы должны использовать NK-клетки от нескольких доноров для каждого состояния, при этом статистический анализ учитывает вариабельность между донорами (например, парные или смешанные эффекты), поскольку относительные различия между заболеваниями обычно сохраняются у разных доноров. Кроме того, дополнительные маркеры NK-клеток (например, KIRs, NKG2A/C/D и CD57) могут быть включены в панели антител, используемые для цитометрии потока, для сравнения частот подмножества у доноров и оценки специфической активности NK-клеток (например, экспрессии CD107a и CD69), что дополнительно облегчает интерпретацию результатов. Наконец, для всех тестов уничтожения NK-клеток необходимо учитывать дополнительные сценарии. Экспрессия таргетных антигенов на NK-клетках, будь то через эндогенную экспрессию или приобретение антигенов из целевых клеток через трогоцитоз, может привести к NK-клеточному братоубийству и запутать результаты. Например, даратумумаб может нацелиться на CD38, экспрессируемый на NK-клетках, и индуцировать^{братоубийство 21}, ограничивая величину ADCC относительно целенаправленных целей. К счастью, изображения живых клеток и проточная цитометрия позволяют количественно оценивать NK-клетки для оценки братоубийства.

Несмотря на эти ограничения, совместное использование изображения живых клеток и потоковой цитометрии предоставляет практическую основу для воспроизводимого функционального тестирования NK-клеток в различных базовых и доклинических приложениях. Рабочий процесс визуализации полезен, когда важно временное поведение, например, для различения быстрых и отложенных цитотоксических реакций или для сравнения кинетики убийства между конструкциями^{CAR 22}. Рабочий процесс, основанный на проточной цитометрии, полезен, когда функциональные показания необходимо интерпретировать вместе с фенотипами эффекторных и целевых клеток в одном образце. Вместе эти подходы позволяют количественно оценивать естественное уничтожение, цитотоксичность, опосредованную CAR, и ADCC с использованием широко доступных экспериментальных платформ. Создавая стандартизированную и масштабируемую структуру, эта система способствует строгому бенчмаркингу и механистическому анализу по всем методам, основанным на NK-клетках, ускоряя разработку и клиническую трансляцию иммунотерапии следующего поколения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Advanced RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	12633020	Базальная среда для культуры человеческих НК-клеток NK-92 и первичных (см. протокол для полной формулировки)
Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)	BioLegend	328618	Маркер дегрануляции для проточной цитометрии
Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)	BioLegend	302046	Проточная цитометрия
Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)	BioLegend	318328	Проточная цитометрия
Столбовый центрифуга с вращающимся барабанным ротором, совместимый с 15-мл пробирками и 96-лунковыми пластинками (Eppendorf Centrifuge 5810R)	Eppendorf	5811000015	Используется для осаждения клеток и центрифугирования пластинок (100–300 × g)
Карбоксифлуоресцеиновый сукцинимидильный сукцинат (CFSE)	Thermo Fisher Scientific	C34554	Краситель для показа пролиферации клеток для маркировки целевых клеток
Спектральный поточный цитометр Cytek Aurora (или эквивалент)	Cytek Biosciences	N7-00003	Используется для регистрации и анализа поточной цитометрии
DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол)	BioLegend	422801	Ядерное окрашивание для дифференциации живого/мертвого
96-лунковая пластинка с глубокой пробиркой	USA Scientific	1896-2110	Используется для приготовления антител
Диметилсульфоксид (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Реагент для криоконсервирования
Фетальный бычий сыворотка (FBS)	Avantor	76419-584	Дополнение базального среды; используется в буфере FACS (2% FBS)
Общего назначения водяная баня, 10 л (37 °C)	PolyScience	WBE10	Для разморозки клеток
GlutaMAX (добавка L-аланил-L-глутамина)	Thermo Fisher Scientific	35050061	Стабильный источник глутаминовой кислоты
Человеческая AB сыворотка	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	Дополнение для культуры первичных человеческих НК-клеток
Система изображения живых клеток IncuCyte SX5	Sartorius	4816	Изображение живых клеток в реальном времени и анализ клетка-за-клеткой
LUNA-FL двойной флуоресцентный счетчик клеток (или эквивалент)	Logos Biosystems	L20001	Автоматизированное подсчет клеток
Parafilm M (4 дюйма × 250 футов в рулоне)	Genesee	16-101	Герметизация и хранение пластинок
Фосфатно-буферный раствор (PBS), стерильный (pH 7,2–7,4)	Corning	21-020-CV	Используется для промывания и приготовления буфера FACS
Поли-D-лизин (0,1 мг/мл)	Thermo Fisher Scientific	A3890401	Реагент для покрытия пластинок
Примоцин	InvivoGen	ant-pm-2	Антибиотик
Рекомбинантный интерлейкин-2 человека (IL-2)	R&D Systems	202-IL-500	Цитокин
RosetteSep набор для обогащения человеческих НК-клеток	STEMCELL Technologies	15065	Коктейль обогащения человеческих НК-клеток
SYTOX Orange окрашивание мертвых клеток	Thermo Fisher Scientific	S34861	Краситель жизнеспособности для изображения живых клеток
Трипановый синий 0,4%	Gibco	15250-061	Краситель жизнеспособности для подсчета клеток
TrypLE Express Enzyme (1X), без фенол-красного	Thermo Fisher Scientific	12604039	Для отсоединения адгирированных клеток
UltraPure ЭДТА (0,5 М, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientific	15575020	Используется для приготовления буфера FACS
15-мл конусообразные пробирки для центрифугирования с дном	Corning	352097	Стерильные
24-лунковая тканевая культура пластинка (обработанная для культуры тканей)	Corning	3524	Используется для восстановления НК-клеток
96-лунковая прозрачная округлая пластинка с круглым дном (обработанная для культуры тканей)	Corning	3799	Используется для сокультивации и анализов поточной цитометрии
96-лунковая плоская прозрачная черная полистирольная пластинка (обработанная для культуры тканей)	Corning	3603	Совместим с системами изображения живых клеток