Анализ колониообразующих единиц, адаптированный для костного мозга, полученного пациентом, и периферических мононуклеарных клеток крови

Краткое содержание

Этот протокол описывает процедуру индуцирования дифференцировки гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток человека, полученных из мононуклеарных клеток костного мозга пациента и периферических кровяных клеток. Анализ использует полутвердую культурную среду, поддерживающую приверженность линии эритроида и миелоидов, а также включает стандартизированные метрики для воспроизводимой классификации колоний для доклинической характеристики лекарств.

Аннотация

Анализ колониообразующего блока (CFU) является основополагающим методом изучения гематологических заболеваний, включая миелодиспластические синдромы (МДС) и острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). В этом анализе используются полутвёрдые среды, дополненные определёнными комбинациями цитокинов для поддержки трёхмерного роста и линейно-специфической дифференцировки эритроидных и миелоидных прогениторных клеток. Однако образцы периферической крови и костного мозга, полученные пациентами, представляют собой технические трудности из-за снижения жизнеспособности, повышенной чувствительности к обращению и вариабельности роста колонии. Кроме того, существующие рекомендации по идентификации и подсчету колоний демонстрируют значительную вариативность в определении размера колоний и типов родословных, что ограничивает воспроизводимость между исследованиями. Описанный здесь протокол оптимизирован для роста и дифференцировки гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток, выделенных из образцов пациентов MDS и AML. Протокол делает акцент на бережном обращении с клетками, стерильной обработке образцов пациентов, оптимизированных условиях культуры и длительности роста, адаптированной к клеткам, полученным от пациента. Этот протокол предоставляет практическую основу для анализов CFU с использованием образцов, полученных пациентами, и устанавливает стандартную метрику для последовательного подсчёта и анализа колоний в исследованиях гематологических злокачественных опухолей.

Введение

Гемопоэз — это строго регулируемый процесс, при котором гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), находящиеся в нишах костного мозга, дают начало всем зрелым линиям кровяных клеток. Посредством иерархической серии дифференциационных событий HSC генерируют мультипотентных предшественников, которые постепенно связываются с эритроидной, миелоидной и лимфоидной линиями, прежде чем пройти терминальное созревание в функциональные циркулирующие кровяные клетки. Этот процесс регулируется координированной сигнальной информацией в микросреде костного мозга и внутренними транскрипционными и эпигенетическими регуляторными механизмами. Нарушения этих регуляторных путей, особенно из-за накопления генетических или соматических мутаций в HSC, могут нарушить нормальную дифференцировку и привести к клональному расширению аномальных предшественников. Такие изменения в конечном итоге могут привести к гематологическим заболеваниям, характеризующимся неэффективным гемопоэзом и цитопениями, включая миелодиспластические синдромы (МДС) и острый миелоидный лейкоз (ОМЛ⁾1,2,3,4,5.

Анализ колониообразующих единиц (CFU) — это хорошо зарекомендовавшая себя методика in vitro для оценки дифференциационного потенциала гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC). Изначально разработанный как краткосрочный анализ для измерения пролиферативной и дифференциационной способности гемопоэтических^{предшественников 6,7,8}, анализ CFU с тех пор стал широко используемым инструментом как в клинической, так и в экспериментальной^{гематологии 9}. В доклинических лабораторных условиях анализ часто используется для оценки влияния генетических возмущений или кандидатов на гемопоэтическую дифференциацию. В контексте исследований МДС и ОМЛ анализы КФУ предоставляют функциональный обзор для понимания того, как молекулярные и генетические изменения влияют на способность дифференцировки костного мозга или периферических кровяных клеток, полученных пациентами.

Анализ CFU включает культивирование HSPC в полутвёрдой среде на основе метилцеллюлозы, дополненной определёнными факторами роста, поддерживающими специфическое расширение и дифференциацию по линии. В таких условиях клетки-прародители размножаются и дают начало отдельным колониям, которые можно морфологически классифицировать по родословной идентичности. В этом протоколе используется коммерчески доступная полутвердая среда на основе метилцеллюлозы, оптимизированная для дифференцировки эритроида и миелоидов. Среда содержит комбинацию цитокинов, включая интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-6 (IL-6), фактор стволовых клеток (SCF), эритропоэтин (EPO), колонистимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF) и гранулоцитно-макрофаговый колониостимулирующий фактор (GM-CSF). Вместе эти факторы способствуют росту эритроидных предшественников, таких как колониообразующий единичный эритроид (CFU-E) и взрывообразующий единичный эритроид (BFU-E), миелоидные гранулоцитно-макрофаговые прогениторы (CFU-GM), а также мультипотентные прогениторы, такие как гранулоциты, эритроциты, моноциты, мегакариоциты (CFU-GEMM)^10,11.

Несмотря на широкую полезность, упомянутая выше полутвёрдая среда ограничена в своей дифференциационной способности, так как недостаточно поддерживает дифференцировку мегакариоцитов и тромбоцитов. Для этих применений более подходящи специализированные формулы, содержащие факторы роста тромбоцитов; однако они выходят за рамки установленного протокола. В целом, благодаря тщательному подбору формулировки среды в сочетании с морфологической оценкой и дальнейшим анализами, такими как проточная цитометрия, исследователи могут эффективно оценить чувствительность лекарств с помощью анализа связности по линии и потенциала дифференцировки¹².

В данном исследовании анализ CFU используется для изучения терапевтического потенциала комбинированных терапий для лечения рецидивных/рефрактерных высокорисковых МДС. Пириметамин — это клинически одобренный антифолат, используемый для лечения токсоплазмоза и паразитарной малярии, и недавно был изучен как противораковое^{средство} 13,14,15. Недавние исследования показали, что лечение пириметамином может действовать через ингибирование ключевых путей, регулирующих синтез de novo^{пиримидина 16}. В данном протоколе анализы КФУ используются для изучения клинической эффективности пириметамина как терапии с одним препаратом, так и в комбинированной терапии с Венетоклаксом, который в настоящее время является передовой методом терапии для лечения МДС и^{ОМЛ 17,18}.

Несмотря на широкое применение, анализ CFU имеет ряд технических ограничений. Идентификация и классификация колоний во многом опираются на морфологические критерии, которые могут вводить изменчивость между наблюдателями и между исследовательскими^{центрами 6, 19, 20, 21}. Кроме того, образцы, полученные пациентами с МДС или ОМЛ, часто демонстрируют сниженную жизнеспособность клеток, повышенную хрупкость и гетерогенность, что может усложнять формирование колоний и дальнейшие^{анализы 9}. Подготовка колоний для дальнейшей характеристики, включая проточную цитометрию, может требовать тщательного обращения с целью сохранения целостности клетки. Отсутствие стандартизированных процедур идентификации, подсчёта и дальнейшего анализа колоний дополнительно способствует вариативности между исследованиями. Эти технические соображения подчёркивают необходимость стандартизированных процедур, оптимизированных специально для гемопоэтических образцов, полученных пациентами.

Этот протокол определяет оптимизированный рабочий процесс проведения анализов КФУ с использованием мононуклеарных клеток, полученных из первичных образцов костного мозга или периферических образцов крови у пациентов с гематологическими злокачественными опухолиями. Подход сосредоточен на практических стратегиях обращения с чувствительными клетками, полученными от пациентов, установлении надежных условий культуры и внедрении последовательных критериев идентификации и количественной оценки колоний. Предоставляя подробные методологические рекомендации и делая акцент на воспроизводимых методах анализа, этот протокол направлен на более надёжную оценку дифференцировки гемопоэтической дифференцировки и терапевтического ответа в доклинических исследованиях МДС и ОМЛ.

Протокол

В этом исследовании используются деидентифицированные человеческие биообразцы, полученные из биобанка по протоколу, утверждённому Институциональным советом по обзору, «Молекулярная биология доброкачественных и злокачественных гематологических заболеваний» (IRB Protocol #200536) в Медицинском колледже Альберта Эйнштейна/Медицинском центре Монтефиоре. Все процедуры проводились в соответствии с этическими руководящими принципами учреждения. Все реагенты и оборудование перечислены в таблице материалов.

1. Подготовка костного мозга, полученного пациентом или периферических мононуклеарных клеток крови.

ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно общим рекомендациям по обращению с образцами пациентов, рекомендуется носить лабораторный халат в полный размер и одноразовые перчатки, устойчивые к разрывам, а также работать под капюшоном для лабораторных клеточных культур для защиты от воздействия патогенов, передающихся через кровь. Все наконечники пипеток и серологические пипетки, контактирующие с клетками пациента, должны быть замачены в растворе отбеливателя с 10% не менее 30 минут до утилизации в биологические отходы.

1. Экспериментальная подготовка
   1. Прогрейте IMDM-среду, сыворотку плода (FBS) и пенициллин-стрептомицин (Pen-strep) до 37 °C не менее 30 минут.
   2. Оттаять полутвёрдую среду при 4 °C за ночь. В день подачи прогрейте бутылку до комнатной температуры (RT) не менее 30 минут.
   3. Стерилизуйте вытяжку с помощью ультрафиолета в течение 15 минут, затем опрыскайте поверхности вышкапа, пипетки и стойки для трубок 70% этанолом (EtOH).
   4. Подготовьте стакан для отходов, содержащий 10% раствор отбеливателя, достаточно большой для сбора загрязнённых наконечников пипеток и серологических пипеток.
   5. Получить костный мозг или периферические мононуклеарные клетки крови, выделенные методами центрифугирования с градиентом плотности. Клетки могут использоваться в тот же день сбора или из замороженных биобанковских образцов.
2. Если образцы заморожены, их быстро разморозить в водяной бане при температуре 37 °C, пока большая часть льда не растает и не останется лишь небольшой ледяной кристалл. Сразу же положите образцы на лёд после размораживания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы пациентов очень чувствительны к оттаиванию. Важно размораживать образцы как можно быстрее и по партиям, чтобы минимизировать гибель клеток.
3. Суспензировать клетки в 5 мл тёплой полной среды роста (IMDM-среды с добавлением 4% FBS и 1% Pen-Strep).
4. Определите концентрацию и жизнеспособность клетки с помощью красителя AO/PI и автоматического счётчика клеток.
5. Центрифугуйте клетки при температуре 350 г в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки. Отбрось супернатант.
6. Суспензировать клетки в стерильном физиологическом растворе Dulbecco с фосфатом (DPBS) объемом 5 мл. Повторяйте центрифугирование к гранулированным клеткам и отбрасывайте супернатант.
7. Подвесить клетки в полной среде роста до концентрации 2 миллионов живых клеток/мл. Подготовьте достаточно ячеек для 100 тысяч ячеек на колодце пластины с 6 колодцами.

2. Подготовка и лечение лекарств.

ПРИМЕЧАНИЕ: Пириметамин получается в виде лиофилизированного порошка и восстанавливается внутри лаборатории в диметилсульфоксиде (DMSO) при концентрации 100 мМ; аликвоты хранятся при температуре −80 °C. Венетоклакс покупается предварительно растворённым в DMSO при концентрации 10 мМ и хранится при -20 °C. В этом эксперименте венетоклакс и пириметамин вводятся в виде одной дозы через свободное поглощение параллельно с лечением DMSO с контролем транспортных средств.
ВНИМАНИЕ: Пириметамин, венетоклакс и ДМСО являются биологически опасными агентами. Обращайтесь только под капотом, используя средства индивидуальной защиты, и используйте с особой осторожностью.

1. В день накладки разморозьте препарат на льду, вихрь и вращайтесь на максимальной скорости на настольной мини-центрифуге в течение 30 секунд.
2. Вихрь и энергично смешайте бутылку полутвердой среды, пока все компоненты не станут однородными. Оставьте в капюшоне без помех при комнатной температуре на 30 минут, чтобы пузырьки поднялись на поверхность.
3. Приготовьте 3 мл аликвотов полутвердой среды в стерильных конических трубках объёмом 15 мл. Дайте трубкам оставаться нетронутыми 30 минут, чтобы пузырьки могли подняться на поверхность. Аликвоты из дополнительной полутвердой среды можно повторно заморозить и хранить при -20 °C для последующего использования.
4. Добавьте не более 10 мкл объёма лекарства в полутвердую среду. Для этого эксперимента концентрации венетоклакса и пириметаминов корректируются с учётом эмпирически определённых синергетических условий. В группу управления транспортным средством добавляют эквивалентные объёмы DMSO. Подготовьте дублирующие аликвоты по 3 мл для каждого состояния.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно держать объём добавленного препарата незначительным, чтобы он не повлиял на конечную концентрацию препарата в полутвердой среде.
5. Медиа Vortex в 4–5 коротких всплесках для полного включения препарата в медиа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите смесь клеток на вихре длительное время, так как это может привести к гибели клеток.
6. Добавьте 100 мкл клеток или эквивалентный объём 200 000 клеток к 3 мл аликвот полутвердых сред. Смешивание вихрей короткими всплесками до полной интеграции или гомогенизации.
7. Прикрепите иглу с тупым концом 16 G к шприцу объемом 3 мл и опустите иглу и шприц в клеточную смесь. Оставьте их спокойно на 30 минут, чтобы пузырьки поднялись на поверхность.

3. Покрытие клеточной суспензии, обработанной лекарственно.

1. Используя погружённую иглу и шприц, забирайте смесь клеток и лекарств, стараясь не вдыхать пузырьки воздуха. Подождите 3–5 минут, затем возьмите оставшуюся смесь, которая накопилась по бокам конической трубки объёмом 15 мл.
2. В стерильной пластине с 6 ядрами добавляйте смесь по капле, чередуя крупные капли между двумя колодцами внешней колонны пластины. Размазывайте смесь, мягко наклоняя пластину круговыми движениями, чтобы равномерно покрыть дно колодцев. Эти две скважины образуют технические копии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если пузырьки образуются или случайно добавляются в колодцы, используйте наконечник фильтра с пипеткой, чтобы аккуратно лопнуть или переместить пузырьки к краю пластины. Любые крупные пузырьки, оставшиеся в пластине, могут повлиять на рост колоний.
3. Добавьте колониальную пробиральную смесь только на внешние колонны пластины с 6 колодцями. В центральную колонну добавьте 5 мл стерильной воды в каждую колодцу. Добавление воды в колодцы обеспечит наличие достаточной влаги, чтобы полутвёрдый материал не высыхал.
4. Инкубировать пластину в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2. Следите за ростом клеток и уровнем воды два раза в неделю. Клетки должны образовывать колонии, видимые глазом, примерно через 7 дней после нанесения пластин, а пластинки должны достигать 75–80% слияния примерно через 14–21 день после нанесения.

4. Визуализация и подсчёт колоний

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает параметры, проверенные для использования в системе визуализации EVOS M7000. Эти настройки, возможно, потребуется оптимизировать или адаптировать для совместимости с другими системами изображения пластин.

1. Снимите защитную крышку светового фильтра с платформы микроскопа. Включите микроскоп и откройте соответствующее программное обеспечение.
2. Вставьте световой диффузор в верхнюю линзу микроскопа.
3. Вставьте позицию пластины на платформу так, чтобы колодец A1 находился в верхнем левом углу.
4. В программном обеспечении для визуализации введите следующие настройки фокуса:
   1. Выберите судно для изображения. В этом протоколе используется пластина с 6 ямецами.
   2. Установите цель на 4X.
   3. Выберите источник света как Trans или переключите микроскоп в режим яркого поля.
   4. Включите свет микроскопа и вручную регулируйте интенсивность света с помощью грубого ползунка. Для инструмента, используемого в этом протоколе, оптимальный диапазон для колоний визуализации составляет около 0,03.
   5. Если на приборе есть функция автофокуса, используйте её для регулировки фокуса. При необходимости дополнительно отрегулируйте фокус с помощью ручных настроек тонкого фокуса.
5. Введите следующие автоматические настройки захвата изображений:
   1. Выберите всю площадь скважины для изображения в каждой скважине.
   2. Выберите автоматический захват изображения, начиная с центра скважины и спирально направляясь к краям скважины.
   3. Выберите настройки автофокуса так, чтобы инструмент перефокусировался в каждой яме.
   4. Выберите для того, чтобы raw изображения в каждой яме были тайлированы/объединены вместе.
   5. Выберите горизонтальное и вертикальное перевёртывание изображений.
   6. Выберите настройки сохранения данных, чтобы собрать «тайлированное изображение» и «объединённое изображение».
   7. Запустите автоматическое сканирование номерных знаков. Инструмент, используемый в этом протоколе, будет работать со скоростью 1,5 мин/скважину.
   8. Снимите пластину, наместите защитную крышку фильтра на платформу микроскопа, выключите микроскоп и закройте программное обеспечение.
   9. После визуализации подсчитайте общее количество отдельных колоний, а также миелоидные и эритроидные подтипы в каждой яме вручную, используя плиточные изображения объединённой ямы.
6. Определим колонии в соответствии со следующей морфологической характеристикой:
   1. Рассмотрим, что отдельная колония или кластер колоний отличается, если она находится достаточно далеко от другой популяции клеток, на расстояние, равное своей собственной длине. Популяции в пределах этого предела расстояния объединяются в один колониальный подсчёт.
   2. Убедитесь, что эритроидные колонии были глубоко пигментированы и имеют тёмно-красный цвет. Эти колонии выглядят как густо растущие одиночные популяции или скопления с чётко очерченными краями. Меньшие эритроидные колонии, состоящие из медленнорастущих незрелых клеточных популяций, классифицируются как CFU-E. Крупные колонии с более зрелыми популяциями классифицируются как BFU-E.
   3. Проверьте, содержат ли миелоидные колонии клетки, которые кажутся более прозрачными и светлее по цвету. Миелоидные колонии более рассредоточены и не содержат чётко выраженных краёв. Миелоидные колонии чаще растут как отдельные популяции, а не группы, хотя иногда можно увидеть скопления. В обоих случаях миелоидные колонии классифицируются как CFU-GM.
   4. Классифицируйте смешанные колонии, содержащие как эритроидные, так и миелоидные подтипы, как CFU-GEMM.

5. Сбор и заморозка клеток для дальнейшего анализа с помощью потоковой цитометрии

1. Выполните следующие шаги перед началом:
   1. a. Подготовьте и нагрейте буфер сортировки клеток, активируемый флуоресценцией (FACS буфер, состоящий из DPBS/4% FBS) и замораживающую среду (FBS/10% DMSO) в водяной бане при температуре 37 °C не менее 30 минут.
2. Добавьте 5 мл нагретого буфера FACS на поверхность каждой скважины. Инкубировать пластины не менее 30 минут в инкубаторе при температуре 37 °C, чтобы растворить полутвёрдую среду.
3. Тщательно повторно суспензировать клетки с помощью пипетки объемом 5 мл и перенести в стерильную коническую трубку объёмом 50 мл.
4. Используя 5 мл нагретого буфера FACS, промыйте каждую колодцу 3 раза и переведите весь объём в коническую трубку объёмом 50 мл.
5. Хорошо ресуспензировать клетки, вихря в 4–5 коротких импульсах, затем центрифугировать при 400 x g в течение 10 минут при RT в гранулированные клетки. Если гранула не видна после центрифугирования, клетки остаются взвешенными в полутвердой среде. Без аспирации добавьте в трубку дополнительные 10–15 мл DPBS, чтобы дополнительно разбавить полутвёрдую среду и хорошо восстановиться. При необходимости инкубировать при 37 °C в течение 10–15 минут для полного растворения среды, затем снова вводить гранулированные клетки.
6. Аспирируйте супернатант и ресуспензируйте клетки в буфере FACS 10 мл. Центрифугу при 400 г в течение 10 минут на RT на гранулированные клетки.
7. Суспензировать клетки в замерзших средах и пропустить 3 миллиона клеток на криовиал. Заморозьте флаконы в контейнере с контролируемой скоростью замораживания при -80 °C в течение 24 часов, чтобы достичь скорости охлаждения 1 °C в минуту.
8. Как можно скорее перенесите криовиалы в жидкий азот.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, поддерживаемые при -20 °C длительное время, имеют сниженную жизнеспособность. Важно перемещать клетки в жидкий азот для длительного хранения.

Результаты

Рисунок 1 иллюстрирует конвейер анализа колоний от выделения образцов пациентов через анализ количества колоний и морфологии колоний. На рисунке 2 показаны ключевые настройки для изображения колоний на ярком микроскопе. На рисунках 3 и 4 показаны репрезентативные изображения формирования колоний из одного образца, полученного пациентом, через 13...

Обсуждение

Описанный здесь протокол описывает оптимизированный рабочий процесс проведения анализов КФУ с использованием первичных образцов крови из костного мозга и периферии пациентов с особым вниманием к поддержанию жизнеспособности клеток и обеспечению воспроизводимого роста колоний. Несколько этапов протокола критически важны для обеспечения надёжного формирования колоний при работе с образцами, полученными пациентами. Быстрое оттаивание криоконсервированных мононуклеарных клеток с последующим ...

Материалы

```html

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Blunt-End 16 G needles	STEMCELL Technologies	28110	для дозирования и нанесения MethoCult среды
Cellometer Auto 2000	Nexelcom Bioscience	26407	счетчик клеток
CHT4 Counting Chambers (cell counter slides)	Revvity	CHT4-SD100-002	слайды для счетчика клеток
Диметиловый сульфоксид	Fisher Bioreagents	BP231-100	используется для растворения лекарств и среды для заморозки клеток
Фосфатно-буферный раствор Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537	для культуры клеток
Этанол 200 proof	Decon Laboratories, Inc.	2701	для стерилизации поверхностей культуры клеток
EVOS M7000 imaging system	ThermoFisher Scientific	AMF7000	для визуализации колоний и блюд
Плоское бычачье сыворотка	BenchMark	100-106	добавка к среде для культуры клеток и их заморозки
IMDM Modified Culture media	Cytiva	SH30228.01	обогащенная культуральная среда, пригодная для обработки образцов пациентов
LuerLok Tip 3 mL Syringes	BD	309657	для дозирования и нанесения MethoCult среды
MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	04435	метилцеллюлозно-основная полужидкая среда для анализа колоний
Многокамерная 6-лунная пластинка	FALCON	353046	для нанесения анализа колоний
Nikon Eclipse TS2FL Inverted Trinocular Phase Contrast Fluorescence Microscope	Coastal Microscopes	51623	Для визуализации и характеристики морфологии колоний
Pen Strep	Gibco	15140-122	антисептик для культуры клеток
пириметамид	Sigma-Aldrich	46706	утвержденное FDA антифолат
UltraPure Distilled water	Invitrogen	10977-015	для нанесения анализа колоний
венетоклакс	Selleck Chemical LLC	50-136-6419	утвержденная FDA химиотерапия
ViaStain AOPI Staining Solution	Revvity	CS2-0106	краситель жизнеспособности для подсчета живых клеток

```