Механизмы формулы Цюй 3 для улучшения воспринимаемости эндометрия при СПКЯ: сочетание сетевой фармакологии и моделирования молекулярной динамики

Краткое содержание

Этот протокол направлен на изучение механизма, с помощью которого QUF3 улучшает восприимчивость эндометрия при СПКЯ с помощью сетевой фармакологии, стыковки и моделирования MD.

Аннотация

Нарушенная восприимчивость эндометрия является одной из основных причин бесплодия при синдроме поликистозных яичников (СПКЯ). Формула 3 Цюй (QUF3) — это китайская фитотерапия, клинически используемая для улучшения восприимчивости эндометрия у пациентов с СПКЯ. В этом исследовании использовались симуляции сетевой фармакологии, молекулярного стыкинга и молекулярной динамики (MD) для изучения основных механизмов. Активные компоненты QUF3 были выявлены с помощью базы данных TCMSP, а потенциальные цели, связанные с восприимчивостью эндометрия и СПКЯ, были получены из DrugBank и других ресурсов. С помощью Cytoscape были построены сеть взаимодействия соединений-мишень и белок-белковый взаимодействие (PPI) для выявления ключевых целей. Основные мишени подвергались анализу обогащения GO и KEGG. Для оценки взаимодействий связывания использовались молекулярное стыковка, моделирование MD, анализ основных компонентов (PCA), ландшафт свободной энергии (FEL) и динамическая матрица перекрестной корреляции (DCCM). Из 91 активного ингредиента и 294 потенциальных мишеней для лекарств было выявлено 60 мишеней, связанных с заболеваниями. Лютеолин и сесамин были одними из ключевых фармакодинамических компонентов. Были выявлены десять основных целей: AKT1, EGFR, TNF, TP53, IL6, BCL2, ESR1, IL1B, STAT3 и MMP9. Обогащение KEGG выявило 132 сигнальных путей, а анализ GO выявил 678 записей. Симуляции MD показали, что связывание между пятью верхними активными компонентами и их соответствующими целями было стабильным. PCA, FEL и DCCM дополнительно продемонстрировали высокую термодинамическую устойчивость и структурную жёсткость этих комплексов. В заключение, QUF3 улучшает восприимчивость эндометрия при СПКЯ через многокомпонентные, многоцелевые и многопутные взаимодействия. Это исследование предоставляет теоретическую основу с точки зрения вычислительного моделирования для разработки таргетных китайских фитотерапии для лечения бесплодия, связанного с СПКЯ, и может иметь положительные последствия для улучшения исходов беременности у женщин с СПКЯ в будущем.

Введение

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) — одно из самых распространённых эндокринных заболеваний у женщин¹. Основные характеристики включают хроническую персистированную овуляционную дисфункцию, клиническую или биохимическую гиперандрогенемию, а также морфологию поликистозных яичников, с клиническими проявлениями, такими как аменорея, бесплодие, гирсутизм, акне и ожирение. В последние годы достижения в индукции овуляции и вспомогательных репродуктивных технологий (АРТ) значительно повысили уровень беременности у пациенток с СПКЯ; Однако исходы беременности остаются хуже, чем у здоровых^{женщин 2,3}. Восприимчивость эндометрия является ключевым фактором, влияющим на результаты^{АРТ 4}. Восприимчивость эндометрия относится к способности эндометрия принимать эмбрион на определённой физиологической стадии, что играет решающую роль в имплантации эмбриона и его последующем^{развитии 5,6}. Патологические состояния, часто наблюдаемые при СПКЯ, такие как ожирение, инсулинорезистентность и хроническое воспаление, могут снижать восприимчивость эндометрия, затруднять имплантацию оплодотворённых яйцеклеток и развитие эмбрионов, а в конечном итоге приводить к бесплодию и^{выкидышу 7,8}. Тем не менее, регуляторные механизмы, лежащие в основе восприимчивости эндометрия при СПКЯ, остаются в значительной степени неясными, а сеть взаимодействия между различными факторами влияния пока не выяснена. Формула Цюй 3 (QUF3), китайская фитомедицинская формула, клинически используемая для улучшения восприимчивости эндометрия у пациентов с СПКЯ, поддерживается прочными классическими теориями традиционной китайской медицины (ТКМ) в гинекологии. Формула состоит из Paeoniae Radix Alba (Baishao), Rehmanniae Radix Praeparata (Shudihuang), Cuscutae Semen (Tusizi), Fructus Ligustri Lucidi (Nvzhenzi), Herba Taxilli (Sangjisheng), Radix Salviae (Danshen) и Cornus Officinalis Sieb. et Zucc. (Шаньчжуюй) в соотношении 2:4:3:4:3:2:2, полученное методом экстракции этанолового рефлюкса. QUF3 оказывает синергетический эффект множества трав, тонизируя почки, обогащая эссенцию, питая кровь и улучшая^{кровообращение 9}. Клиническая эффективность её в улучшении восприимчивости эндометрия у пациентов с СПКЯ была хорошо подтверждена, однако основные фармакологические механизмы остаются для дальнейшего изучения.

Сетевая фармакология — это аналитический подход, основанный на системной биологии, который строит многоуровневые сети «трава-компонент-таргет-болезнь» для целостного раскрытия эффектов лекарств на заболевания. В отличие от традиционной модели «один препарат — одна цель», сетевая фармакология может всесторонне отражать синергетические характеристики «многокомпонентных, многоцелевых и многопутных» действий формул ТКМ, что делает её особенно удобной для изучения сложных механизмов ТКМ. Симуляция молекулярной динамики (MD), напротив, представляет собой вычислительный метод, основанный на ньютоновской механике, который моделирует на атомном уровне конформационные изменения и динамическое поведение белок-лигандных комплексов со временем. По сравнению со статическим молекулярным стыковкой, MD-симуляция позволяет оценивать динамические параметры, такие как стабильность связывания, ландшафты свободной энергии и структурную жёсткость, обеспечивая более реалистичную оценку взаимодействий между молекулами лекарств и белками-мишенями. Сетевая фармакология подходит для глобального скрининга потенциальных мишень и путей формул ТКМ, тогда как моделирование MD может динамически оценивать стабильность связывания между ключевыми компонентами и белками-мишениями. Сочетание этих двух подходов позволяет более надёжно анализировать многокомпонентные, многоцелевые синергетические механизмы формул ТКМ. Исходя из этой логики, в исследовании был использован комбинированный подход к сетевой фармакологии и моделированию MD для систематического изучения потенциальных фармакологических механизмов, лежащих в основе улучшения восприимчивости эндометрия по QUF3 у пациентов с СПКЯ.

Этот комбинированный вычислительный рабочий процесс наиболее подходит для первоначального изучения многокомпонентных, многоцелевых механизмов китайских травяных формул или натуральных продуктов, особенно для сложных систем, в которых активные компоненты и мишени в значительной степени неизвестны. Пользователи должны обладать базовыми знаниями в биоинформатике, включая поиск в базах данных и сетевой анализ, а также уметь выполнять фундаментальные вычислительные биологические анализы, такие как молекулярное стыкование и молекулярно-динамические симуляции, с использованием обычных программных пакетов. Рекомендуется использовать вычислительную среду на базе Linux с объёмом не менее 16 ГБ оперативной памяти, а также доступ к соответствующим публичным базам данных, таким как Традиционная китайская медицинская система фармакологии баз данных и анализа (TCMSP), PubChem и UniProt. Всё программное обеспечение, используемое в этом рабочем процессе (например, Cytoscape, AutoDockTools, GROMACS), является открытым исходным кодом или бесплатным для академического использования, и читатели могут получить его из информации, предоставленной в Таблице материалов.

Протокол

Скрининг активных компонентов и потенциальных целей QUF3
Активные химические компоненты Baishao, Shudihuang, Tusizi, Nvzhenzi, Sangjishen, Danshen и Shanzhuyu в препарате QUF3 были выявлены с помощью TCMSP 1 апреля 2025^года. Активные ингредиенты предварительно отбирались на основе состояний пероральной биодоступности (OB) ≥30% и похожих на лекарства (DL) ≥ 0,18¹¹. Эти пороги были выбраны как стандартные эмпирические критерии для обеспечения достаточного всасывания и свойств, похожих на лекарственные средства. Каноническая последовательность SMILES каждого соединения была найдена в базе данных PubChem, и полученная последовательность использовалась для прогнозирования соединений в онлайн-базе Swiss Target Prediction, а затем собрана названия генов белков-мишень и идентификаторов UniProt из базы данных^UniProt 12,13,14. В качестве промежуточного контрольного пункта фиксировалось количество уникальных целей, полученных после дедупликации.

Определение целей действия для восприимчивости эндометрия при СПКЯ
Ключевые слова «синдром поликистозных яичников» и «восприимчивость эндометрия» использовались в поисковых запросах в базах данных Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), DrugBank, Therapeutic Target Database (TTD) и GeneCards для выявления потенциальных целей^{15, 16, 17, 18}. Для GeneCards сохранялись только цели с показателем релевантности >5; Для остальных баз данных были включены все полученные цели. После слияния и удаления дублирующихся записей количество уникальных мишеней, связанных с болезнью, фиксировалось как промежуточный результат.

Построение сетей компонентов и целей
Цели для пересечения были созданы путём ввода возможных целей для QUF3, СПКЯ и восприимчивости эндометрия в онлайн-инструмент диаграммы Венна. Эти пересечения рассматривались как ключевые цели, через которые QUF3 оказывает свою эффективность в улучшении восприимчивости эндометрия при СПКЯ. Впоследствии была создана сеть «трава-состав-цель» (H-C-T) путём сопоставления этих целей пересечения с активными данными о составляющих-целевых в QUF3 с помощью Cytoscape¹⁹. Сеть визуализировалась с помощью инструмента «Network Analyzer».

Структура сети взаимодействия белков и белков (ИПП)
Потенциальные целевые гены QUF3 для улучшения восприимчивости эндометрия при СПКЯ были представлены в качестве входных данных на платформу STRING²⁰. Вид был установлен как «Homo sapiens», а порог доверия — «средняя уверенность (0,4)», что дало файл TSV с данными взаимодействия белков и белков. Этот файл затем импортировался в программное обеспечение для анализа сети для создания и анализа сети^{PPI 21}. Значение узла в сети указывается значением «Степень»: более высокое значение Степени указывает на более значимый узел. Впоследствии основные активные ингредиенты были отсортированы по степени, а топ-10 основных целей выбраны на основе рейтинга степени.

Анализ генной онтологии (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов по обогащению путей генов (KEGG)
Анализы обогащения путей GO и KEGG были проведены с использованием базы данных DAVID для изучения биологических путей и механизмов, с помощью которых QUF3 улучшает восприимчивость эндометрия при^СПКЯ-22. Вид был установлен как «Homo sapiens», а порог значимости — на уровне P < 0,05. Анализ GO охватывал биологические процессы (BP), клеточный компонент (CC) и молекулярную функцию (MF⁾²³. Результаты были отсортированы по количеству обогащённых целей. Пути, связанные с человеческим метаболизмом и заболеваниями, были исключены, а для визуализации выбраны 20 лучших путей KEGG. Впоследствии с помощью программного обеспечения для анализа сети была построена многомерная сеть «компонент-болезнь-KEGG».

Анализ молекулярного стыковки
Для анализа молекулярного стыковки были выбраны топ-10 ключевых активных компонентов и 10 основных целей с помощью AutoDockTools и программного обеспечения^{PyMOL 24,25}. PDB-файлы ключевых целей были скачаны из базы данных белковой^{структуры 26}, а SDF-файлы основных активных компонентов — из химической базы^{данных 27}. Молекулы белка затем предварительно обработались с помощью программного обеспечения для молекулярного стыковки, включавшего обезсоление, гидрогенизацию и расчёт заряда. Полугибкая стыковка проводилась с использованием сетчатого бокса, покрывающего весь участок связывания белка. Процесс стыковки считался успешным, когда энергия связи была отрицательной, а отклонение корня по среднеквадрату (RMSD) верхней позы составляло ≤ 2,0 Å. После стыковки результаты по основным активным компонентам QUF3 с основными мишенями визуализировались с помощью программного обеспечения для молекулярной визуализации.

Симуляции молекулярной динамики (MD)
Симуляции комплекса белок–лиганд были проведены с помощью программного обеспечения GROMACS для изучения взаимодействия рецепторов и^{лигандов 28,29}. Силовое поле amber99sb-ildn и общее янтарное силовое поле (GAFF) использовались для генерации параметров и топологий белков и лигандов соответственно. Размер симуляционной коробки был установлен так, чтобы расстояние между каждым атомом белка и краем коробки превышало 1,0 нм. Коробка была заполнена явным растворителем с использованием простой модели точечного заряда (молекулы воды SPC216), а молекулы воды заменялись противоположниками Na⁺ и Cl⁻, чтобы сделать систему моделирования электрически нейтральной. Вся система была оптимизирована методом самого крутого спуска для снижения чрезмерных контактов и перекрытия атомов. Достаточное предварительное равновесие системы моделирования было достигнуто за счёт выполнения ансамблей NVT и NPT по 100 пс каждый при 300 K и 1 бар соответственно. Впоследствии была проведена симуляция MD 100 нс при периодических граничных условиях, при температуре (300 К) и давлении (1 бар) с помощью методов V-rescale и методов Парринелло-Рахмана,^{соответственно 30}. Ньютоновские уравнения движения решались с помощью интегратора с лягушачьим прыжком с временным шагом 2 fs. Дальние электростатические взаимодействия рассчитывались с использованием метода Particle Mesh Ewald (PME) с фурье-интервалом 0,16 нм, а все длины связей ограничивались методом LINCS. Программное обеспечение VMD использовалось для отображения, анализа и анимации^{траекторий 31}. Свободная энергия связывания каждого соединения рассчитывалась с помощью скрипта вычисления свободной энергии связывания.

Анализ основных компонентов (PCA), ландшафт свободной энергии (FEL) и анализ динамической перекрестной корреляции (DCCM)
PCA проводилась с использованием программного обеспечения для моделирования MD для анализа доминирующих конформационных движений комплексов, связанных с апо- и лигандами. Были получены ковариационные матрицы атомных флуктуаций Cα, из которых получены собственные векторы (коллективные движения) и собственные значения (величина движения)³². В ходе этого анализа были выявлены ключевые динамические области и структурная гибкость, связанные с связыванием лигандов. Молекулярные траектории проецировались на первые два основных компонента (PC1 и PC2) с помощью инструмента gmx anaeig, тем самым зафиксировав существенные^{движения 33}. Для вычислений PCA и FEL использовались только уравновешенные конечные 100 нс (RMSD-стабильная фаза). FEL был получен на основе данных PCA с использованием gmx sham для вычисления свободной энергии^{Гиббса 34}, что позволило выявить стабильные конформации и минимумы энергии, отражающие конформационное разнообразие и переходы состояний. Был проведён анализ динамической перекрестной корреляционной матрицы (DCCM) атомов Cα для оценки структурной динамики и взаимодействия между остатками^{движения 35}. Этот анализ выяснил стабильность, межмолекулярные взаимодействия и коллективные движения белок-лигандных комплексов. Коэффициент перекрестной корреляции Cij между остатками i и j был рассчитан следующим образом:

В формуле буквы i и j обозначают атомы Cα двух остатков. Когда значение Cij положительно и больше нуля; Два атома, движущиеся в одном направлении, считаются коррелированными в движении. Когда значение Cij меньше нуля, два атома, движущиеся в противоположных направлениях, считаются находящимися в антикоррелированном движении. Значение Cij равное нулю указывает на отсутствие связи между движениями двух атомов. Кроме того, значения Cij более 0,7 интерпретировались как сильно коррелированные (положительные) или сильно антикоррелированные (отрицательные) движения. Для подтверждения сходимости были изучены профили RMSD и Rg. Стабильные профили подтвердили, что последние 100 нс достаточно для анализа ДКМ. Эти паттерны движения показали, как связывание лигандов модулирует внутримолекулярную коммуникацию и перестановку доменов. Для обеспечения динамической стабильности и сходимости анализировали только последние 100 нс уравновешенных траекторий, а также визуализированы корреляционные карты для выделения областей с существенным динамическим взаимодействием.

Для лучшего объяснения энергии взаимодействия между белками и лигандами был использован скрипт расчёта свободной энергии связывания для расчёта энергии связи всех комплексов белок-лиганд в равновесии. В применении метода расчёта свободной энергии связи³⁶ общая энергия связи была разложена на четыре независимые части: электростатическое взаимодействие, взаимодействие ван дер Ваальса, полярное сольватирование и неполярное сольвационное взаимодействие. Термин неполярного сольватации обычно называют SASA.

Итоговая процедурная конечная точка выбора цели и пути
В конце рабочего процесса были выбраны окончательные валидированные цели и пути на основе следующих критериев: основные цели с верхними 10 значениями Degree в сети PPI и ключевые активные компоненты с верхними 10 значениями Degree в сети H-C-T. Для путей KEGG, после исключения тех, что связаны с метаболизмом человека и заболеваниями, топ-20 путей были ранжированы и отобраны по количеству обогащённых целей. Результаты моделирования MD были использованы для подтверждения стабильного связывания между верхними компонентами и основными целями. Эти шаги вместе определяли итоговый результат протокола.

Результаты

Скрининг активных компонентов и потенциальных целей QUF3
Используя OB ≥ 30% и DL ≥ 0,18 в качестве критериев скрининга, после поиска в базе данных TCMSP QUF3 выявил 126 химических компонентов. Среди них Paeoniae Radix Alba (Baishao) содержал 13 активных компонентов, Rehmanniae Radix Praeparata (Shudihuang) — 2, Cuscutae Semen (Tusizi) — 13, Fructus Ligustri Lucidi (Nvzhenzi) — 13, Herba Taxilli (Sangjisheng) — 2, Radix Salviae (Danshen) — 65, Cornus Officinalis Sieb. Et Zucc. (Шаньчжуюй) содержал 20 (...

Обсуждение

Появляется всё больше доказательств того, что эндометрий пациентов с СПКЯ демонстрирует нарушение функции, что может коррелировать с более высокими показателями неудачи имплантации и неблагоприятными исходами^{беременности 40}. Различия в эндометрии у женщин с СПКЯ в основном характеризуются снижением экспрессии пинопод, систем нуклеолярных каналов, эстрогеновых и прогестеронных рецепторов в период имплантации (WOI)⁴¹. Кроме того, экспрессии э...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (Version 2.3)	Lab of Systems Pharmacology	https://www.tcmsp-e.com/load_intro.php?id=43	База данных для скрининга активных компонентов
Swiss Target Prediction online database (2019 version)	Molecular Modelling Group, University of Lausanne & SIB Swiss Institute of Bioinformatics	http://www.swisstargetprediction.ch/	Онлайн база данных для предсказания целей
PubChem база данных	National Library of Medicine, NIH	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	Химическая база данных для получения SMILES/SDF соединений
UniProt база данных	NIH	https://www.uniprot.org/uniprotkb	База данных белков для UniProt ID и названий генов
Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)	Johns Hopkins University	https://www.omim.org/	База данных генетических заболеваний
DrugBank	University of Alberta	https://www.drugbank.ca/	База данных генетических заболеваний
Therapeutic Target Database (TTD)	Zhejiang University	https://ttd.idrblab.cn/	База данных генетических заболеваний
GeneCards (Version 5.26)	Weizmann Institute of Science, LifeMap Sciences	https://www.genecards.org/	База данных генетических заболеваний (значение релевантности >5)
Venny visualization platform (Version 2.1.0)	Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC)	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/	Онлайн инструмент для построения венн-диаграмм для визуализации пересечений целей
Cytoscape (Version 3.10.3)	National Resource for Network Biology, NHGRI	https://cytoscape.org/	Сетевое анализирующее и визуализирующее программное обеспечение для H-C-T, PPI и путевых сетей
STRING база данных (Version 12.0)	STRING Consortium	https://string-db.org/	База данных белок-белковых взаимодействий для построения сетей PPI
DAVID база данных (Version v2025-2)	U.S. Department of Health & Human Services, NIH	https://davidbioinformatics.nih.gov/	База данных для анализа обогащения генов для GO и KEGG
AutoDockTools (Version 1.5.7)	The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/	Программное обеспечение для молекулярного докингирования для предварительной обработки и расчетов
PyMOL software (Version 3.0.3)	Schrödinger	https://pymol.org/	Программное обеспечение для визуализации молекул для визуализации докингирования
Protein Data Bank (PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	База данных структур белков для загрузки файлов PDB целей
GROMACS (Version 2023.2)	GROMACS development team	https://www.gromacs.org/	Программное обеспечение для молекулярной динамики
VMD (Version 1.9.3)	University of Illinois	https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/	Программное обеспечение для визуализации молекул и анализа траекторий
gmx_MMPBSA	Open-source (GitHub)	https://github.com/Valdes-Tresanco-MS/gmx_MMPBSA	Инструмент для расчета свободной энергии связывания из траекторий МД
Science Data Bank	Chinese Academy of Sciences, Computer Network Information Center	https://www.scidb.cn/	Репозиторий научных данных для доступности и депонирования данных