Исследование сетевой фармакологии и молекулярного стыкинга формулы TongBi для остеоартрита

RuiGe Liang; Wei Zhang; Jin Xiong; Yi Peng; Jun Hu

doi:10.3791/71487

Исследовательская статья

Исследование сетевой фармакологии и молекулярного стыкинга формулы TongBi для остеоартрита

DOI:

10.3791/71487

⸱

3 июля 2026 г.

RuiGe Liang¹ , Wei Zhang¹ , Jin Xiong¹ , Yi Peng¹ , Jun Hu¹

¹Department of Traditional Chinese Medicine, Suining First People's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол прогнозирует потенциальные терапевтические цели и молекулярные механизмы формулы TongBi против остеоартрита с помощью сетевой фармакологии и молекулярного докирования.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании применялась сетевая фармакология в сочетании с молекулярным докированием для прогнозирования потенциальных терапевтических мишень и молекулярных механизмов формулы TongBi (TBF) при остеоартрите (ОА). Активные компоненты и соответствующие мишени TBF были получены из базы данных и анализа традиционной китайской медицины Systems Pharmacology Database, а связанные с ОА мишени — из Online Mendelian Inheritance in Man, GeneCards, DrugBank и Therapeutic Target Database. Для построения сетей взаимодействия соединений–мишень и взаимодействия белок–белок (PPI) использовалось программное обеспечение для визуализации и анализа сети. Функциональная аннотация генной онтологии и анализ обогащения путей генов и геномов в Киотской энциклопедии генов и геномов проводились с использованием платформы Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery. Анализ молекулярного стыковки проводился с помощью программного обеспечения молекулярного стыковки для оценки прогнозируемой сродства связывания между ключевыми активными соединениями и белками основных целевых компонентов. Было выявлено всего 47 пересекающихся целей между TBF и OA. Анализ сети PPI выделил JUN, RELA, IL6, MAPK1 и IL10 как потенциальные цели для хаба. Анализ обогащения показал, что TBF может регулировать воспаление, липидный метаболизм и несколько внутриклеточных сигнальных путей, связанных с прогрессированием ОА. Результаты молекулярного докинга показали благоприятные прогнозируемые сродства связывания между активными ядрами и ключевыми белковыми мишеньями, связанными с ОА. Эти результаты предоставляют вычислительную основу для понимания потенциальных механизмов TBF против OA и поддерживают дальнейшую экспериментальную валидацию.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Остеоартрит (ОА) — это дегенеративное воспалительное заболевание суставного^{хряща 1}. В настоящее время примерно 58 миллионов взрослых страдают от ОА, и ожидается, что к 2040 году эта цифра вырастет до 78,4 миллиона^. ОА является распространённой причиной болей в суставах и функциональных нарушений во^{всём мире 3}. Из-за сильной боли, связанной с ОА, пациенты часто испытывают значительную инвалидность в^{повседневной жизни 4}. Возраст, женский пол, ожирение и повреждение суставов — основные факторы риска^{OA 5}. Хотя распространённость ОА чрезвычайно высока и оказывает значительное влияние на системы здравоохранения, доступные варианты лечения остаются^{ограниченными 6}. Современная медицина часто применяет симптоматические методы лечения, такие как нестероидные противовоспалительные препараты и защитные средства для хряща. Однако длительное применение часто вызывает побочные реакции, включая повреждение желудочно-кишечного тракта и нарушения функции печени и^{почек 7}. Поэтому существует острая необходимость разработать новые методы лечения или альтернативные методы лечения ОА.

Традиционная китайская медицина (ТКМ) накопила обширный опыт в лечении ОА, делая акцент на дифференциации синдромов и холистической регуляции. Формула ТунБи (TBF) — это классический рецепт, в основном состоящий из Дангуй, Даньшэнь, Цзисюэтэн, Хайфэнтэн, Тоугуцао, Духуо, Вэйлинсянь и Сянфу. С точки зрения ТКМ, патологическая природа ОА в основном возникает из-за вторжения ветра и холода и влажности и застоя ци^{и крови 8}. Совместимость ТБФ с травами разработана так, чтобы соответствовать этому основному патологическому механизму, при этом все лекарственные компоненты действуют синергетически, рассеивая ветер и влажность, дноуглубляя меридианы и стимулируя кровообращение, что соответствует типичным признакам синдрома ТКМ при ОА. Растущие клинические исследования показывают, что модифицированный TBF может облегчать боль в суставах и улучшать моторную функцию конечностей у пациентов с^{OA 9}. Дальнейшие клинические наблюдения также показали его потенциал для регулирования воспалительных реакций в случаях^{ОА 10}, а недавний мета-анализ дополнительно подтвердил его клиническую применимость для вмешательства при^{ОА 11}.

TBF традиционно используется для рассеивания ветра, разблокировки каналов, рассеивания холода, устранения влаги, а также улучшения кровообращения и питания. Однако конкретные механизмы, с помощью которых ТБФ оказывает потенциальное терапевтическое воздействие на ОА, остаются неясными, а его активные компоненты и ключевые цели пока не определены. Для более систематического и всестороннего изучения этих механизмов мы применили подход сетевой фармакологии для построения карты сети, иллюстрирующей взаимосвязи между лекарствами, мишенями и^{заболеваниями 12}. Кроме того, были проведены анализы обогащения генной онтологии (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) для изучения потенциальных молекулярных механизмов и сигнальных путей, участвующих в фармакологическом действии^TBF-13. Для систематического изучения фармакологических механизмов рецептов на ТКМ было создано полноценный аналитический рабочий процесс, охватывающий скрининг активных ингредиентов, прогнозирование целей, построение сети, функциональный анализ обогащения и молекулярное стыкинг. Такая исследовательская основа признана стандартизированной и воспроизводимой парадигмой для изучения молекулярных механизмов формул ТКМ по сравнению с^{OA 14}. Существующие методологические исследования дополнительно подтверждают научную рациональность и практическую применимость этой исследовательской^{стратегии 15}. Помимо методологической стандартизации, настоящее исследование помогает определить материальную основу и основные нормативные цели TBF в OA. Кроме того, он предоставляет теоретические справочные материалы для клинического применения и будущей экспериментальной валидации TBF, а также предлагает реалистичную методологическую основу для механистического изучения других рецептов ТКМ.

В этом исследовании мы использовали подход сетевой фармакологии для скрининга активных компонентов и построения сети соединения-мишень в сочетании с генами, связанными с ОА. Впоследствии для механистических исследований были проведены функциональный анализ обогащения и молекулярное стыковка. Сетевая фармакология интегрирует биологическую и фармакологическую информацию для изучения взаимосвязей между лекарством, мишей и болезнью с комплексной и^{многогранной точки зрения 16}. Мы считаем, что такой подход может помочь прояснить потенциальные фармакологические механизмы TBF и стать теоретической основой для последующих экспериментальных исследований. Рабочий процесс исследования представлен на рисунке 1.

figure-introduction-1
Рисунок 1. Рабочий процесс проектирования сетевой фармакологии и молекулярного стыкинга. Схематический обзор аналитического рабочего процесса, используемого для изучения возможных механизмов формулы TongBi (TBF) против остеоартрита (ОА). Рабочий процесс включал скрининг активных соединений, прогнозирование целей, сбор мишеней, связанных с OA, анализ пересечений, построение сетей, анализ взаимодействия белков и белков (PPI), анализ обогащения по Генной онтологии (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG), а также валидацию молекулярного стыкинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании не участвовали люди, позвоночные животные или образцы тканей. Все анализы проводились с использованием общедоступных биоинформатических баз данных и методов молекулярного стыковки; поэтому этическое одобрение не требовалось.

Скрининг компонентов и соответствующих целей TBF
Все растительные ингредиенты TBF, включая Дангуй, Даньшэнь, Цзисюэтэн, Хайфэнтэн, Тоугуцао, Духуо, Вэйлинсянь и Сянфу, были найдены в базе данных и анализа TCM Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) (дата обращения в январе 2026 года). Точные поисковые запросы соответствовали стандартизированным латинским названиям каждого травяного лекарства: Angelicae Sinensis Radix (Danggui), Radix Salviae (Danshen), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng), Caulis Piperis Kadsurae (Haifengteng), Impatiens balsamina (Tougucao), Radix Angelicae Biseratae (Duhuo), Radix Clematidis (Weilinxian) и Cyperi Rhizoma (Сянфу). Химические компоненты были скринингированы согласно фиксированным порогам пероральной биодоступности (OB) ≥ 30% и сходства с препаратом (DL) ≥ 0,18. Эти пороговые значения широко используются в исследованиях сетевой фармакологии ТКМ для выявления биодоступных и похожих на лекарства активных соединений с потенциальной активностью in vivo. Соединения, не имеющие явных значений OB или DL в базе данных, были исключены для поддержания надёжности и согласованности активного скрининга.

Соответствующие белковые мишени скринингованных активных соединений впоследствии были извлечены из фармакологии ТКМ. Стандартизация целевых генов проводилась с использованием базы данных аннотаций белков Universal Protein Resource (UniProt), при этом вид был ограничен Homo sapiens (дата обращения в январе 2026 года). Оригинальные имена белков были преобразованы в официальные символы человеческих генов, в то время как избыточные и нечеловеческие мишени были вручную исключены. Дублирующиеся цели удалялись вручную с помощью сравнения и сопоставления для создания окончательного набора целей TBF.

Выявление мишеней, связанных с ОА, и потенциальных терапевтических мишеней ТБФ при ОА
Связанные с ОА мишени были извлечены с использованием точного поискового слова «Остеоартрит» в базах данных Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), GeneCards, DrugBank и Therapeutic Target Database (TTD) (дата обращения в январе 2026 года). Дублирующиеся цели, полученные из разных баз данных, удалялись вручную путём сбора и сравнения данных для создания набора целевых данных, связанных с OA. Для GeneCards сохранялись только цели с показателем релевантности ≥ 3. Мишени, полученные из OMIM, DrugBank и TTD с использованием ключевого слова «остеоартрит», не подвергались дополнительным критериям фильтрации. Перекрывающиеся мишени между активными соединениями, связанными с ОА, были выявлены с помощью онлайн-инструмента анализа Venn 2.1.0. Анализ пересечения был проведён для определения потенциальных терапевтических целей TBF против OA.

Строительство сети TBF–Компонент–Целевые
Данные взаимодействия компонент–цель были импортированы в программное обеспечение визуализации и анализа сети Cytoscape 3.10.2 для построения сети TBF–Компонент–Цель (доступ в январе 2026 года). В сконструированной сети узлы представляли растительные соединения и гены-мишени, тогда как края — взаимодействия между активными соединениями и соответствующими мишенями. Чтобы избежать избыточного анализа, дублирующиеся соединения, общие для нескольких трав, объединялись в один уникальный узел. Впоследствии был проведен сетевой топологический анализ с использованием значения степени в качестве основного параметра оценки. Основные активные соединения были идентифицированы по степени и отобраны в качестве кандидатов на лиганды для последующего анализа молекулярного стыкинга.

Строительство сети PPI
Потенциальные терапевтические мишени были импортированы в базу данных STRING PPI для анализа PPI (дата обращения: январь 2026). Параметр вида был ограничен Homo sapiens, а минимально требуемый показатель доверия к взаимодействию был установлен на уровне 0,9, при этом все оставшиеся параметры оставались на стандартных настройках. Сгенерированные данные взаимодействия экспортировались и далее визуализировались с помощью программного обеспечения для визуализации и анализа сети. Топологический анализ сети PPI проводился с помощью плагина сетевого топологического анализа CytoHubba. Для оценки важности узлов в сети взаимодействия рассчитывались степень, центральность промежуточности и центральность близости. Основные целевые белки были выявлены на основе интегрированных топологических характеристик и отобраны для последующего анализа молекулярного стыкинга. Алгоритм Максимальной Центральной Клики был принят для отбора целей хаба. Узлы без взаимодействующих партнёров исключались, что приводило к меньшему числу узлов в конечной сети, чем в исходном импортированном целевом наборе данных.

GO и KEGG
Были проведены анализ функционального обогащения GO и анализ обогащения путей KEGG для изучения потенциальных биологических функций и сигнальных путей, связанных с выявленными терапевтическими мишенями TBF против OA. Анализ ГО включал три стандартные категории онтологий: биологический процесс (BP), клеточный компонент (CC) и молекулярная функция (MF), при этом биологический процесс был выделен в качестве основного фокуса интерпретации.

Функциональный анализ обогащения проводился с использованием базы данных для аннотации, визуализации и интегрированного обнаружения (DAVID) в сочетании с программным обеспечением статистического анализа R (версия 4.3.1; дата обращения в январе 2026 года). Результаты обогащения обрабатывались и визуализировались с помощью пакета clusterProfiler , при этом функции dotplot и barplot использовались для генерации диаграмм обогащения. Все целевые гены были аннотированы на фоне Homo sapiens . Метод Бенджамини–Хохберга применялся для коррекции множественных испытаний, и скорректированное P-значение < 0,05 считалось статистически значимым.

Визуализация результатов обогащения GO и KEGG была выполнена с помощью онлайн-платформы анализа MicrobiomeAnalyst/MicrobiomeNet (дата обращения в январе 2026 года). Были созданы столбочные графики и пузырьковые диаграммы для отображения наиболее существенно обогащённых терминов GO и путей KEGG.

Молекулярная стыковка
Официальные имена генов и соответствующие идентификаторы Белкового банка данных (PDB) топовых основных мишень были извлечены из базы белковых аннотаций17, а их трёхмерные кристаллические структуры были скачаны из RCSB PDB (дата обращения в феврале 2026 года). Для каждого целевого белка цепь A сохранялась в качестве рецепторной структуры, в то время как избыточные белковые цепи, гетероатомы и несвязанные структурные фрагменты удалялись в процессе подготовки рецепторов. Трёхмерные структуры активных основных соединений были извлечены из базы данных PubChem (дата обращения: февраль 2026 года). В этом исследовании кверцетин был выбран в качестве репрезентативного докинг-лиганда, поскольку он проявил наивысшую топологическую центральность в компонентно-целевой сети и является хорошо охарактеризованным флавоноидом с защитными эффектами против патогенеза ОА.

Предварительная обработка рецепторов и лиганды проводилась с использованием программного обеспечения для подготовки молекулярного стыковки, включая удаление молекул воды, добавление атомов водорода, обработку протонирования и распределение заряда по Гастейгеру. Анализ молекулярного стыковки впоследствии проводился с использованием программного обеспечения молекулярного стыковки версии 1.5.7. Размеры сеточных коробок были скорректированы так, чтобы охватить предсказанные области связывания каждого белка-мишени. Сетчатая коробка была центрирована в нативном лиганд-связывающем кармане каждого белка-мишени с равномерным размером 40 Å × 40 Å × 40 Å и расстоянием между сетками 0,375 Å. Расчёты стыковки проводились с параметром исчерпываемости 8, и для каждой пары лиганд–мишень было сгенерировано девять кандидатов конформаций связывания. Конформация стыковки с наименьшей прогнозируемой энергией связи была выбрана в качестве репрезентативной позы связи для последующего структурного интерпретирования. Валидация редокинга и сравнение положительных контрольных лигандов в этом исследовании не проводились. Все процедуры стыковки и параметры соответствовали стандартным протоколам, широко используемым в исследованиях сетевой фармакологии для поддержки надёжности прогнозируемых режимов связывания. Конформации стыковки визуализировались с помощью программного обеспечения для молекулярной визуализации версии 2.5.4. Энергия связи ≤−5,0 ккал/моль считалась признаком стабильного связывания лиганд–рецептор.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Химический состав и скрининг целей TBF
Всего было выявлено 2 активных компонента из Дангуй, 65 из Даньшэня, 24 из Цзисюэтэнга, 21 из Хайфэнтэна, 6 из Тоугуцао, 9 из Духуо, 7 из Вэйлинсяня и 18 из Сянфу. Подробная информация о отфильтрованных активных соединениях приведена в Дополнительной таблице 1. Всего было изначально обнаружено 2672 потенциальных мишеней, включая 266 для Дангуи, 689 для Даньшэня, 236 для Духуо, 188 для Хайфэнтэна, 545 для Цзисюэтэна, 192 для Тоугуцао, 102 для Вэйлинсяня и 454 для Сянфу. Подробная целевой информация представлена в Дополнительной таблице 2. После удаления дублирующих записей было получено 258 неизбыточных целей, связанных с TBF.

Сеть TBF–Компонент–Цель
Сеть TBF–Компонент–Мишень была построена на основе данных, полученных из фармакологической базы ТКМ, включая 152 активных соединения, 258 неизбыточных мишень и 8 узлов фитотерапии. Эти данные были организованы в два файла, обозначаемых как «сеть» и «тип» (дополнительная таблица 3). После импорта файлов в программное обеспечение визуализации и анализа сети была создана комплексная сеть, включающая 578 узлов и 3022 рёбер (рисунок 2). В сконструированной сети узлы представляли травяные лекарства, биоактивные соединения и соответствующие белки-мишени, тогда как края — предсказанные взаимодействия между соединениями и мишенями. Больший размер узла и более тёмная интенсивность цвета указывали на более высокие значения градусов и повышенную сетевую связь. На основе рейтинга степени, полученной в результате сетевого топологического анализа, пять основных активных соединений были определены: кверцетин (A7-MOL000098), бета-ситостерол (B8-MOL000358), лютеолин (A1-MOL000006), кемпферол (C1-MOL000422) и стигмастерол (C2-MOL000449).

figure-results-1
Рисунок 2. Сеть взаимодействия TBF–Компонент–Цель. Сетевая визуализация взаимодействий между TBF, активными соединениями и предсказанными целевые гены. Узлы представляют собой травяные лекарства, активные соединения или белки-мишени, тогда как края — предсказанные взаимодействия между соединениями и мишенями. Больший размер узла и более тёмная интенсивность цвета указывают на более высокие значения градусов и повышенную сетевую связь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Информация о целях, связанная с ОА и потенциальными терапевтическими мишенями TBF
Ключевое слово «остеоартрит» было найдено в четырёх базах данных, выявившие 428 потенциальных целей, связанных с заболеваниями, включая 9 из OMIM, 349 из GeneCards, 32 из DrugBank и 38 из TTD. Диаграмма Венна, иллюстрирующая распределение целей между четырьмя базами данных, представлена на рисунке 3. После объединения и удаления дублирующих записей было получено 398 уникальных целей, связанных с OA. Анализ пересечения между мишенями, связанными с ОА, и мишенями, связанными с активными соединениями ТБФ, выявил 47 перекрывающихся мишеней, которые считались потенциальными терапевтическими мишенями ТБФ против ОА. Соответствующая диаграмма Венна, созданная с помощью онлайн-инструмента анализа Венна, показана на рисунке 4.

figure-results-2
Рисунок 3. Диаграмма Венна целей, связанных с OA, полученных из нескольких баз данных. Диаграмма Венна, показывающая пересечение между целями, связанными с ОА, выявленными из баз данных OMIM, GeneCards, DrugBank и Therapeutic Target Database (TTD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 4. Выявление перекрывающихся целей между TBF и OA. Диаграмма Венна, показывающая пересечение между активными мишенями, связанными с соединениями, для TBF и связанных с OA. Перекрывающиеся мишени рассматривались как потенциальные терапевтические цели TBF против OA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Строительство и анализ сети PPI
Анализ сети PPI 47 перекрывающихся целей проводился с помощью базы данных PPI (рисунок 5), а затем визуализировался с помощью программного обеспечения для визуализации и анализа сети. Во время построения сети отделённые узлы, представляющие собой изолированные мишени без белковых взаимодействий (ИПП), были удалены согласно стандартным процедурам сетевой топологии, в результате чего получилась усовершенствованная сеть, содержащая 39 узлов и 108 рёбер (рисунок 6). Размер узла и интенсивность цвета отражали значения градусов, что указывает на относительную важность целей в сети.

figure-results-4
Рисунок 5. STRING PPI — сеть перекрывающихся целей. Сеть PPI, генерируемая с использованием базы данных STRING для перекрывающихся целей между TBF и OA. Узлы представляют собой целевые белки, а ребра — предсказанные ИПП. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 6. Анализ основных сетей PPI. Усовершенствована сеть PPI после удаления отключённых узлов. Размер узла и интенсивность цвета отражают значения градусов и указывают на относительную важность целей в сети. Основные цели, включая JUN, RELA, IL6, MAPK1 и IL10, продемонстрировали высокую сетевую связность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Топологический анализ сети PPI проводился с использованием плагина топологического анализа сети с алгоритмом Degree для вычисления топологических характеристик узлов. Топ-10 целей, ранжированных по степени, приведены в Таблице 1. Пять самых высоко ранжированных целей, включая JUN, RELA, IL6, MAPK1 и IL10, были выбраны в качестве основных целей для последующего анализа молекулярного стыковки на основе значения степени, центральности близости и центральности промежуточности.

Биологическая функция GO и анализ путей KEGG для TBF при остеоартрите
Анализ обогащения ГО выявил несколько биологических функций, связанных с ОА, включая активность цитокинов, связывание транскрипционных факторов и активность факторов роста, что указывает на возможное участие TBF в регуляции воспаления, транскрипционной активности и гомеостаза хряща. Топ-20 обогатённых терминов GO были ранжированы по значениям и визуализированы с помощью столбчатого графика (рисунок 7). Анализ обогащения путей KEGG был сосредоточен на сигнальных путях, связанных с ОА, включая сигнальный путь сигнализации конечных продуктов продвинутой гликации — рецептор для продвинутых гликационных продуктов, сигнальный путь интерлейкина-17 (IL-17), сигнальный путь фактора некроза опухоли (TNF) и сигнальный путь рецепторов Т-клеток, которые связаны с регуляцией воспаления, катаболизмом хондроцитов и иммунными ответами при ОА. Пути, связанные с инфекционными заболеваниями, выявленные при анализе обогащения, в данном исследовании не интерпретировались как прямые механизмы ОА. Анализ путей KEGG проводился с помощью программного обеспечения статистического анализа для создания визуализации пузырькового графика (рисунок 8). Было выявлено всего 20 значительно обогащённых сигнальных путей. Эти результаты показали, что TBF может регулировать биологические процессы и сигнальные пути, связанные с ОА, с помощью многоцелевого фармакологического механизма.

figure-results-6
Рисунок 7. Анализ обогащения GO потенциальных терапевтических целей. Бар-график, показывающий топ-20 обогащённых терминов ГО, связанных с потенциальными терапевтическими целями TBF против OA. Обогащённые термины включают биологические процессы, молекулярные функции и клеточные компоненты, связанные с воспалением, транскрипционной регуляцией и гомеостазом хряща. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-7
Рисунок 8. Анализ обогащения путей KEGG потенциальных терапевтических целей. Визуализация пузырькового графика верхней обогащённой сигнальной линии KEGG, связанных с потенциальными терапевтическими целями TBF против OA. Размер пузыря отражает количество обогащённых генов, а интенсивность цвета — уровень значимости обогащения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Проверка молекулярного стыковки
Для дальнейшего изучения возможных связывающих взаимодействий между основным активным соединением TBF и основными мишенями, выявленными из сети PPI, был проведён анализ молекулярного докирования между кверцетином, ведущим активным соединением в сети компонент–мишень, и пятью основными мишенями JUN, RELA, IL6, MAPK1 и IL10 (Таблица 2). Кверцетин проявил наивысшую топологическую значимость в сети компонент–мишень и широко описывается как репрезентативное биоактивное соединение, связанное с противовоспалительной активностью и регуляцией метаболизма^хряща ^18,19. Прогнозируемые энергии связывания составляли −8,4 ккал/моль для JUN, −7,6 ккал/моль для RELA, −6,9 ккал/моль для IL6 и −6,7 ккал/моль для MAPK1 и IL10, что указывает на благоприятные прогнозируемые сродства связывания между кверцетином и выбранными основными мишенями. Визуализация конформаций связывания лиганд–рецептор облегчила интерпретацию потенциальных молекулярных взаимодействий. Молекулярное программное обеспечение для визуализации версии 2.5.4 использовалось для визуализации оптимальных конформаций стыковки между кверцетином и пятью основными мишенями (рисунок 9–13).

figure-results-8
Рисунок 9. Молекулярная модель стыковки кверцетина с JUN (PDB ID: 1JNM). Трёхмерная молекулярная конформация кверцетина, связанного с JUN. Прогнозировалось, что кверцетин будет связываться в домене bZIP JUN и вписываться в гидрофобную связывающую полость с структурной комплементарностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-9
Рисунок 10. Молекулярная модель стыковки кверцетина с RELA (PDB ID: 7LEU). Трёхмерная молекулярная конформация стыковки кверцетина, связанного с RELA. Прогнозировалось, что кверцетин будет взаимодействовать с активной областью гомологического домена RELA через нековалентные взаимодействия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-10
Рисунок 11. Молекулярная модель стыковки кверцетина с IL6 (PDB ID: 1ALU). Трёхмерная молекулярная стыковальная конформация кверцетина, связанного с IL6. Ожидалось, что кверцетин будет занимать консервативную борозду связывания рецепторов IL6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-11
Рисунок 12. Молекулярная модель стыковки кверцетина с MAPK1 (PDB ID: 6D5Y). Трёхмерная молекулярная конформация стыковки кверцетина, связанного с MAPK1. Прогнозировалось, что кверцетин занимает АТФ-связывающий карман MAPK1, что указывает на возможные взаимодействия, связанные с киназой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-12
Рисунок 13. Молекулярная модель стыковки кверцетина с IL10 (PDB ID: 1ILK). Трёхмерная молекулярная стыковальная конформация кверцетина, связанного с IL10. Прогнозировалось, что кверцетин будет взаимодействовать вблизи димерного интерфейса IL10 и может способствовать стабилизации белкового комплекса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Доступность данных:
Все данные, подтверждающие результаты этого исследования, включены в рукопись, таблицы, рисунки и дополнительные материалы. Дополнительная таблица 1 содержит скринингированные активные соединения формулы TongBi (TBF), дополнительная таблица 2 содержит соответствующую прогнозируемую информацию о целевых целях, а дополнительная таблица 3 содержит данные о сетевом кодировании и взаимодействии, используемых для построения сетей и топологического анализа.

Джин	Название белка	Степень	Близость Центральность	Центральность между границами
ДЖУН	Транскрипционный фактор AP-1	18	0.58	0.22
RELA	Транскрипционный фактор p65	15	0.56	0.15
IL6	Интерлейкин 6	14	0.59	0.33
MAPK1	Митоген-активированная протеинкиназа 1	13	0.54	0.16
IL10	Интерлейкин 10	10	0.47	0.12
ESR1	Эстрогеновый рецептор	10	0.44	0.03
IL2	Интерлейкин 2	9	0.53	0.05
AKT1	RAC-альфа серин/треонин-протеинкиназа	9	0.44	0.04
MMP1	Матричная металлопептидаза 1	8	0.44	0.03
MMP2	Матричная металлопептидаза 2	8	0.44	0.03

Таблица 1: Топологические параметры основных целей в сети PPI. Топологические параметры основных целей, выявленных в анализе сети PPI. Степень, центральность близости и центральность между узлами были рассчитаны для оценки важности узла и выявления основных терапевтических целей, связанных с TBF по сравнению с OA. Цели с более высокими значениями степени и центральности считались более важными в сети взаимодействия.

Цель	PDB ID	Координаты активных объектов (X, Y, Z)	Лиганд	Связывающая аффинность (ккал/мол)
ДЖУН	1JNM	X = 10,201; Y = 0,493; Z = 19,492	Кверцетин	−8,4
RELA	7LEU	X = 1,717; Y = 23,889; Z = −0,778		−7,6
IL6	1ALU	X = 2,599; Y = −20,016; Z = 8.749		−6,9
MAPK1	6D5Y	X = 7,052; Y = 12.800; Z = 20.749		−6,7
IL10	1ILK	X = 17,836; Y = 46,443; Z = 38.685		−6,7

Таблица 2: Параметры молекулярного стыковения и аффинности связывания между кверцетином и белками основных мишеней. Результаты молекулярного стыкованного соединения между кверцетином и выбранными основными целевые белками JUN, RELA, IL6, MAPK1 и IL10. В таблице представлены идентификаторы Protein Data Bank (PDB), координаты сетки активного участка, используемые для расчёта стыковки, а также прогнозируемые значения аффинности связывания, полученные в результате анализа молекулярного стыковки. Более низкие значения энергии связывания указывают на более сильную предсказанную аффинность связывания лиганд–рецептор.

Дополнительная таблица 1: Активные соединения, выявленные из TBF. Подробная информация об активных соединениях, полученных из TBF, включая названия соединений, молекулярные идентификаторы, значения OB, значения DL и соответствующие травяные источники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 2: Прогнозируемые цели, соответствующие активным соединениям TBF. Полный список прогнозируемых белковых мишень, соответствующих скринингуемым активным соединениям TBF, включая стандартизированные символы генов человека, полученные после нормализации и дедупликации мишеней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 3: Информация о кодировании сети TBF–Компонент–Цель. Подробная информация о кодировании, используемая для построения сети взаимодействия компонент–цель TBF, включая молекулярные идентификаторы, информацию о целях, сетевые связи и данные классификации узлов, используемые для анализа топологии сети. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании использовались методы сетевой фармакологии и молекулярного докирования для изучения возможных механизмов TBF против OA. Основные изученные травяные препараты включали Дангуй, Даньшэнь, Цзисюэтэн, Хайфэнтэн, Тоугуцао, Духуо, Вэйлинсянь и Сянфу. Предыдущие исследования показали, что Дангуи (Angelica sinensis Radix) может облегчать патологические изменения, связанные с ОА, включая дегенерацию хряща, субхондральный костный склероз, аномальную походку и отёк колена при дестабилизации медиального мениска²⁰. В моделях клеток, индуцированных ОА, индуцированными IL-1β, Дангуй снизил накопление реактивных форм кислорода и увеличил активность антиоксидантных ферментов, включая супероксиддисмутазу и^{глутатион-21}. Danshenindione IIA, активный компонент Salvia miltiorrhiza, сообщается, что способствует облегчению дегенерации хряща, восстановлению гомеостаза субхондрального ремоделирования костей и подавлению аномального ангиогенеза в моделях OA^{мышей 22}. Кроме того, компоненты, полученные из S. miltiorrhiza, могут регулировать окислительный стресс и метаболизм^{костей 23,24}. Spatholobus suberectus Сообщалось, что Данн регулирует сигнальные пути PI3K/Akt/mTOR и Ras/Raf/^{MAPK 25}, которые связаны с метаболизмом хряща и прогрессированием ОА. Экстракты S. suberectus Dunn также подавляют выработку провоспалительных^{хемокинов 26}. Кроме того, противовоспалительная и антиоксидантная активность, сообщаемая для Impatiens balsamina, может быть релевантна для патогенеза ОА, поскольку хроническое воспаление и окислительный стресс способствуют дегенерации^{хряща 27}. Radix Angelicae Biseratae также связан с улучшением кровообращения и облегчением симптомов, связанных с^{артритом 28,29}. Ограниченные исследования изучали потенциальные терапевтические эффекты Jixueteng (Spatholobus suberectus Dunn), Haifengteng (Caulis Piperis Kadsurae) и Xiangfu (Cyperi Rhizoma) при OA.

Вычислительные прогнозы на основе сети ИПП показали, что TBF может оказывать терапевтический эффект против ОА через регуляцию воспалительных реакций и защиту суставного хряща, хотя эти прогнозы требуют дальнейшей экспериментальной проверки. Основные цели с относительно высокими значениями степеней в сети PPI включали JUN, RELA, IL6, MAPK1 и IL10. Предыдущие исследования показали, что JUN связан со старением хондроцитов и прогрессированием ОА. Двойные мутантные мыши JunB/Jun проявляют воспалительную инфильтрацию в ткани суставов, сопровождаемую разрушением костей и^{периоститом 30}. Транскриптомные анализы остеоартритного хряща и синовиума также показали снижение экспрессии^{JUN 31}. Кроме того, снижение экспрессии белка JUN наблюдалось в моделях крыс, индуцированных пересечением ОА, и стареющих^{хондроцитах 32}. Ранее исследования также предполагали, что сигнализация, связанная с JUN, может регулировать дегенерацию хряща, апоптоз, аутофагию и метаболизм внеклеточного матрикса в хондроцитах^{ОА 33}. Предыдущие исследования также показали, что фрагменты, полученные из трансферной РНК, регулируют пролиферацию и выживаемость суставных хондроцитов через сигнальные пути, связанные с^{RELA, 34}. Кроме того, арегуляция гена Sox9 в сочетании с ингибированием экспрессии RELA в мезенхимальных стромальных клетках усилили хондрогенные и иммуномодуляторные способности и замедлили прогрессирование ОА в экспериментальных^{моделях 35}. Эти результаты подтверждают потенциальную значимость сигнальных путей, связанных с JUN и RELLA, выявленных в данном вычислительном анализе.

IL6 является ключевым воспалительным медиатором при ОА и играет важную роль в метаболизме хряща, влияя как на процессы деградации, так и на восстановление. При хронических низкостепенных воспалительных состояниях повышенный уровень IL6 способствует старению хондроцитов, снижению синтеза матрикса хряща и нарушению гомеостаза^{хряща 36}. Предыдущие исследования показали, что сигнализация рецепторов IL6/JAK2 участвует в регуляции апоптоза стареющих клеток, и целенаправленное удаление стареющих клеток может замедлять прогрессирование^{ОА 37}. Кроме того, Ли Кью и коллеги сообщили, что апрегуляция miR-186-5p регулирует воспалительные реакции в хондроцитах, стимулируемых IL-1β, тогда как ингибирование miR-186-5p облегчает прогрессирование ОА за счёт усиления экспрессии^{MAPK1 38}. Эти результаты подтверждают потенциальное участие сигнальных путей, связанных с IL6 и MAPK1, выявленных в данном вычислительном анализе.

IL10 играет защитную роль в гомеостазе хряща и может способствовать поддержанию микросреды хряща. Предыдущие исследования показали, что IL10 ингибирует апоптоз хондроцитов через регуляцию митохондриальных апоптотических путей, снижение активности каспазы и модуляцию отношения Bax/^{Bcl-2 39}. Кроме того, IL10 связан с уменьшением внеклеточного разложения матрикса и снижением экспрессии факторов, связанных с деградацией матрикса, включая MMP3, MMP13, ADAMTS4 и индуцируемую синтезу оксида азота, в моделях сжатого суставного^{хряща 40}. Анализ обогащения путей KEGG в настоящем исследовании показал, что сигнальные пути IL-17, TNF и гипоксия-индуцируемый фактор-1 (HIF-1) могут быть связаны с предсказанными терапевтическими эффектами TBF против OA, хотя эти вычислительные прогнозы требуют экспериментального подтверждения. Предыдущие исследования показали, что IL-17 способствует прогрессированию ОА через регуляцию воспалительных ответов и активности синовиальных^клеток ^41,42. Повышение экспрессии IL-17 также положительно коррелировало с тяжестью заболевания при остеоартрите^{колена 43}. TNF-α — ещё один основной медиатор воспаления, связанного с ОА, болей и дегенерацией хряща, а подавление сигнализации TNF-α может облегчить прогрессирование^{болезни 44}. Кроме того, HIF-1α играет важную роль в гипоксическом метаболизме хондроцитов, регуляции внеклеточного матрикса, воспалении синовиа и ремоделировании субхондральных костей в^{OA 45}. Предыдущие исследования также предполагали, что ингибирование сигнальной передачи, связанной с HIF-1α, может защищать функцию хондроцитов и снижать дегенерацию^{хряща 46}. Эти результаты соответствуют сигнальным путям, выявленным в ходе текущего вычислительного анализа обогащения.

Это исследование in silico имеет несколько важных ограничений. Во-первых, анализ основывался на общедоступных базах данных, которые могут содержать неполную или предвзятую информацию о травяных соединениях и целевых аннотациях. Кроме того, методы вычислительного прогнозирования целей включают внутреннюю неопределённость, и предсказанные взаимодействия, выявленные в этом исследовании, требуют экспериментальной проверки. Анализ молекулярного стыкинга отражает теоретический потенциал связывания, а не прямую физиологическую или фармакологическую активность. Кроме того, не проводились эксперименты in vitro или in vivo для проверки вычислительных предсказаний. Факторы, включая дозировку травы, фармакокинетику и общую биодоступность комбинированной формулы, также не оценивались. Поэтому все выводы, полученные по данному исследованию, должны считаться предсказательными и требуют дальнейшего экспериментального подтверждения.

Настоящее исследование, основанное на сетевой фармакологии и анализах молекулярного стыкинга, предоставляет прогнозную основу для изучения возможных механизмов TBF против OA. Результаты показали, что ТБФ может регулировать несколько мишеней, связанных с ОА, через взаимодействие между активными соединениями, полученными из его восьми составляющих трав. Выявленные мишени были обогащены биологическими процессами и сигнальными путями, связанными с регуляцией воспаления, липидным метаболизмом и сигнализацией, связанной с гипоксией, включая пути IL-17, TNF и HIF-1. Молекулярный докинговый анализ дополнительно продемонстрировал благоприятные прогнозируемые сродства связывания между кверцетином и основными мишенями JUN, RELA, IL6, MAPK1 и IL10. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что TBF может оказывать многокомпонентное и многоцелевое регуляторное воздействие на OA. Это исследование также предоставляет теоретическую стратегию и методологическую основу для будущих механистических исследований и экспериментальной валидации формул ТКМ в исследованиях ОА.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Декларация конкурирующих интересов:

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых или личных интересов. Все авторы изучили и одобрили это заявление.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для этого исследования не было получено финансирование, институциональная поддержка или техническая помощь.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
AutoDockTools	Программное обеспечение	Версия 1.5.7; Институт Скриппса	https://autodock.scripps.edu/
AutoDock Vina	Программное обеспечение	Версия 1.5.7; Институт Скриппса	https://autodock.scripps.edu/
barplot function	Функция визуализации R	Пакет clusterProfiler	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
clusterProfiler	Пакет R	Пакет Bioconductor для анализа обогащения	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
CytoHubba	Плагин	Совместим с Cytoscape 3.10.2	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba
Cytoscape	Программное обеспечение	Версия 3.10.2; Консорциум Cytoscape	https://cytoscape.org/
DAVID	База данных	База данных для аннотации, визуализации и интегрированного открытия	https://david.ncifcrf.gov/
dotplot function	Функция визуализации R	Пакет clusterProfiler	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
DrugBank	База данных	Университет Альберты	https://go.drugbank.com/
GeneCards	База данных	GeneCards Suite	https://www.genecards.org/
MicrobiomeAnalyst / MicrobiomeNet	Онлайн-платформа	Онлайн-платформа для визуализации обогащения	https://microbiomenet.com/
OMIM	База данных	Онлайн-наследие Менделя у человека	https://www.omim.org/
PDB	База данных	Банк данных белковых структур RCSB	https://www.rcsb.org/
PubChem	База данных	Национальный центр информации о биотехнологиях	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
PyMOL	Программное обеспечение	Версия 2.5.4	https://pymol.org/
R	Программное обеспечение	Версия 4.3.1; R Foundation for Statistical Computing	https://www.r-project.org/
STRING	База данных	Инструмент для поиска взаимодействующих генов/белков	https://cn.string-db.org/
TCMSP	База данных	База данных и платформа анализа фармакологии традиционной китайской медицины	http://tcmspw.com/tcmsp.php
TTD	База данных	База данных терапевтических мишеней	https://db.idrblab.net/ttd/
UniProt	База данных	Универсальный ресурс белков	https://www.uniprot.org/
Venny	Программное обеспечение	Версия 2.1.0	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исследование сетевой фармакологии и молекулярного стыкинга формулы TongBi для остеоартрита

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи