Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Фенотипирование дофаминергической нейродегенерации in vivo у личинок данио-рерио, с помощью поведенческого анализа и высокосодержательной визуализации

345 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71516

⸱

16 июня 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Pharmacy Practice, UC Irvine School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2Robert A. Mah Molecular Innovation Center, University of California Irvine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол предусматривает стандартизированный, высокопроизводительный метод скрининга соединений с использованием in vivo данио-рерио для количественной оценки потери дофаминергических нейронов и нарушения движения моторного поведения, что позволяет эффективно проводить скрининг нейропротекторных соединений.

Аннотация

Исследования по открытию лекарств в области нейродегенерации ограничены высокой стоимостью и низкой пропускной способностью традиционных моделей млекопитающих. Это узкое место особенно наблюдается в исследованиях болезни Паркинсона, где строгие и масштабируемые исследования дофаминергической (DA) нейродегенерации остаются медленными и ресурсоёмкими. Чтобы устранить этот разрыв, мы представляем стандартизированный, высокопроизводительный конвейер фенотипирования с использованием трансгенной модели данио-рерио, экспрессирующей нитроредуктазу в ДА-нейронах для изучения потери DA-нейрона в течение пяти дней после оплодотворения. Данио предлагает ключевые преимущества для трансляционной нейронауки, включая быстрое развитие личинок, оптическую прозрачность, обеспечивающую in vivo визуализацию целого мозга, надёжную консервацию генов и путей, связанных с болезнью Паркинсона, а также целостные нейронные цепи, недоступные в моделях клеточной культуры. Наш протокол интегрирует химогенетическую абляцию и высококонтентную визуализацию для быстрого создания наборов данных для скрининга. Нейроны DA избирательно абляцируются с помощью метронидазола (MTZ), что приводит к специфической и регулируемой нейродегенерации. Лечение МТЗ приводит к снижению локомоции, зависящей от дозы, что соответствует фенотипам, похожим на брадикинезию, обеспечивая надёжную поведенческую корреляцию к потере DA-клеток. Поскольку болезнь Паркинсона по сути является моторным расстройством, мы сопоставляем анатомические измерения с функциональными поведенческими показаниями. Локомоторная активность фиксируется непосредственно на пластине и количественно измеряется с помощью автоматизированного отслеживания, извлекающего метрики, включая общее пройденное расстояние, частоту плавания и инициацию всплеска. Данио обеспечивает эффективную и масштабируемую модельную систему, в которой сотни личинок можно анализировать одновременно с минимальными затратами. Мы оптимизировали высокопроизводительный протокол скрининга препаратов на основе пластин, направленный на минимизацию экспериментальных различий в исследованиях бакалавриата. Этот стандартизированный, основанный на пластинах формат скрининга кандидатов на нейропротекторы или функциональное спасение гарантирует, что данные, собранные разными исследователями, остаются статистически сопоставимыми и эффективными для выявления нейропротекторных кандидатов, повышая воспроизводимость. В совокупности эта методология обеспечивает надёжную, масштабируемую основу для исследований нейродегенерации.

Введение

Исследования по открытию лекарств в нейродегенерации сталкиваются с существенным узким местом эффективности из-за высокой стоимости и низкой пропускной способности традиционных моделеймлекопитающих 1,2, требующих тщательного экспериментального планирования и использования большого количества рабочей силы. Общая цель этого метода — обеспечить стандартизированный, высокопроизводительный подход с использованием Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) трансгенная модель данио-рерио, в которой нитроредуктаза-mCherry специфически экспрессируется в дофаминергических (DA) нейронах для изучения потери DA нейронов и дефицита локомоции. Обоснование использования этой техники связано с необходимостью строгих, масштабируемых и экономически жизнеспособных in vivo моделей для нейродегенерационныхисследований 3,4,5. Хотя культуры in vitro позволяют проводить быстрый скрининг лекарств, им не хватает целостной нейронной цепи и контекста всего организма, необходимых для трансляционнойзначимости 6. В отличие от этого, модели грызунов дают отличный физиологический контекст, но дорогие и занимают много времени для начального высокопроизводительного скрининга нейропротекторныхсоединений 7,8.

Данио-рерио обладает быстрым развитием личинок, оптической прозрачностью, обеспечивающей in vivo визуализацию всего мозга, и сильной генетической сохранностью заболеваний путей, особенно связанных снейродегенерацией 9,10,11. Протокол конкретно интегрирует стандартизированное ухождение, хемогенетическую абляцию с помощью метронидазола (MTZ) и высокосодержательную визуализацию в сочетании с функциональным поведенческим отслеживанием. Прямое измерение локомоторной активности обеспечивает надёжную поведенческую корреляцию с потерей нейронов ДА, поскольку потеря дофаминовых нейронов связана с поведенческимианомалиями 12,13,14. Стандартизированный формат на основе пластин минимизирует экспериментальные различия между операторами, а высокая пропускная способность личинки данио-рерио позволяет создавать большие выборки, обеспечивая достаточную статистическую мощность для обнаружения нейропротекторных эффектов. Это делает протокол отлично подходящим для приложений, требующих масштабируемого и воспроизводимого скрининга, включая ситуации, где опыт исследователей может различаться.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, связанные с использованием позвоночных испытуемых, проводились в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу и использованию животных (одобрение IACUC AUP-25-098).

1. Разведение данио-рерио.

  1. Поддержание условий водной системы
    1. Поддерживать рециркулирующую водную систему при 28,5°C (приемлемый диапазон: 26°C–30°C), pH 7,1–7,8 и проводимость 600–700 мкС/см. Содержать взрослых данио-рерио при плотности зарыбления примерно 5 рыб на литр в домашних аквариумах.
    2. Ежедневно контролируйте уровни аммиака, нитритов и нитратов с помощью колориметрического теста воды в аквариуме согласно инструкциям производителя. Поддерживайте аммиак и нитриты на 0 ppm, а нитраты — в диапазоне 10–20 ppm.
    3. Проводите водообмен, когда уровень аммиака или нитритов превышает 0 ppm, нитрат превышает 20 ppm, присутствует видимая мутность или мусор, либо если значения pH/проводимости выходят за пределы целевых диапазонов, описанных в шаге 1.1.1. Продолжайте обмен до тех пор, пока аммиак и нитриты не вернутся к 0 ppm, нитраты не вернутся до 10–20 ppm, а значения pH/проводимости не будут восстановлены в целевом диапазоне.
    4. Поддерживайте цикл света и 10 часов темноты, чтобы синхронизировать циркадный ритм и размножение.
  2. Кормите данио-рерио на разных стадиях развития
    1. Кормите взрослых рыб 0,5 мм медленно тонущими гранулами два раза в день. Стандартизируйте кормление по времени употребления и обеспечивайте только количество потребления в течение 3–5 минут. Используйте одинаковый размер гранул и тип рациона в экспериментальных группах.
    2. Кормите личиночку рыб Gemma Micro 75 ZF или эквивалентную рацион личинок данио-рерио, примерно 75 мкм, три раза в день. Кормите молодых рыб (1 месяц) Gemma Micro 150 ZF или эквивалентную рацион данио с размером частиц примерно 150 мкм три раза в день.
    3. Заменяйте эквивалентные диеты только в том случае, если они разработаны для личинок или молодых рыб данио, обеспечивают сопоставимый размер частиц и обеспечивают высокобелковый и питательный корм, подходящий для стадии развития.
    4. Дополняйте рацион личинок и молодых животных свежевылупленными живыми соляными креветками науплии раз в день в полдень в будние дни. Вылупить кисты рассола в аэроированной солёной воде в течение 24–36 часов согласно инструкциям производителя.
    5. Собирайте активно плавающие науплии, промывайте их системной водой и кормите только тем количеством, которое потребляется в течение 5–10 минут.
    6. Избегайте перекормления, так как избыток кормления повышает уровень аммиака.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневно удаляйте несъедённую пищу и видимые остатки, аккуратно отсасывая. Осматривайте аквариумы на наличие мёртвых или нездоровых рыб и очищайте поверхности или сита при накоплении мусора. Поддерживать плотность резервуаров, кормление, очистку и мониторинг качества воды в экспериментальных когортах. Для получения дополнительной информации о содержании данио, стадии развития, культуре солёных креветок и долгосрочном содержании объектов см. статьиWesterfield 15 и Avdesh et al.16.

2. Сбор эмбрионов, подготовка реагентов и трансгенный скрининг

  1. Организация скрещивания размножения
    1. Собирайте скрещивающие резервуары с разделителем вечером перед сбором эмбрионов.
    2. Поместите одного самца и двух самок данио-рерио в каждый скрещивающий аквариум, при этом самцов и самок разделяют разделитель на ночь.
    3. Снимите разделитель на следующее утро в начале светового цикла и позвольте нересту на фиксированный двухчасовой период. Собирайте эмбрионы сразу после нереста, чтобы минимизировать изменчивость на стадии развития.
  2. Сбор и инкубация эмбрионов
    1. Собирайте эмбрионы, заливая воду в аквариуме через сетчатый фильтр диаметром 400 мкм. Аккуратно промывайте эмбрионы системной водой или синей яичной водой (BEW), чтобы удалить мусор, затем перенесите эмбрионы в чашки Петри диаметром 100 мм с помощью одноразовой пипетки для переноса. Минимизируйте контакт с эмбрионами и избегайте длительного воздействия воздуха.
    2. Переносите эмбрионы в чашки Петри диаметром 100 мм, содержащие 30 мл BEW при плотности 50–60 эмбрионов на блюдо. Не превышайте 60 эмбрионов на блюдо для поддержания стабильного развития и доступности кислорода.
    3. Инкубировать эмбрионы при 28,5°C при цикле 14 часов света и 10 часов темноты.
    4. Ежедневно удалять неоплодотворённые яйцеклетки и нежизнеспособные эмбрионы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте BEW с использованием 60 мг морской соли Instant Ocean, 50 мкл 1% метиленового синего и 1 л деионизированнойводы 17.
  3. Приготовьте и нанесите раствор 1-фенил-2-тиомочевины (PTU)
    1. Приготовьте раствор PTU объемом 100 мм в диметилсульфоксиде (DMSO).
    2. Храните раствор PTU при 4°C, защищённом от света.
    3. Через 24–36 часов после оплодотворения (HPF) добавьте 60 мкл раствора PTU в каждую чашу с 30 мл BEW, чтобы достичь конечной концентрации 200 мкм.
    4. Смешайте PTU, аккуратно покрутив чашку Петри по кругу 5–10 раз. Избегайте пипетирования непосредственно на эмбрионы, чтобы минимизировать механические нагрузки.
      ВНИМАНИЕ: PTU может вызвать раздражение дыхательных путей и кожи. Обращайтесь в перчатках и проводите приготовление в хорошо проветриваемом помещении.
  4. Приготовьте трикаиновый анестетик
    1. Растворить 400 мг трикаина метанесульфоната в воде Milli-Q объёмом 97,9 мл.
    2. Добавьте в раствор 2,1 мл основания 1 M Tris (pH 9).
    3. Отрегулируйте раствор до pH 7,0, используя гидроксид натрия или соляную кислоту 0,1 М.
    4. Раствор наливайте в маркированные трубки и храните при 4°C.
    5. Разбавьте стандартный раствор в соотношении 1:25 для получения рабочей концентрации 160 мкг/мл или разбавьте 1:100 для получения 40 мкг/мл для низкодозовыхприложений 18.
      ВНИМАНИЕ: Трикаин метансульфонат — это химический анестетик. Обращайтесь с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты.
  5. Выполнение ауткроссинга
    1. Внешний гомозиготный Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) взрослых рыб с AB дикого типа данио, помещая одного гомозиготного трансгенного взрослого и одного взрослого AB дикого типа противоположного пола в скрещивающий аквариум с разделителем на ночь. Снимите разделитель в начале светового цикла и собирайте эмбрионы после фиксированного двухчасового окна нереста.
  6. Экранирующие трансгенные личинки
    1. Через 3 дня после оплодотворения (dpf) анестезируйте личинки с помощью трикаина при конечной концентрации 160 мкг/мл.
    2. Наблюдайте личинки под флуоресцентным стереомикроскопом с использованием фильтра mCherry (возбуждение ~587 нм, излучение ~610 нм). Используйте одинаковые настройки скрининга для всех личинок в эксперименте, включая увеличение объектива, время экспозиции, усиление и интенсивность освещения.
    3. Установите экспозицию и усиление, используя известную положительную трансгенную личинку, чтобы флуоресценция нейрона DA-нейрона была чётко видна без насыщения, а затем поддерживайте эти параметры для всех оставшихся личинок в эксперименте.
    4. Подтвердить наличие mCherry-положительного сигнала, локализованного в кластерах нейронов DA, в вентральном диэнцефалоне между глазами и немного вентрально к средней линии (рисунок 1A).
    5. Идентифицировать положительные личинки как те, что демонстрируют чётко обнаруживаемую mCherry флуоресценцию в ожидаемых кластерах нейронов DA вентрального диэнцефалона. Классифицировать личинки как отрицательные, если сигнал mCherry не виден на фоне при фиксированных настройках скрининга, используя нетрансгенных или известных негативных личинок в качестве фоновых контролей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 3 dpf — это самая ранняя стадия, на которой DA-нейроны в вентральном диэнцефалоне производят надёжный флуоресцентный сигнал для количественной оценки.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Трансгенный скрининг, вложение личинок и дизайн пластинок. (A) Флуоресцентное изображение (mCherry канал, 4× объективно) личинки трансгенной данио-рерио, экспрессирующей нитроредуктазу (NTR) в дофаминергических (DA) нейронах, демонстрирующее кластеры DA-нейронов в вентральной диэнцефалоне между глазами. (B) Модифицированные наконечники пипетки P200, обрезанные примерно до 1,5 мм отверстия, используемые для переноса личинок во время вложения агарозы. (C) Репрезентативная схема пластин с 96 скважинами для высокопроизводительного скрининга наркотиков, включая управление транспортными средствами, скважины, обработанные метронидазолом (MTZ), и условия скрининговых соединений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Хемогенетическая абляция и флуоресцентная визуализация

  1. Приготовьте среду для встраивания агарозы
    1. В день всадки при 4 dpf подготовьте агарозу с низкой температурой плавления (LMA) 1,2% в воде Milli-Q.
    2. Нагревайте раствор агарозы в микроволновке с короткими интервалами в 5–10 секунд, мягко поворачивая между ними, пока агароза полностью не растворится и не станет прозрачным. Избегайте переварения или длительного нагрева, которые могут изменить конечную концентрацию агарозы при испарении.
    3. Аликвот агарозу в микроцентрифугальные трубки объёмом 1,5 мл.
    4. Расплавите аликвоты при 70°C и уравновесьте их в нагревательном блоке 42°C перед использованием.
    5. Добавьте 20 мкл раствора трикаина (4 мг/мл) в каждую агарозу аликвот, чтобы получить рабочую концентрацию примерно 40 мкг/мл.
    6. Смешайте трикаин с расплавленной агарозой, аккуратно пипетируя вверх и вниз 5–10 раз с помощью пипетки P200. Избегайте вихрей и появления пузырей, так как пузырьки могут мешать позиционированию и визуализации личинок.
  2. Анестезия и вставляйте личинки
    1. Добавьте раствор трикаинового бульона в чашку Петри, содержащую 4 личинки dpf, чтобы получить итоговую концентрацию 160 мкг/мл.
    2. Инкубировать личинки в трикаине примерно 5 минут, или пока они не покажут потерю спонтанного плавания и отсутствия реакции на мягкое прикосновение зондом. Начинайте встраивать только после достижения этой точки анестезии.
    3. Обрежьте дистальный конец наконечника пипетки P200 чистыми ножницами или стерильным лезвием, чтобы создать отверстие примерно 1,5 мм. Перед использованием проверьте размер отверстия с помощью линейки или калибровки весов под стереомикроскопом. Отбросьте кончики с неровными краями или отверстиями, слишком узкими, чтобы личинки могли пройти без контакта (рисунок 1B).
    4. Аспирируйте одну личинку в минимальной жидкости с помощью модифицированного наконечника пипетки.
    5. Погрузите кончик пипетки в агарозу аликот.
    6. Раздайте 40 мкл агарозы с одной личинкой в одну колодку плоскодонной пластины с 96 лунками. Используйте одинаковый объём агарозы для всех колодцев в эксперименте. Если используется другой тип пластины, оптимизируйте объём агарозы перед началом эксперимента и поддерживайте выбранный объём во всех скважинах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пластины с плоским дном для обеспечения равномерной визуализации. Оптимизировать объём агарозы на основе геометрии пластин.
  3. Ориентируй и встраивай личинки
    1. Поместите пластину под стереомикроскоп (дисекционный микроскоп).
    2. Используйте щипцы с тонкими наконечниками или зонд 0,25 мм, чтобы ориентировать личинку так, чтобы вентральный диэнцефалон был обращён к объективу.
    3. Для перевёрнутых микроскопов расположите личинки спинной стороной вниз или спинной стороной вверх для вертикальных микроскопов.
    4. Полная ориентация проходит в течение 1–2 минут до затвердевания агарозы.
    5. Встраивайте по одной личинке в каждую скважину согласно заранее заданной карте плит с 96 лунками. Резервируйте строку A для управления транспортными средствами, строку H для контрольных только с MTZ, а строки B–G назначайте кандидатным соединениям или группам доза-реакция. По возможности рандомизировать размещение соединений внутри строк B–G, чтобы снизить позиционное смещение. Используйте одну и ту же карту пластин для исходной и послеобработочной визуализации.
    6. После затвердевания агарозы добавьте BEW без трикаина в каждую скважину, чтобы довести итоговый объём до ровно 200 мкл. Используйте одинаковый конечный объём для всех скважин внутри пластины, чтобы поддерживать равномерное воздействие диффузии и обработки.
  4. Подготовьте решения для обработки MTZ
    1. Подготовьте рабочие решения MTZ в BEW, дополненные 1% DMSO и 200 мкм PTU. Добавьте порошок MTZ в раствор и вихрь, пока не останутся видимые частицы. Смешивайте на коромысле или трубочном ротаторе, защищённом от света, в течение 15–30 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что раствор прозрачный и не содержит видимых осадков перед использованием.
    2. Подготовьте концентрации 3, 4,5 и 9 мМ для оптимизации дозы и ответа.
    3. Подготовьте управляющий аппарат с 1% DMSO в BEW с PTU 200 мкм.
    4. Подготовьте только валидированную концентрацию MTZ для рутинного скрининга после оптимизации.
      ВНИМАНИЕ: MTZ чувствительна к свету. Готовьте свежие растворы для каждого эксперимента, защищайте от света фольгой и не используйте оставшиеся растворы повторно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте одинаковые конечные концентрации DMSO во всех группах лечения и контрольных групп. Не подменяйте альтернативные формулы MTZ.
  5. Получите изображения флуоресценции до обработки
    1. При 4 dpf после вложения получите исходные флуоресцентные изображения с помощью флуоресцентного микроскопа с объективом 20× (рисунок 2).
    2. Снимите каждую скважину с помощью канала mCherry (возбуждение ~587 нм, излучение ~610 нм).
    3. Используйте одинаковые настройки визуализации для всех скважин в эксперименте. Установите время экспозиции, интенсивность освещения и усиление детектора с помощью личинки управления транспортным средством так, чтобы самые яркие пиксели нейронов DA достигали примерно 70–80% динамического диапазона детектора без насыщения. Записывайте итоговое время экспозиции, интенсивность освещения, усиление детектора, объектив и профиль захвата, и сохраняйте эти настройки для всех исходных и послеобработанных изображений.
    4. По возможности собирайте все изображения за одну сессию, чтобы минимизировать вариативность интенсивности лампы или чувствительности детектора в разных временных точках. Для систем с автоматизированным управлением ступенями используйте мультипозиционное получение для поддержания одинаковых координат во всех сессиях визуализации.
    5. Сохраняйте профиль приобретения для повторного использования во время послеобработочной визуализации (шаг 3.7) и в последующих экспериментах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив 20× обеспечивает баланс между полем зрения и разрешением для визуализации диэнцефального кластера нейронов DA.
  6. Применяйте процедуру MTZ после базовой визуализации
    1. Сразу после базовой визуализации при 4 dpf добавляйте раствор или раствор, содержащий MTZ, непосредственно в каждую скважину, чтобы увеличить итоговый объём скважины до 200 мкл.
    2. Для экспериментов по скринингу соединений на этом этапе добавляют кандидатные соединения вместе с MTZ, чтобы личинки подвергались воздействию MTZ ± соединения в течение того же 24-часового периода обработки.
    3. Инкубировать пластины при 28,5°C при цикле 14 часов света и 10 часов темноты в течение 24 часов, от 4 dpf до 5 dpf.
    4. Избегайте беспокойства пластин во время инкубации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с доза-ответом оценивайте дополнительные времена инкубации (например, 12 и 48 часов) для оптимизации условий лечения.
      ТОЧКА ПАУЗЫ: Пластины можно поддерживать в инкубационных условиях в течение установленного периода лечения перед переходом к визуализации.
  7. Получите изображения флуоресценции после обработки
    1. При 5 dpf получайте изображения после обработки, используя идентичные настройки микроскопа, используемые для базовой съёмки при 4 dpf, включая время экспозиции, интенсивность освещения, усиление детектора, объектив и профиль захвата (см. рисунок 2).
    2. Не регулируйте время экспозиции, усиление детектора, интенсивность освещения, фокус, объектив или настройки приёма между скважинами или между сессиями визуализации до и после обработки.
    3. Если микроскоп выключался между сессиями, перезагрузите сохранённый профиль получения и проверьте все настройки по записанным параметрам перед съёмкой.
    4. По возможности снимайте в том же порядке, что и при базовой визуализации, и получайте все изображения после обработки в рамках той же сессии.
    5. Этот сочетающий дизайн визуализации до и после процедуры контролирует межиндивидуальную вариабельность базовой флуоресценции нейрона ДА и гарантирует, что изменения сигнала связаны с лечением, а не с различиями в получении.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Дозозависимое снижение флуоресценции нейрона ДА после лечения метронидазолом. Репрезентативные флуоресцентные изображения (канал mCherry, 20× объектив) личинок трансгенных данио-рерио, демонстрирующих диэнцефальные DA-нейроны после 24-часовой обработки с разными концентрациями MTZ. Интенсивность флуоресценции снижается в зависимости от дозы, что указывает на успешную химогенетическую абляцию нейронов, экспрессирующих NTR. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Высокопроизводительный скрининг на основе пластин

  1. Генерация и скрининг трансгенных личинок
    1. Сгенерировать новую когорту гомозиготных трансгенных личинок.
    2. Собирайте эмбрионы и выращивайте их в BEW.
    3. Обрабатывайте эмбрионы PTU с объемом 200 мкм через 24–36 часов после оплодотворения (HPF), как описано в шаге 2.3.
    4. При 3 dpf проводите скрининг личинок с помощью канала mCherry с фиксированными настройками микроскопа для всех личинок в эксперименте. Установите время экспозиции, усиление детектора и интенсивность освещения, используя известную положительную личинку, чтобы чётко обнаружить флуоресценцию DA-нейрона без насыщения, а затем оставить эти настройки без изменений во время скрининга.
    5. Классифицировать личинки как положительные, если прозрачная вишневая флуоресценция наблюдается в ожидаемых кластерах нейронов ДА вентрального диэнцефалона при фиксированном скрининге. Отбрасывайте личинки без сигнала выше фона в этом регионе или при слабой, диффузной или внематочной флуоресценции.
  2. Встраивайте личинки и получайте исходные изображения
    1. При 4 dpf внедрить личинки в пластину с 96 лунками, как описано в шагах 3.2–3.3, используя по одной личинке на каждую яму.
    2. Получите исходные изображения флуоресценции до процедуры, как описано в шаге 3.5.
  3. Применение MTZ и кандидатных соединений
    1. После получения исходных флуоресцентных изображений при 4 dpf добавляйте растворы для обработки непосредственно в скважины согласно карте пластин (рисунок 1C).
    2. Для управляющих скважин добавьте BEW, содержащую ту же конечную концентрацию DMSO, что и в скважинах с обработкой соединений.
    3. Для контрольных скважин, работающих только с MTZ, добавляйте раствор MTZ без кандидатного соединения.
    4. Для скважин для скрининга соединений добавляйте MTZ и кандидатное соединение, чтобы личинки подвергались воздействию обоих в течение одного и того же 24-часового периода обработки.
    5. Для начального скрининга используйте концентрацию одного соединения, например 10 мкм, если только специфические для соединения растворимость, токсичность или данные о предыдущей дозе не указывают на необходимость использования другой концентрации.
    6. Отрегулируйте каждую скважину до конечного объёма 200 мкл. Поддерживайте одинаковые конечные концентрации DMSO во всех скважинах, включая управление транспортными средствами, контроль только с MTZ и скважины MTZ плюс составные скважины.
    7. Инкубировать пластины при 28,5°C при цикле 14 часов света и 10 часов темноты в течение 24 часов, от 4 dpf до 5 dpf.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не включает удаление MTZ или промывку перед воздействием соединения. Кандидатные соединения наносятся одновременно с MTZ сразу после базовой визуализации.
  4. Получите изображения после обработки и рассчитывайте удержание флуоресценции
    1. При 5 dpf сделайте послеобработанные флуоресцентные изображения с использованием тех же настроек сбора данных, что и для исходной визуализации при 4 dpf.
    2. Изображения ямы в том же порядке, что и при базовой изображении, когда это возможно.
    3. Рассчитайте удержание флуоресценции для каждой личинки следующим образом:
      figure-protocol-3
    4. Нормализуйте значения удержания флуоресценции до среднего значения управления автомобиля с той же пластины.
    5. Определите кандидатные защитные соединения с показателями удержания флуоресценции значительно выше, чем у контроля только с MTZ.
  5. Определите попадающие соединения
    1. Определите попадающие соединения как те, у которых коэффициенты удержания флуоресценции значительно выше отрицательного контроля (только MTZ).
    2. Проведите статистический анализ с использованием t-теста Уэлча для сравнения контрольных групп, используемых только с MTZ, с группами лечения с использованием соединений.
    3. Валидируйте попадающие соединения с помощью независимых биологических репликаций и тестов доза-ответ. Подтвердите попадания как соединения, которые воспроизводимо увеличивают удержание флуоресценции относительно контроля только на MTZ, при p < 0,05 и без видимой токсичности личинок или аномальной морфологии.
    4. Предварительно проверяйте результаты вторичных анализов, таких как анализ поведения двигателей, валидация дозы-ответа или независимое биологическое репликационное тестирование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экранов составной библиотеки вычислите Z-фактор для каждой пластины с помощью положительных и отрицательных контролей. Z-фактор > 0,5 указывает на надёжный анализ, подходящий для идентификации попаданий.

5. Оценка локомоторного поведения

  1. Назначить личинки по группам лечения
    1. При 4 dpf личинки каждого генотипа разделяют на три группы лечения с не менее чем 10 личинками в каждой группе: только BEW, контроль транспортных средств DMSO и лечение MTZ.
    2. Распределяйте группы следующим образом: (1) только BEW (необработанный базовый уровень), (2) 1% контроль DMSO и (3) оптимизированная концентрация MTZ (4,5 мМ при 1% DMSO/BEW при 200 мкм PTU).
    3. Включайте личинки дикого типа AB, обработанные с помощью транспортного средства или MTZ при аналогичных условиях. Подтвердите эффекты, зависящие от NTR, если MTZ снижает передвижение в Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) личинки, но не у личинок дикой AB.
  2. Проведите лечение и личинки пластин
    1. Обрабатывайте личинок в течение 24 часов при 28,5°C, используя условия, определённые в шаге 5.1.2: только BEW, 1% контроля DMSO или 4,5 mM MTZ при 1% DMSO/BEW с PTU 200 мкм.
    2. Переместите пять личинок в каждую скважину шестиколодной пластины с 2,5 мл свежей BEW с помощью ширококалиберной трансферной пипетки. Минимизируйте объем переноса и аккуратно обращайтесь с личинками, чтобы избежать стресса или травм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование пяти личинок на скважину сбалансирует доходность данных и минимизирует перенаселенность. Более высокие плотности увеличивают пересечения путей и вводят ошибки отслеживания в поведенческом анализе.
  3. Настройка условий освещения
    1. Разместите пластину с 6 ямками на белую светодиодную площадку с равномерным рассеянным освещением при температуре 25°C до 28°C. Используйте одну и ту же световую панель, параметр яркости и положение пластины для всех записей в эксперименте (рисунок 3A).
    2. Освещайте пластину как снизу, так и сверху с помощью рассеянных источников света, чтобы минимизировать тени, блики и отражения.
  4. Настройте настройки видеозаписи
    1. Установите камеру высокого разрешения в фиксированном положении сверху вниз над пластиной с помощью устойчивой опоры (например, штатива или крепления на рычаг) (рисунок 3B).
    2. Разместите линейку рядом с пластиной в поле зрения для пространственной калибровки.
    3. Убедитесь, что камера расположена перпендикулярно поверхности пластины, чтобы минимизировать искажение параллакса.
  5. Запись локомотивной активности
    1. Проводите записи во время светлой фазы цикла 14 часов свет:10 часов темноты, чтобы минимизировать циркадную вариабельность.
    2. Дайте личинкам акклиматизироваться на 1 час перед записью.
    3. Зафиксируйте двигательную активность на 60 минут.
    4. Не мешайте настройке во время записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите записи в одно и то же время суток в экспериментах, чтобы минимизировать циркадную вариабельность.
  6. Настройте программное обеспечение для отслеживания поведения
    1. Импортируйте записанное видео в EthoVision XT (программное обеспечение для отслеживания поведения) (рисунок 3C).
    2. Настройте следующие настройки: 6 арен, 5 объектов на арену, обнаружение центровых точек, расстояние в миллиметрах и время в секундах.
    3. Калибруйте пространственный масштаб с помощью линейки, присутствующей в видеокадре.
    4. Определите границы арены для каждой скважины, чтобы каждая арена полностью охватывала внутреннюю часть скважины, не выходя за пределы краёв скважины.
  7. Оптимизировать настройки обнаружения
    1. Сгенерируйте эталонное изображение с помощью программного интерфейса (Настройки обнаружения → Эталонное изображение → Начало обучения).
    2. Отрегулируйте порог обнаружения, чтобы обеспечить точное отслеживание всех личинок без ложных обнаружений.
    3. Проведите короткое тестовое приобретение (~2 мин).
    4. Осмотрите отслеживаемые траектории визуально, прежде чем перейти к полному анализу. Убедитесь, что все личинки обнаружены и что пузырьки, обломки, отражения или края колодцев не ошибочно идентифицируются как личинки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Распространённые артефакты включают отслеживание краёв, вызванное слишком крупными аренами, ложные обнаружения пузырьков или обломков, а также потерю отслеживания при длительной бездействии.
    5. Исключайте скважины из анализа, если постоянные сбои отслеживания, чрезмерное пересечение пути, видимые обломки или пузырьки, мёртвые личинки, аномальная морфология или личинки, застрявшие на краю скважины, мешают достоверной количественной оценке.
    6. Примените одинаковые критерии исключения ко всем группам лечения до проведения статистического анализа.
  8. Проведите полный анализ и экспорт данных
    1. Проведите полный приобретение.
    2. Генерируйте визуализации трасс и тепловые карты (анализ → результаты → треки и тепловые карты).
    3. Экспортировать исходную таблицу данных с метриками по субъектам, включая общее пройденное расстояние (мм), среднюю скорость (мм/с) и количество перемещений.
    4. Используйте общее расстояние, пройденное за 60 минут, как основную конечную точку локомотива (рисунок 3D).

figure-protocol-4
Рисунок 3: Настройка и рабочий процесс записи поведения локомотивов и анализа. (A) Экспериментальная установка, показывающая пластину с шестью ямками с личинками данио-рерио, расположенную на световой площадке, с линейкой для пространственной калибровки и температурно контролируемым источником тепла для поддержания экспериментальных условий. (B) Установка видеозаписи с камерой сверху, используемой для записи движения личинок с представительным наложением отслеживания. (C) Поведенческое отслеживание с помощью EthoVision XT (программного обеспечения для отслеживания поведения), показывающее автоматическое обнаружение и отслеживание движения личинок. (D) Краткое описание рабочего процесса, описывающее шаги от захвата видео до количественного анализа поведения двигателей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

6. Анализ данных

  1. Подготовка изображений к анализу
    1. Открытые пары изображений до и после обработки на Фиджи (ImageJ, программное обеспечение для анализа изображений).
    2. Если изображения получаются в виде Z-стеков, генерируйте проекции максимальной интенсивности (Image → Stacks → Z Project → Max Intensity).
    3. Регулировать яркость/контраст с помощью одинаковых фиксированных настроек дисплея для всех изображений в наборе данных. Не используйте автомасштабирование для количественных измерений и проводите флуоресцентную количественную оценку на исходных нескорректированных изображениях.
  2. Определите области интереса (ROI)
    1. Используйте инструмент выбора полигонов, чтобы нарисовать ROI вокруг диэнцефального кластера нейронов DA на предварительном изображении. Определите границу ROI с помощью анатомических ориентиров, видимых на флуоресцентном изображении, включая медиальные края глаз и вентральную среднюю линию диэнцефалона (рисунок 2). Убедиться, что ROI охватывает весь кластер нейронов DA, не распространяясь на соседние флуоресцентные структуры. Для согласованности между операторами сохраните репрезентативный шаблон ROI и распределите его среди всех членов команды в качестве пространственного ориентира.
    2. Нажмите «t», чтобы добавить ROI в ROI Manager.
    3. Выровняйте изображения до и после обработки с использованием анатомических ориентиров, включая глаза и вентральный диэнцефалон, перед нанесением ROI. Тот же ROI применяйте к совпадающему изображению после обработки только после подтверждения выравнивания.
    4. Сохраняйте все ROI для каждой пластины, чтобы обеспечить воспроизводимость и повторный анализ.
  3. Количественная интенсивность флуоресценции
    1. Настройте параметры измерения (Анализ → Набор измерений) и выберите «Площадь» и «Среднее серое значение».
    2. Измеряйте каждое изображение (анализируйте → измеряйте).
    3. Измерьте фоновую флуоресценцию из соседней ненейронной области в том же изображении и вычтите её из измерения ROI нейрона DA. Вычислите фоновую корректированную интегрированную плотность как: скорректированный IntDen = IntDenROI − (площадьROI × средний фон).
    4. Вычислите коэффициент удержания флуоресценции для каждой личинки как IntDen (после обработки) / IntDen (предобработка).
    5. Нормализуйте коэффициенты удержания флуоресценции к среднему значению управления автомобиля с той же пластины. Рассчитайте среднее управление транспортным средством отдельно для каждой пластины перед сравнением группобработки 19.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа с высокой пропускной способностью выполните ту же количественную оценку с помощью CellProfiler (программного обеспечения для анализа изображений) с автоматизированным обнаружениемROI 20.
  4. Проведите парный статистический анализ
    1. Для сравнения между одной группой лечения и одной контрольной группой проводите непарный двухсторонний t-тест Уэлча, который не предполагает равную дисперсию между группами.
    2. Используйте этот тест, когда дисперсия различается между группами.
  5. Проведение многогруппового статистического анализа
    1. Проведите односторонний ANOVA для экспериментов с участием нескольких групп лечения.
    2. Примените пост-хок тест Даннетта для сравнения каждой группы лечения с контрольной группой с помощью GraphPad Prism или аналогичного статистического программного обеспечения.
  6. Отчёт по статистическим результатам
    1. Установим порог значимости на уровне α = 0,05.
    2. Сообщайте точные p-значения, а не категориальные пороги.
    3. Представлять данные как среднее ± стандартную ошибку среднего значения (SEM) с отдельными точками данных, наложенных в виде диаграмм рассеяния с помощью GraphPad Prism или аналогичного программного обеспечения для графиков.
    4. Сообщите размер выборки (n), статистический тест, статистику теста, степени свободы и точное p-значение в легендах рисунков. Для больших наборов данных включайте полные статистические результаты в дополнительную таблицу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для скрининговых тестов вычислите Z-фактор для каждой пластины как Z = 1 − [3(σp + σn)/|μp − μn|], где σp и μp — стандартное отклонение и среднее отклонение группы управления транспортным средством, а σn и μn — стандартное отклонение и среднее значение контрольной группы только для MTZ. Z-фактор > 0,5 считается приемлемым для скрининга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Терапия MTZ приводит к дозозависимой потере дофаминергических нейронов и нарушению локомоторных движений

Для определения оптимальных параметров для абляции нейронов DA, опосредованной MTZ, интенсивность флуоресценции, используемая как показатель выживаемости нейронов DA, а также локомоторное расстояние были оценены при концентрациях МТЗ 3, 4,5 и 9 мМ после 24-часового лечения. Каждая группа лечения состояла из n = 10 отдельных Tg(th:Gal4; личи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол предлагает масштабируемый in vivo конвейер для количественной оценки потери нейронов ДА и скрининга нейропротекторных соединений с использованием химогенетической системы NTR–MTZ у трансгенных данио-рерио. Стандартизированный рабочий процесс на основе пластин был специально разработан для исследовательских команд студентов, где текучка кадров операторов высока, а опыт исследователей варьируется в зависимости от академического срока. Каждый этап рабочего процесса был структу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о финансовых конфликтах интересов.

Благодарности

Мы благодарим доктора Су Го (Калифорнийский университет, Сан-Франциско) за предоставление трансгенных данио-рерио, а также доктора Дэсеока Ома, доктора Майкла Парсонса и Эдди Халло (Калифорнийский университет, Ирвайн) за предоставление эмбрионов дикого типа и рекомендации по содержанию данио-рерио-рерио. Мы также благодарим сотрудников Центра молекулярных инноваций Роберта А. Маха и здания Falling Leaves Innovation Building (Калифорнийский университет, Ирвайн) за предоставление инфраструктуры для водного комплекса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Adult zebrafish diet, 0.5 mm pelletsZeiglerAH271Используется для кормления взрослых даний во время рутинного содержания
Агароза, низкая точка плавления (LMA)Sigma-AldrichA9414-10GИспользуется для встраивания личинок в колодцы для стабильного позиционирования во время визуализации
Алюминиевая фольгаULINES-20197Используется для защиты светочувствительных реагентов, таких как MTZ, во время приготовления и инкубации
CellProfilerBroad InstituteRRID: SCR_007358Используется для необязательного автоматизированного анализа флуоресцентных изображений
Коническая пробирка, 15 млCorning352097Используется для приготовления реагентов и работы с образцами
Коническая пробирка, 50 млCorning352070Используется для приготовления реагентов и хранения растворов
Размножительные емкости (1,0 л)AquaneeringZHCT100Используется для контролируемого разведения даний и сбора эмбрионов
Danio rerio (AB wild type)——Не-трансгенная контрольная линия, используемая для проверки специфичности эффектов, зависящих от нитроредуктазы
Danio rerio (Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry))——Трансгенная линия даний, экспрессирующая нитроредуктазу-mCherry в допаминергических нейронах для целевой хемогенетической абляции
Диметилсульфоксид (DMSO), безводный (≥99,9%)Sigma-Aldrich472301-500MLРастворитель для PTU, MTZ и веществ для скрининга
EthoVision XTNoldusRRID: SCR_000441Программное обеспечение для отслеживания поведения, используемое для количественной оценки локомоции личинок
Fiji (ImageJ)NIHRRID: SCR_003070Программное обеспечение для анализа изображений, используемое для количественной оценки флуоресценции
Пинцет с тонким концом или зонд 0,25 ммWorld Precision InstrumentsWPI0118Используется для ориентации личинок во время встраивания в агарозу
Флуоресцентный микроскопZeiss11845460Используется для визуализации допаминергических нейронов через флуоресценцию mCherry
Gemma Micro 150 ZF (питающий корм для молодых даний, 100–200 μм)Skretting10818945Используется для кормления молодых даний
Gemma Micro 75 ZF (питающий корм для личинок, 50–100 μм)Skretting10818935Используется для кормления личинок даний
GraphPad PrismGraphPadRRID: SCR_002798Статистическое программное обеспечение, используемое для анализа данных и построения графиков
Термоблок (способность работать при 42°C и 70°C)Thermo Fisher88870001Используется для расплавления и поддержания агарозы при контролируемых температурах
Высокоразрешающая камера (сверху, совместима)Basler88-327Используется для записи локомоторной активности личинок
Соляная кислота (HCl), 0,1 МFisher ScientificSA48-500Используется для корректировки pH при приготовлении трикаина
Инкубатор (28,5°C, 14 ч света: 10 ч темноты)MilliporeZ763314Поддерживает контролируемые условия окружающей среды для развития даний
Морская соль Instant OceanInstant OceanSS15-10Используется для приготовления синей икровой воды (BEW)
Лист для рассеивания света (или эквивалент)Edmund Optics27-103Используется для обеспечения равномерного освещения и минимизации отражения при записи поведения
Световой блокLightcraftLC2004LEDОбеспечивает нижнее освещение во время отслеживания локомоции
Метронидазол (MTZ)Sigma-AldrichM3761-100GИспользуется для хемогенетической абляции допаминергических нейронов
Метиленовый синий, 1% водный растворSigma-AldrichM9140Добавляется в BEW для предотвращения роста микроорганизмов в эмбрионах
Микроцентрифугные пробирки, 1,5 млEppendorf22363204Используется для разделки реагентов и хранения
Микропипетка, P200GilsonFP10005SИспользуется для работы с личинками и приготовления растворов
Чашки Петри, 100 ммCorningCLS430167Используется для сбора и инкубации эмбрионов
Наконечники для пипеточек, 200 μлRAININ30389188Используется с микропипетками для работы с жидкостями и переноса личинок
Хлорид натрия (NaCl), ≥99,0%Sigma-AldrichS9888-500GИспользуется для приготовления буферов и вод

Ссылки

  1. Haynes, E. M., Ulland, T. K., Eliceiri, K. W. A model of discovery: the role of imaging established and emerging non-mammalian models in neuroscience. Front Mol Neurosci. 15, 867010 (2022).
  2. Yang, W., Chen, X., Li, S., Li, X. J. Genetically modified large animal models for investigating neurodegenerative diseases. Cell Biosci. 11 (1), 218 (2021).
  3. Dodiya, R., et al. Zebrafish-based Parkinson’s disease models: unveiling genetic mechanisms and therapeutic pathways. CNS Neurol Disord Drug Targets. 24 (12), 900-920 (2025).
  4. Wasel, O., Freeman, J. L. Chemical and genetic zebrafish models to define mechanisms of and treatments for dopaminergic neurodegeneration. Int J Mol Sci. 21 (17), (2020).
  5. Kozol, R. A., et al. Function over form: modeling groups of inherited neurological conditions in zebrafish. Front Mol Neurosci. 9, 55 (2016).
  6. Jang, H., Kim, S. H., Koh, Y., Yoon, K. J. Engineering brain organoids: toward mature neural circuitry with an intact cytoarchitecture. Int J Stem Cells. 15 (1), 41-59 (2022).
  7. Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. J Pharm Bioallied Sci. 6 (1), 2-9 (2014).
  8. Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
  9. Hasani, H., et al. Whole-brain imaging of freely-moving zebrafish. Front Neurosci. 17, 1127574 (2023).
  10. Mattern, K., von Trotha, J. W., Erfle, P., Köster, R. W., Dietzel, A. NeuroExaminer: an all-glass microfluidic device for whole-brain in vivo imaging in zebrafish. Commun Biol. 3 (1), 311 (2020).
  11. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy. Front Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  12. Noda, S., et al. Aging-related motor function and dopaminergic neuronal loss in C57BL/6 mice. Mol Brain. 13 (1), 46 (2020).
  13. Godoy, R., et al. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135 (2), 249-260 (2015).
  14. Schallert, T., Tillerson, J. L. Intervention strategies for degeneration of dopamine neurons in parkinsonism: optimizing behavioral assessment of outcome. Cent Nerv Syst Dis. , 131-151 (2000).
  15. Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  16. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
  17. Nipu, N., et al. Methylene blue at recommended concentrations alters metabolism in early zebrafish development. Commun Biol. 8 (1), 120 (2025).
  18. Ohnesorge, N., et al. Assessment of the effect of tricaine (MS-222)-induced anesthesia on brain-wide neuronal activity of zebrafish larvae. Front Neurosci. 18, 1456322 (2024).
  19. Schroeder, A. B., et al. The ImageJ ecosystem: open-source software for image visualization, processing, and analysis. Protein Sci. 30 (1), 234-249 (2021).
  20. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  21. Kim, G. H. J., et al. A zebrafish screen reveals renin-angiotensin system inhibitors as neuroprotective via mitochondrial restoration in dopamine neurons. eLife. 10, (2021).
  22. Kim, G. H. J., et al. In vivo dopamine neuron imaging-based small molecule screen identifies novel neuroprotective compounds and targets. Front Pharmacol. 13, 837756 (2022).
  23. Aponte, P. M., Gutierrez-Reinoso, M. A., Garcia-Herreros, M. Bridging the gap: animal models in next-generation reproductive technologies for male fertility preservation. Life (Basel). 14 (1), (2023).
  24. Fen, W., et al. A review for cell-based screening methods in drug discovery. Biophys Rep. 7 (6), 504-516 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Хемогенетическая абляцияобработка метронидазоломмодель болезни Паркинсоналокомоторная активностьскрининг лекарственных препаратовнейропротекторные соединения
Фенотипирование дофаминергической нейродегенерации in vivo у личинок данио-рерио, с помощью поведенческого анализа и высокосодержательной визуализации
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.